2024屆高考生物一輪總復(fù)習(xí)第十四單元基因工程及生物技術(shù)的安全性與倫理問題第2講重點研究“基因工程操作中限制酶的選擇和PCR技術(shù)”教師用書

PAGE第2講重點研究“基因工程操作中限制酶的選擇和PCR技術(shù)”基因工程操作中目的基因的獲取和基因表達載體的構(gòu)建都離不開限制性內(nèi)切核酸酶，只有選取合適的限制酶才能準確切取目的基因，因此限制酶的選取是基因工程操作的重點也是難點，近年來較難的高考試題大都圍繞限制酶的選取進行考查。PCR技術(shù)既可以用于獲取目的基因，又可以用于目的基因的檢測與鑒定，是基因工程中重要技術(shù)之一，其應(yīng)用較強，因此對PCR技術(shù)的考查也成為命題的熱點。1．(2021·全國乙卷)用DNA重組技術(shù)可以賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人類需要的生物產(chǎn)品。在此過程中需要使用多種工具酶，其中4種限制性內(nèi)切核酸酶的切割位點如圖所示?；卮鹣铝袉栴}：(1)常用的DNA連接酶有E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶。上圖中____________酶切割后的DNA片段可以用E.coliDNA連接酶連接。上圖中__________________酶切割后的DNA片段可以用T4DNA連接酶連接。(2)DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學(xué)鍵是____________。(3)DNA重組技術(shù)中所用的質(zhì)粒載體具有一些特征，如質(zhì)粒DNA分子上有復(fù)制原點，可以保證質(zhì)粒在受體細胞中能________；質(zhì)粒DNA分子上有____________________，便于外源DNA插入；質(zhì)粒DNA分子上有標記基因(如某種抗生素抗性基因)，利用抗生素可篩選出含質(zhì)粒載體的宿主細胞，方法是____________________________________________________________________________________________________________________________。(4)表達載體含有啟動子，啟動子是指___________________________________________________________________________________________________________________。解析：(1)限制酶EcoRⅠ和PstⅠ切割形成的是黏性末端，限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的是平末端，E.coliDNA連接酶來源于大腸桿菌，只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端之間的磷酸二酯鍵連接起來，而T4DNA連接酶來源于T4噬菌體，可用于連接黏性末端和平末端，但連接效率較低。因此圖中EcoRⅠ和PstⅠ切割后的DNA片段(黏性末端)既可以用E.coliDNA連接酶連接，又可以用T4DNA連接酶連接，而限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割后的DNA片段(平末端)只能用T4DNA連接酶連接。(2)DNA連接酶將兩個DNA片段連接形成磷酸二酯鍵。(3)質(zhì)粒是小型環(huán)狀的DNA分子，常作為基因表達的載體。質(zhì)粒上含有復(fù)制原點，能保證質(zhì)粒在受體細胞中自我復(fù)制；質(zhì)粒DNA分子上有一個至多個限制酶的酶切位點，便于目的基因的導(dǎo)入；質(zhì)粒上的標記基因是為了鑒定受體細胞中是否含有目的基因，具體做法是用含有該抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細胞，能夠存活的即為含有質(zhì)粒載體的宿主細胞。(4)啟動子是一段特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得需要的蛋白質(zhì)。答案：(1)EcoRⅠ、PstⅠEcoRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ和EcoRⅤ(2)磷酸二酯鍵(3)自我復(fù)制一個至多個限制酶切割位點用含有該抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細胞，能夠存活的即為含有質(zhì)粒載體的宿主細胞(4)位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶識別及結(jié)合的部位，能驅(qū)動轉(zhuǎn)錄過程2．(2022·山東高考)某種類型的白血病由蛋白P引發(fā)，蛋白UBC可使P被蛋白酶識別并降解，藥物A可通過影響這一過程對該病起到治療作用。為探索藥物A治療該病的機理，需構(gòu)建重組載體以獲得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，F(xiàn)LAG是一種短肽，連接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能與含有FLAG抗體的介質(zhì)結(jié)合，但不影響P或P△的功能。(1)為構(gòu)建重組載體，需先設(shè)計引物，通過PCR特異性擴增P基因。用于擴增P基因的引物需滿足的條件是______________________________________________。為使PCR產(chǎn)物能被限制酶切割，需在引物上添加相應(yīng)的限制酶識別序列，該限制酶識別序列應(yīng)添加在引物的________(填“3′端”或“5′端”)。(2)PCR擴增得到的P基因經(jīng)酶切連接插入載體后，與編碼FLAG的序列形成一個融合基因，如圖甲所示，其中“ATGTGCA”為P基因編碼鏈起始序列。將該重組載體導(dǎo)入細胞后，融合基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA序列正確，翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確，但P基因?qū)?yīng)的氨基酸序列與P不同。據(jù)圖甲分析，出現(xiàn)該問題的原因是__________________________________________________________________________________________________________________________。修改擴增P基因時使用的帶有EcoRⅠ識別序列的引物來解決該問題，具體修改方案是__________________________________。(3)融合蛋白表達成功后，將FLAG-P、FLAG-P△、藥物A和UBC按照圖乙中的組合方式分成5組。各組樣品混勻后分別流經(jīng)含F(xiàn)LAG抗體的介質(zhì)，分離出與介質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)并用UBC抗體檢測，檢測結(jié)果如圖丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③組結(jié)果的差異推測，藥物A的作用是____________________________；由②④組或③⑤組的差異推測，P△中缺失的特定序列的作用是__________________________________________________。(4)根據(jù)以上結(jié)果推測，藥物A治療該病的機理是______________________________________________________________________________。解析：(1)引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸，因此設(shè)計擴增P基因的引物需要滿足的條件是能與P基因母鏈的一段堿基序列互補配對，并且是短單鏈核酸。DNA聚合酶延伸時，是將脫氧核苷酸添加到引物的3′端，為了不破壞目的基因，該限制酶識別序列應(yīng)添加在引物的5′端。(2)融合基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA序列正確，翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確，但P基因?qū)?yīng)的氨基酸序列與P不同，說明P基因翻譯時出錯。由圖可以看出，P基因編碼鏈的第一個堿基與EcoRⅠ識別序列的最后兩個堿基編碼一個氨基酸，導(dǎo)致mRNA的密碼子被錯位讀取。解決該問題的修改方案是在引物中的EcoRⅠ識別序列3′端添加一個堿基，使EcoRⅠ識別序列不影響P基因的正常翻譯。(3)①組僅添加UBC；②組添加UBC和FLAG-P；③組添加UBC、FLAG-P和藥物A；④組添加UBC和FLAG-P△；⑤組添加UBC、FLAG-P△和藥物A。按題中所述處理后，①組沒出現(xiàn)雜交帶，②③組出現(xiàn)雜交帶，③組雜交帶更加明顯，說明藥物A的作用是增強FLAG-P與UBC的結(jié)合。②④組或③⑤組的差異在于②③組含有FLAG-P，出現(xiàn)雜交帶，④⑤組含有FLAG-P△，沒出現(xiàn)雜交帶，據(jù)此推測P△中缺失的特定序列的作用是參與P與UBC的結(jié)合。(4)根據(jù)(3)的分析推測，藥物A通過增強P與UBC結(jié)合促進P降解，達到治療該病的目的。答案：(1)能與P基因母鏈的一段堿基序列互補配對、短單鏈核酸5′端(2)P基因編碼鏈的第一個堿基與EcoRⅠ識別序列的最后兩個堿基編碼一個氨基酸，導(dǎo)致mRNA的密碼子被錯位讀取在引物中的EcoRⅠ識別序列3′端添加一個堿基(3)增強FLAG-P與UBC的結(jié)合參與P與UBC的結(jié)合(4)藥物A通過增強P與UBC結(jié)合促進P降解知能集成(一)探討基因工程操作中限制酶的選擇方法1．根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點確定限制酶的種類(1)應(yīng)選擇切點位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PstⅠ。(2)不能選擇切點位于目的基因和標記基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲、乙不能選擇SmaⅠ。(3)為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切點)。2．根據(jù)質(zhì)粒的特點確定限制酶的種類3．根據(jù)Ti質(zhì)粒的T-DNA片段選擇限制酶圖中甲、乙、丁Ti質(zhì)粒均不宜選取，而丙Ti質(zhì)粒宜選取(設(shè)切割目的基因的限制酶為XbaⅠ和SacⅠ)，分析如下：[典例]玉米是重要的糧食作物，其葉片細胞中的P蛋白是一種水通道蛋白，由P基因編碼，在植物生長發(fā)育過程中對水分的吸收具有重要的調(diào)節(jié)功能。科研人員成功培育出超量表達P蛋白轉(zhuǎn)基因玉米，所用DNA片段和Ti質(zhì)粒的酶切位點如圖所示。請回答下列問題：(1)強啟動子是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，能被________________識別并結(jié)合，驅(qū)動基因的持續(xù)轉(zhuǎn)錄。為使P基因在玉米植株中超量表達，應(yīng)優(yōu)先選用____________________酶組合，將Ti質(zhì)粒切開后構(gòu)建重組表達載體。T-DNA在該實驗中的作用是____________________________________________________________________________________________________。(2)將農(nóng)桿菌浸泡過的玉米愈傷組織去菌后進行植物組織培養(yǎng)，培養(yǎng)基中需加入______進行篩選，此物質(zhì)屬于氨基糖苷類抗生素，它能抑制蛋白質(zhì)在葉綠體和線粒體中合成，使植物的光合作用和________受到干擾，從而引起植物細胞死亡。(3)愈傷組織是一種相對沒有分化的________團，經(jīng)液體懸浮培養(yǎng)可以分散成胚性單細胞，在適宜的培養(yǎng)基中，這種單細胞可以發(fā)育成__________，再繼續(xù)發(fā)育成轉(zhuǎn)基因玉米株系。[解析](1)啟動子是RNA聚合酶識別并結(jié)合的位點，能驅(qū)動基因的轉(zhuǎn)錄。為使P基因在玉米植株中超量表達，則需要強啟動子，因此應(yīng)優(yōu)先選用BamHⅠ和SacⅠ酶組合，將Ti質(zhì)粒切開后構(gòu)建重組表達載體。農(nóng)桿菌中Ti質(zhì)粒上的T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細胞，并且整合到受體細胞染色體的DNA上，因此T-DNA在該實驗中的作用是將強啟動子和P基因帶入玉米細胞并整合到玉米細胞染色體DNA上。(2)由圖可知，標記基因是G418抗性基因，因此將農(nóng)桿菌浸泡過的玉米愈傷組織去菌后進行植物組織培養(yǎng)，培養(yǎng)基中需加入G418進行篩選，此物質(zhì)屬于氨基糖苷類抗生素，它能抑制蛋白質(zhì)在葉綠體和線粒體中合成，其中葉綠體是光合作用的場所，線粒體是細胞有氧呼吸的主要場所，因此其可使植物的光合作用和呼吸作用(能量代謝)受到干擾，從而引起植物細胞死亡。(3)愈傷組織是一種相對沒有分化的薄壁細胞團，經(jīng)液體懸浮培養(yǎng)可以分散成胚性單細胞，在適宜的培養(yǎng)基中，這種單細胞可以發(fā)育成胚狀體，再繼續(xù)發(fā)育成轉(zhuǎn)基因玉米株系。[答案](1)RNA聚合酶BamHⅠ和SacⅠ將強啟動子和P基因帶入玉米細胞并整合到玉米細胞染色體DNA上(2)G418呼吸作用(能量代謝)(3)薄壁細胞胚狀體[針對訓(xùn)練]1．為了獲得抗蚜蟲棉花新品種，研究人員將雪花蓮凝集素基因(GNA)和尾穗莧凝集素基因(ACA)與載體(pBI121)結(jié)合，然后導(dǎo)入棉花細胞。下列操作與實驗?zāi)康牟环氖?)A．用限制酶BsaBⅠ和DNA連接酶處理兩種基因可獲得GNA-ACA融合基因B．與只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ處理融合基因和載體可保證基因轉(zhuǎn)錄方向正確C．將棉花細胞接種在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上可篩選出轉(zhuǎn)基因細胞D．用PCR技術(shù)可檢測GNA和ACA基因是否導(dǎo)入棉花細胞中解析：選C由圖可知：GNA、ACA都含有限制酶BsaBⅠ的酶切位點，故用限制酶BsaBⅠ和DNA連接酶處理兩種基因可獲得GNA-ACA融合基因，A正確；圖中質(zhì)粒與GNA-ACA上都含有KpnⅠ和XhoⅠ的酶切位點，與只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ處理融合基因和載體可保證基因轉(zhuǎn)錄方向正確，B正確；由于重組質(zhì)粒含有卡那霉素的抗性基因，故將棉花細胞接種在含卡那霉素的培養(yǎng)基上可篩選出轉(zhuǎn)基因細胞，C錯誤；PCR技術(shù)可用于基因探針的制備，可用來檢測目的基因是否導(dǎo)入受體細胞，D正確。2．將小菜蛾細胞的羧酸酯酶基因(CarE)導(dǎo)入水稻細胞，培育抗農(nóng)藥水稻新品種，過程如圖所示。下列敘述錯誤的是()A．必須將含CarE基因的質(zhì)粒導(dǎo)入水稻的受精卵B．構(gòu)建重組質(zhì)粒時，應(yīng)選用PstⅠ和SmaⅠ分別切割質(zhì)粒和含CarE基因的DNAC．Tetr的作用是鑒別和篩選含CarE基因的細胞D．通過檢測表達產(chǎn)物來判斷CarE基因在水稻細胞中是否發(fā)揮功能作用解析：選A不一定要將含CarE基因的質(zhì)粒導(dǎo)入水稻的受精卵，但是導(dǎo)入受精卵效果要好，A錯誤；Tetr是標記基因，是為了鑒定受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來，C正確。知能集成(二)PCR技術(shù)中引物的相關(guān)問題分析1．PCR技術(shù)和DNA復(fù)制的比較項目PCR技術(shù)DNA復(fù)制場所體外(PCR擴增儀中)細胞內(nèi)(主要是細胞核內(nèi))解旋方式DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化酶耐高溫的DNA聚合酶解旋酶、DNA聚合酶溫度條件在較高溫度下進行需控制溫度細胞內(nèi)溫和條件合成對象DNA片段DNA分子相同點均需要模板(DNA雙鏈)、原料(四種脫氧核苷酸)、能量2.與引物相關(guān)的問題歸納概括(1)PCR技術(shù)需要引物的原因。DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從3′端延伸DNA鏈，因此，DNA的復(fù)制需要引物。當(dāng)引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3′端開始延伸DNA鏈，因此DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸。(2)PCR擴增中需要引物數(shù)目的計算規(guī)律。若一個DNA分子在PCR中經(jīng)過n輪循環(huán)，理論上需要消耗引物數(shù)為2n＋1－2，第n輪循環(huán)需要消耗的引物數(shù)為2n個。[典例]IKK激酶參與動物體內(nèi)免疫細胞的分化。臨床上發(fā)現(xiàn)某重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)患兒IKK基因編碼區(qū)第1183位堿基T突變?yōu)镃，導(dǎo)致IKK上第395位酪氨酸被組氨酸代替。為研究該患兒發(fā)病機制，研究人員利用純合野生鼠應(yīng)用大引物PCR定點誘變技術(shù)培育出SCID模型小鼠(純合)，主要過程如圖1、2。分析回答：(1)在PCR反應(yīng)體系中，除加入引物、IKK基因、緩沖液、Mg2＋等外，還需加入________________________________________________________________________等。(2)在圖1獲取突變基因過程中，需要以下3種引物：引物A5′-CCCCAACCGGAAAGTGTCA-3′(下劃線字母為突變堿基)引物B5′-TAAGCTTCGAACATCCTA-3′(下劃線部分為限制酶HindⅢ識別序列)引物C5′-GTGAGCTCGCTGCCCCAA-3′(下劃線部分為限制酶SacⅠ識別序列)則PCR1中使用的引物有______________，PCR2中使用的引物有__________和圖中大引物的________(填“①”或“②”)鏈。(3)PCR的反應(yīng)程序為：94℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃50s,30個循環(huán)。在循環(huán)之前的94℃3min處理為預(yù)變性；循環(huán)中72℃處理的目的是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(4)據(jù)圖2分析代孕母鼠對移入子宮的胚胎基本不發(fā)生免疫反應(yīng)，這為________________________提供了可能。(5)研究人員經(jīng)鑒定、篩選獲得一只轉(zhuǎn)基因雜合鼠F0，并確認突變基因已經(jīng)穩(wěn)定同源替代IKK基因，請你設(shè)計完成獲得SCID模型鼠的實驗步驟：①雜交親本：______________，雜交得F1；②F1雌雄鼠隨機交配得F2；③提取F2每只小鼠的基因組DNA，采用分子生物學(xué)方法，利用IKK基因探針和突變基因探針進行篩選，則____________________________________________________為模型鼠。[解析](1)在PCR反應(yīng)體系中，除加入引物、IKK基因、緩沖液、Mg2＋等外，還需加入耐高溫DNA聚合酶、4種脫氧核苷酸等。(2)在PCR1中，獲取的是大引物，大引物中含有突變基因，所以應(yīng)含有引物A，在基因的右端有限制酶HindⅢ識別的序列，所以要用到引物B；在PCR2中，有一個引物結(jié)合到了基因的左端，在它從5′到3′的序列的開始部位應(yīng)含有限制酶SacⅠ識別的序列，所以要用到引物C；而另外的一個引物就是大引物中的一條鏈，它應(yīng)該結(jié)合到基因的右端，且從5′到3′端的序列中開始部位應(yīng)含有HindⅢ識別的序列，從圖中看，它是大引物的②鏈。(3)在PCR循環(huán)之前的94℃3min處理為預(yù)變性，使DNA雙鏈解開；循環(huán)中72℃處理的目的是使TaqDNA聚合酶從引物起始通過堿基互補配對進行互補鏈合成。(4)代孕母鼠對移入子宮的胚胎基本不發(fā)生免疫反應(yīng)，這為胚胎在受體內(nèi)存活提供了可能。(5)①研究人員經(jīng)鑒定、篩選獲得一只轉(zhuǎn)基因雜合鼠F0，并確認突變基因已經(jīng)穩(wěn)定同源替代IKK基因，若要獲得SCID模型鼠，可讓F0與野生鼠雜交得F1；②F1雌雄鼠隨機交配得F2；③模型鼠中應(yīng)含有突變基因，但不含IKK基因，故提取F2每只小鼠的基因組DNA，利用IKK基因探針和突變基因探針進行篩選，若IKK基因探針檢測未出現(xiàn)雜交帶，突變基因探針檢測出現(xiàn)雜交帶的則為模型鼠。[答案](1)TaqDNA聚合酶(或熱穩(wěn)定DNA聚合酶)、4種脫氧核苷酸(2)引物A和引物B引物C②(3)使TaqDNA聚合酶從引物起始進行互補鏈合成(4)胚胎在受體內(nèi)存活(5)①F0×野生鼠③IKK基因探針檢測未出現(xiàn)雜交帶，突變基因探針檢測出現(xiàn)雜交帶[針對訓(xùn)練]1．農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移并隨機插入被侵染植物的染色體DNA中。研究者將圖中被侵染植物的DNA片段連接成環(huán)，并以此環(huán)為模板進行PCR，擴增出T-DNA插入位置兩側(cè)的未知序列，以此可確定T-DNA插入的具體位置。下列說法錯誤的是()注：子鏈從引物的3′端開始延伸。A．PCR擴增依據(jù)的是DNA分子雙鏈復(fù)制的原理B．進行PCR擴增需要耐高溫的DNA聚合酶C．利用圖中的引物②③組合可擴增出兩側(cè)的未知序列D．通過與受體細胞的基因組序列比對，可確定T-DNA的插入位置解析：選CPCR擴增依據(jù)的是DNA分子雙鏈復(fù)制的原理，是體外擴增DNA的一種方式，A正確；PCR中變性過程需要在高溫條件下進行，故進行PCR擴增需要耐高溫的DNA聚合酶，B正確；由于DNA的兩條鏈反向平行，且子鏈從引物的3′端開始延伸，故利用圖中的引物①④組合可擴增出兩側(cè)的未知序列，C錯誤；通過與受體細胞的基因組序列比對，可確定T-DNA的插入位置，D正確。2．中國某科研團隊研制的重組流感疫苗制備流程如圖1所示?；卮鹣铝袉栴}：(1)基因工程的核心步驟是____________________，被用作載體的Ad5應(yīng)具有的特點有____________________________________________等。(2)對流感重點地區(qū)輸入的人員進行核酸檢測需要用到用含放射性同位素的__________做探針，進行血清抗體檢測的方法是________________雜交。(3)為探究疫苗的注射劑量對志愿者產(chǎn)生的免疫效果，需要給不同組志愿者分別注射____________的疫苗，一段時間后采集血樣檢測相應(yīng)抗體的水平。(4)流感病毒的檢測最常見的方法是熒光定量RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng))，RT-PCR的具體過程如圖2所示。①過程Ⅰ和Ⅱ都需要加入緩沖液、原料、酶和引物等，其中加入的酶分別是________________________________________________________________________。②RT-PCR過程通過對________的控制影響酶的活性和DNA分子結(jié)構(gòu)，從而使得整個反應(yīng)過程有序地進行。③過程Ⅱ擬對單鏈cDNA進行n次循環(huán)擴增，理論上需要引物B為____________個。解析：(1)基因工程的核心步驟是基因表達載體的構(gòu)建；作為基因工程的載體需要具備的條件有：能自我復(fù)制、有一個或多個切割位點、有標記基因位點、對受體細胞無害等。(2)探針是指放射性同位素或熒光分子標記的目的基因；進行血清抗體檢測的方法是抗原—抗體雜交。(3)探究疫苗的注射劑量對志愿者產(chǎn)生的免疫效果時，自變量是疫苗的劑量，因此需要給不同組志愿者分別注射不同劑量的疫苗，一段時間后采集血樣檢測相應(yīng)抗體的水平。(4)①Ⅰ為逆轉(zhuǎn)錄過程，該過程需要逆轉(zhuǎn)錄酶的催化；Ⅱ為PCR技術(shù)擴增過程，該過程需要耐高溫的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)。②RT-PCR過程通過對溫度的控制影響酶的活性和DNA分子結(jié)構(gòu)，從而使得整個反應(yīng)過程有序地進行。③過程Ⅱ擬對單鏈cDNA進行n次循環(huán)的擴增，由于起點是單鏈DNA，經(jīng)過依次循環(huán)形成一個雙鏈DNA分子，每個雙鏈DNA分子都需要一個引物B，因此經(jīng)過n次循環(huán)形成2n－1個子代DNA分子，也需要2n－1個引物B。答案：(1)基因表達載體的構(gòu)建有一個或多個切割位點、有標記基因位點、對受體細胞無害(2)目的基因抗原—抗體(3)不同劑量(4)①逆轉(zhuǎn)錄酶、耐高溫的DNA聚合酶②溫度③2n－1[課時驗收評價]1．為增強玉米抗旱性，研究者構(gòu)建含有某微生物抗旱基因E的重組質(zhì)粒，用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入玉米幼胚組織細胞中，獲得抗旱的轉(zhuǎn)基因玉米。下列相關(guān)敘述不正確的是()A．提取該微生物mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過PCR可獲得大量目的基因B．將重組質(zhì)粒置于經(jīng)CaCl2處理的農(nóng)桿菌懸液中，可以獲得轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌C．用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將E基因轉(zhuǎn)入玉米幼胚組織細胞需要嚴格進行無菌操作D．用E蛋白的抗體進行抗原—抗體雜交，可在個體水平檢測轉(zhuǎn)基因玉米的抗旱性狀解析：選D用E蛋白的抗體進行抗原—抗體雜交，可在分子水平檢測轉(zhuǎn)基因玉米的抗旱性狀，D錯誤。2．如圖是三種限制酶的脫氧核苷酸識別序列和切割位點示意圖(↓表示切點)。下列相關(guān)分析錯誤的是()A．這三種限制酶切割出的DNA片段末端都是黏性末端B．不同限制酶切割DNA所得的黏性末端可能相同C．能被限制酶3切割的DNA也能被限制酶1切割D．同一個DNA經(jīng)限制酶1和限制酶3分別切割后所得片段數(shù)一定相等解析：選D能被限制酶3切割的DNA也能被限制酶1切割，但能被限制酶1切割的DNA不一定能被限制酶3切割，故同一個DNA經(jīng)限制酶1和限制酶3分別切割后所得片段數(shù)不一定相等，C正確，D錯誤。3．圖甲、乙中標注了相關(guān)限制酶的酶切位點。下列關(guān)于培育轉(zhuǎn)基因大腸桿菌的敘述錯誤的是()A．若通過PCR獲取該目的基因，應(yīng)該選用引物甲和引物丙B．圖中質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建表達載體，應(yīng)選用BclⅠ和HindⅢ剪切C．若將基因表達載體導(dǎo)入受體細胞中，可選用Ca2＋處理法D．在受體細胞中，氨芐青霉素抗性基因和目的基因可同時表達解析：選D通過PCR獲取目的基因時，兩種引物分別和目的基因的兩條單鏈結(jié)合，并沿相反的方向合成子鏈，故選用引物甲和引物丙，A正確；由甲圖可知，選用BamHⅠ會破壞兩種抗性基因，結(jié)合乙圖可確定應(yīng)選擇BclⅠ和HindⅢ剪切，B正確；將目的基因?qū)氪竽c桿菌常采用Ca2＋處理法，C正確；構(gòu)建重組質(zhì)粒時目的基因插入氨芐青霉素抗性基因中，故氨芐青霉素抗性基因被破壞不能表達，D錯誤。4．限制酶的發(fā)現(xiàn)為DNA的切割和功能基因的獲得創(chuàng)造了條件。限制酶Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ的識別序列及切割位點分別為↓GATC、G↓AATTC、C↓GATCC。含某目的基因的DNA片段如圖所示，若利用質(zhì)粒A(含限制酶Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位點各1個)構(gòu)建基因表達載體，為克服目的基因和質(zhì)粒A的自身環(huán)化以及目的基因與質(zhì)粒的任意連接等。下列對限制酶的選擇，正確的是()A．用限制酶EcoRⅠ或BamHⅠ處理含某目的基因的DNA和質(zhì)粒AB．用限制酶Sau3AⅠ和BamHⅠ處理含某目的基因的DNA和質(zhì)粒AC．用限制酶Sau3AⅠ和EcoRⅠ處理含某目的基因的DNA和質(zhì)粒AD．用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ處理含某目的基因的DNA和質(zhì)粒A解析：選D用限制酶Sau3AⅠ切割目的基因會破壞目的基因，質(zhì)粒含有限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位點，獲取目的基因也可以用限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ進行切割，但為了防止目的基因或質(zhì)粒自身環(huán)化，需要使用不同種限制酶進行切割，則可以使用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ切割質(zhì)粒和目的基因。5．植株在干旱、低溫等逆境中，脫水素(具有一定抗干旱脅迫和耐冷凍能力的蛋白質(zhì))被誘導(dǎo)表達，脫水素基因編碼區(qū)共含678個堿基對?？茖W(xué)家利用如圖所示PBⅠ121質(zhì)粒，以及XbaⅠ和SacⅠ兩種限制酶，運用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，將脫水素基因?qū)氩葺嚬苊缛~片細胞，再經(jīng)植物組織培養(yǎng)獲得脫水素基因過量表達的轉(zhuǎn)基因草莓植株。下列相關(guān)敘述錯誤的是()A．重組質(zhì)粒利用SacⅠ和HindⅢ切割后能得到1500bp片段，則表明目的基因正確插入質(zhì)粒B．組織培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基需添加卡那霉素和新霉素以便篩選轉(zhuǎn)基因植株C．可以利用PCR技術(shù)鑒定目的基因是否整合到草莓染色體的DNA上D．轉(zhuǎn)基因草莓植株批量生產(chǎn)前需進行抗干旱、耐冷凍實驗解析：選B根據(jù)分析可知，由于重組質(zhì)粒上移除1900bp而補充了脫水素基因的678個堿基對，加上未移除的822bp，所以用SacⅠ和HindⅢ切割重組質(zhì)粒后，可得到822＋678＝1500bp的新片段，據(jù)此可確定目的基因正確插入了質(zhì)粒，A正確；題中提供的限制酶切割位點對卡那霉素抗性基因沒有影響，所以無論是否插入了目的基因，卡那霉素抗性基因都可以表達，起不到篩選轉(zhuǎn)基因植株的作用，B錯誤；PCR技術(shù)是進行DNA擴增的技術(shù)，需要一段引物來進行擴增，依照脫水素基因的核苷酸序列設(shè)計一段引物，若能進行擴增，說明轉(zhuǎn)入目的基因成功，C正確；植株批量生產(chǎn)前，需要在個體水平上進行抗干旱、耐冷凍實驗，以確保轉(zhuǎn)基因植物中的脫水素基因表達出了蛋白質(zhì)并發(fā)揮了作用，使植物表現(xiàn)為抗干旱、耐冷凍，D正確。6．研究表明，服用α-干擾素在慢性乙肝、丙肝及部分腫瘤的治療中有一定療效。人參是一種名貴藥材，具有較好的滋補作用。如圖為科研人員制備能合成干擾素的人參愈傷組織細胞的流程，①～④表示相關(guān)的操作。若限制酶EcoRⅠ識別，BamHⅠ識別。下列說法錯誤的是()A．步驟①中，利用PCR技術(shù)擴增干擾素基因時，設(shè)計引物序列的主要依據(jù)是干擾素基因兩端的部分核苷酸序列B．在過程③中T-DNA整合到受體細胞的染色體DNA上C．科研人員在兩種引物的一端分別加上了GAATTC和GGATCC序列，目的是方便后續(xù)的剪切和連接D．過程④中，科研人員最終未能檢測出干擾素基因，其原因可能是干擾素基因未能導(dǎo)入人參愈傷組織細胞解析：選B步驟①中，利用PCR技術(shù)擴增干擾素基因時，設(shè)計引物序列的主要依據(jù)是干擾素基因兩端的部分核苷酸序列，A正確；過程③是將重組質(zhì)粒導(dǎo)入根瘤農(nóng)桿菌，而在侵染人參愈傷組織細胞時，T-DNA整合到受體細胞的染色體DNA上，B錯誤；由于需要用EcoRⅠ、BamHⅠ兩種限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，因此在兩種引物的一端分別加上了GAATTC和GGATCC序列，以便后續(xù)的剪切和連接，C正確；干擾素基因未能導(dǎo)入人參愈傷組織細胞或?qū)肴藚⒂鷤M織細胞的干擾素基因未能轉(zhuǎn)錄，均會導(dǎo)致不能檢測出干擾素基因，D正確。7．(2023·中山調(diào)研)人類胰島素基因位于第11號染色體上，長度為8416bp，人類胰島素的氨基酸序列已知?；卮鹣铝邢嚓P(guān)問題。(1)上圖是利用PCR技術(shù)獲取人胰島素基因的方法，除了此方法外，還可以利用的方法是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(2)利用PCR技術(shù)獲取人胰島素基因，在緩沖液中除了要添加模板和引物外，還需要添加的物質(zhì)有________________________________________________________________________。(3)經(jīng)過________輪循環(huán)可以得到所需的目的基因，一個DNA分子經(jīng)過5輪循環(huán)，需要引物A________個，從PCR的過程和DNA分子的特點，試著寫出設(shè)計引物需要注意的問題：________________________________________________________________________________________________________________________________________________(答出2點即可)。(4)利用SDS-凝膠電泳分離不同DNA分子，遷移速度與________________________________________________________________________等有關(guān)。(5)利用圖示方法獲取的目的基因，直接構(gòu)建基因表達載體后導(dǎo)入大腸桿菌，________(填“能”或“不能”)表達出人胰島素，理由是________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。解析：(1)(2)解析略。(3)題圖中引物A和引物B在DNA片段內(nèi)部，根據(jù)PCR的過程和DNA分子半保留復(fù)制的特點可知，前兩輪循環(huán)產(chǎn)生的4個DNA分子的兩條鏈均不等長，第三輪循環(huán)產(chǎn)生的DNA分子存在等長的兩條核苷酸鏈，即目的基因。其過程圖如下：第一輪：第二輪：由①得到的DNA分子如下：由②得到的DNA分子如下：第三輪：由①可得由②可得從理論上推測，一個DNA分子經(jīng)n次循環(huán)合成的DNA分子為2n個，脫氧核苷酸鏈數(shù)為2n＋1，新合成的脫氧核苷酸鏈數(shù)為2n＋1－2，而每合成一條脫氧核苷酸鏈需要一個引物，所以共需要消耗2n＋1－2個引物，即25＋1－2＝62(個)，其中引物A為31個。設(shè)計引物時需要注意以下幾點：引物自身及引物之間不能有互補序列，以防止自身或相互連接；引物長度適當(dāng)?shù)取?4)(5)解析略。答案：(1)從基因文庫獲取或人工合成(2)四種脫氧核苷酸和耐高溫的DNA聚合酶(3)331引物自身不能有互補序列；引物之間不能有互補序列(4)凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象(5)不能因為此方法獲得的目的基因中含有內(nèi)含子，大腸桿菌無法正常識別內(nèi)含子，而對內(nèi)含子部分轉(zhuǎn)錄的mRNA進行翻譯，導(dǎo)致合成的蛋白質(zhì)出現(xiàn)錯誤階段驗收評價(六)生物技術(shù)與工程一、選擇題(本題共16小題，共40分。第1～12小題，每小題2分；第13～16小題，每小題4分。每題只有一個正確選項)l1．下列關(guān)于滅菌和消毒的說法，錯誤的是()A．滅菌可殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子B．消毒不能殺死微生物的營養(yǎng)細胞和一部分芽孢C．紫外線消毒常用于培養(yǎng)環(huán)境的空氣消毒和一般物品的表面消毒D．干熱滅菌法適用于玻璃器皿(如吸管、培養(yǎng)皿等)、金屬用具等的滅菌解析：選B滅菌可殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子，而消毒是指用較為溫和的物理、化學(xué)或生物等方法殺死物體表面或內(nèi)部的一部分微生物的過程，可以殺死微生物的營養(yǎng)細胞和一部分芽孢，A正確，B錯誤；對于培養(yǎng)環(huán)境的空氣消毒和一般物品的表面消毒可以采用紫外線消毒法，其原因是紫外線能夠使雜菌的蛋白質(zhì)變性，使雜菌的DNA結(jié)構(gòu)遭到破壞，從而失去活性，C正確；耐高溫的和需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(如吸管、培養(yǎng)皿等)和金屬用具等，可以采用干熱滅菌法滅菌，D正確。2．黃酒是世界上古老的酒類之一，源于中國，以糯米、黍米、粟為原料，一般酒精含量為14%～20%，酒的品質(zhì)取決于菌種。下圖表示釀制黃酒的一種工藝流程。下列有關(guān)敘述正確的是()A．菌種a能產(chǎn)生淀粉酶，淀粉作為菌種a的碳源和氮源B．菌種b增殖過程中，產(chǎn)生的酒精分子數(shù)等于CO2分子數(shù)C．菌種b產(chǎn)生的酒精的跨膜運輸不需要載體蛋白協(xié)助D．工藝c表示滅菌，目的與“蒸煮”相同解析：選C根據(jù)酶的專一性，淀粉酶分解、利用的是原料中的淀粉，淀粉為菌種a提供碳源，而不能作為氮源物質(zhì)，A錯誤；菌種b在有氧呼吸和無氧呼吸過程中均會增殖，只是增殖速率不同，而只有無氧呼吸產(chǎn)生的酒精分子數(shù)等于CO2分子數(shù)，B錯誤；菌種b在細胞質(zhì)基質(zhì)中經(jīng)無氧呼吸(酒精發(fā)酵)產(chǎn)生酒精，以自由擴散的方式運輸?shù)郊毎猓恍枰d體蛋白協(xié)助，C正確；工藝c為消毒，“蒸煮”有利于糖化，同時也會殺死大多數(shù)微生物，D錯誤。3．固態(tài)發(fā)酵釀酒流程一般包括選糧、浸泡、蒸煮、攤涼、下曲、堆積發(fā)酵、入窖發(fā)酵等步驟，其發(fā)酵基質(zhì)中幾乎不含有可流動的水分。下列相關(guān)敘述錯誤的是()A．?dāng)倹龊笤傧虑?，主要是為了防止高溫?dǎo)致酒曲中的微生物死亡B．入窖發(fā)酵時如密封不嚴，可能會導(dǎo)致乳酸菌大量繁殖影響酒質(zhì)C．固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵相比其基質(zhì)含氧量更高，利于微生物的繁殖D．固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵比產(chǎn)生的廢水較少，更利于環(huán)保解析：選B攤涼后再下曲，主要是為了防止高溫導(dǎo)致酒曲中的微生物死亡，避免發(fā)酵失敗，A正確；入窖發(fā)酵時如密封不嚴，不會導(dǎo)致乳酸菌大量繁殖，因為乳酸菌是厭氧微生物，B錯誤；固態(tài)發(fā)酵中基質(zhì)與氣體的接觸面積大，供氧充足，因此固體發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵相比其基質(zhì)含氧量更高，因而有利于微生物通過有氧呼吸獲取大量的能量，進而有利于其大量繁殖，C正確；固態(tài)發(fā)酵的基質(zhì)中幾乎不含有可流動的水分，因此固態(tài)發(fā)酵與液態(tài)發(fā)酵相比產(chǎn)生的廢水較少，更有利于環(huán)保，D正確。4．研究者從被柴油污染的土壤中獲取了3種柴油降解菌進行研究，結(jié)果見下表。下列敘述不正確的是()菌株柴油濃度/%1245Y190.960.853.541.0Y292.8－－－Y370.142.5－－注：“－”表示菌株不能生長。A．為獲得降解菌，應(yīng)用以柴油為唯一碳源的培養(yǎng)基B．所用培養(yǎng)基和土壤樣液均需進行嚴格滅菌C．可采用稀釋涂布平板法獲得降解菌的單菌落D．Y1對高濃度柴油的耐受性更強解析：選B要獲得能降解柴油的菌種，需以柴油為唯一的碳源制備的培養(yǎng)基才有篩選作用，A正確；所用培養(yǎng)基需進行嚴格滅菌，以防止雜菌污染，若土壤樣液滅菌，則會連所需菌種一起殺死，B錯誤；可采用稀釋涂布平板法或平板劃線法獲得降解菌的單菌落，C正確；由表格可知，Y1對高濃度柴油的耐受性更強，D正確。5．我國科學(xué)家從北極分離、鑒定出了一種耐冷細菌，過程如下：①接種在人造海水中，在15℃振蕩培養(yǎng)3小時；②梯度稀釋后將樣品涂布在TYS培養(yǎng)基中(0.5%胰蛋白胨、0.1%酵母提取物、1.5%瓊脂)，15℃培養(yǎng)7天；③挑取生長的菌落，進行劃線，15℃培養(yǎng)后選擇不同形態(tài)的菌落進行進一步的培養(yǎng)、鑒定和保藏。下列說法不正確的是()A．人造海水、儀器等在使用前需要進行滅菌處理B．TYS培養(yǎng)基是含有機碳源、氮源的固體培養(yǎng)基C．涂布后再次劃線培養(yǎng)的目的是進一步純化所得菌種D．分析所有菌落，能還原采樣點所有微生物的種類與含量解析：選D人造海水、儀器等在使用前需要進行滅菌處理，否則會有雜菌污染，A正確；TYS培養(yǎng)基中有0.5%胰蛋白胨、0.1%酵母提取物、1.5%瓊脂，因此TYS培養(yǎng)基是含有機碳源、氮源的固體培養(yǎng)基，B正確；涂布后再次劃線培養(yǎng)的目的是進一步純化所得菌種，C正確；由于培養(yǎng)條件限制，有一些菌種無法培養(yǎng)出，因此不能還原采樣點所有微生物的種類與含量，D錯誤。6．科學(xué)家利用番茄和馬鈴薯的葉肉細胞原生質(zhì)體進行融合，培育出了“番茄－馬鈴薯”。但它并沒有像科學(xué)家預(yù)想的那樣，地上結(jié)番茄、地下結(jié)馬鈴薯。下列說法錯誤的是()A．該培育過程克服了遠緣雜交不親和的障礙B．人工誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的方法有離心法、電融合法及PEG融合法等C．生物體內(nèi)基因的表達不是孤立的，番茄－馬鈴薯的遺傳物質(zhì)可能相互干擾D．原生質(zhì)體融合得到的雜種細胞直接經(jīng)再分化即能形成雜種植株解析：選D植物體細胞雜交可以將2個不同物種的細胞雜合在一起，克服了遠緣雜交不親和的障礙，A正確；人工誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的方法有物理法和化學(xué)法兩大類，物理法包括離心法、電融合法等，化學(xué)法包括聚乙二醇(PEG)融合法、高Ca2＋-高pH融合法等，B正確；番茄－馬鈴薯雜種植株含有兩種親本的遺傳物質(zhì)，但生物基因的表達不是孤立的，它們之間是相互調(diào)控、相互影響的，C正確；原生質(zhì)體融合得到的雜種細胞，需經(jīng)脫分化和再分化才能形成雜種植株，D錯誤。7．Rag基因缺失小鼠不能產(chǎn)生成熟的淋巴細胞。科研人員通過誘導(dǎo)Rag基因缺失小鼠的體細胞獲得誘導(dǎo)多能干細胞(iPS細胞)，然后將Rag基因?qū)雐PS細胞并誘導(dǎo)使其分化為造血干細胞，再移植到Rag基因缺失小鼠體內(nèi)進行治療。下列分析錯誤的是()A．誘導(dǎo)獲得iPS細胞時需要在體細胞中表達一些關(guān)鍵基因B．培養(yǎng)iPS細胞時需提供95%空氣和5%CO2的混合氣體環(huán)境C．利用顯微注射技術(shù)可以將Rag基因直接注入到iPS細胞D．利用iPS細胞進行治療存在導(dǎo)致小鼠發(fā)生腫瘤的風(fēng)險解析：選C誘導(dǎo)獲得iPS細胞時是脫分化的過程，根本原因也是基因的選擇性表達，需要在體細胞中表達一些關(guān)鍵基因，A正確；培養(yǎng)iPS細胞時需提供95%空氣(提供氧氣，有助于細胞呼吸)和5%CO2(有助于維持培養(yǎng)液的pH)的混合氣體環(huán)境，B正確；直接注射基因容易導(dǎo)致基因丟失，一般需要將Rag基因和載體連接形成重組DNA分子再顯微注射到iPS細胞，C錯誤；iPS細胞為多能干細胞，可以誘導(dǎo)其進行不同方向的分化，利用iPS細胞并誘導(dǎo)使其分化為造血干細胞，造血干細胞分裂旺盛，存在導(dǎo)致小鼠發(fā)生腫瘤的風(fēng)險，D正確。8．黃曲霉毒素在保存不當(dāng)?shù)拿棺兗Z油食品中含量較高，具有很強的致癌性。研究表明黃曲霉毒素能引起細胞中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體不斷脫落。科研人員用黃曲霉毒素偶聯(lián)抗原制備出單克隆抗體以檢測食品中黃曲霉毒素的含量。下列敘述錯誤的是()A．當(dāng)人誤食黃曲霉毒素后，腸腺細胞可能發(fā)生消化酶的合成分泌減少B．可用電融合法、PEG法或滅活的病毒誘導(dǎo)B淋巴細胞和骨髓瘤細胞的融合C．細胞融合體現(xiàn)了細胞膜的流動性，雜交瘤細胞體外增殖體現(xiàn)了細胞的全能性D．單克隆抗體用于檢測食品中黃曲霉毒素的原理是抗原—抗體雜交解析：選C消化酶屬于分泌蛋白，需粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體參與合成，根據(jù)題干信息“研究表明黃曲霉毒素能引起細胞中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體不斷脫落”，會影響消化酶(分泌蛋白)的合成和分泌，A正確；誘導(dǎo)動物細胞融合的常用方法有PEG融合法、電融合法和滅活病毒誘導(dǎo)法等，可用以上方法誘導(dǎo)B淋巴細胞和骨髓瘤細胞的融合，獲得雜交瘤細胞，B正確；動、植物細胞融合都能體現(xiàn)細胞膜的流動性，雜交瘤細胞體外增殖不能體現(xiàn)細胞的全能性，C錯誤；抗體與抗原結(jié)合具有特異性，單克隆抗體是化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強的抗體，能與黃曲霉毒素特異性結(jié)合，其原理是抗原—抗體雜交，D正確。9．“生物導(dǎo)彈”主要由兩部分組成，一是“瞄準裝置”，二是殺傷性“彈頭”。下列敘述錯誤的是()A．“脾臟中的細胞”是從經(jīng)免疫處理的實驗動物獲取的B淋巴細胞B．圖中的雜交瘤細胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)會出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象C．單克隆抗體的靶向作用使③過程具有高度特異性D．構(gòu)成“彈頭”的抗癌藥物沒有選擇殺傷癌細胞的功能解析：選B制備單克隆抗體時，先給實驗動物注射特定抗原使之發(fā)生免疫反應(yīng)，之后從實驗動物脾臟中獲取已經(jīng)免疫的B淋巴細胞，故“脾臟中的細胞”是從經(jīng)免疫處理的實驗動物獲取的B淋巴細胞，A正確；最終獲得的雜交瘤細胞能夠無限增殖，在體外培養(yǎng)過程中不會出現(xiàn)接觸抑制的現(xiàn)象，B錯誤；過程③中由于單克隆抗體具有高度特異性，使其靶向作用非常準確，C正確；構(gòu)成“彈頭”的化學(xué)藥物、細胞毒素等物質(zhì)沒有選擇殺傷癌細胞的功能，而單克隆抗體能將這種殺傷功能定位，D正確。10．將人抗體基因插入噬菌體DNA，然后讓該噬菌體感染大腸桿菌，表達的抗體可能和病毒蛋白以融合蛋白的形式，附著在噬菌體表面，也可能通過大腸桿菌分泌出去。下列敘述錯誤的是()A．可從人的B細胞中獲取總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄、PCR技術(shù)擴增出抗體基因B．為防止抗體被降解，在實驗中應(yīng)選用蛋白酶缺陷型的大腸桿菌作為受體細胞C．在把抗體基因?qū)胧荏w細胞過程中，必須用Ca2＋處理大腸桿菌D．通過該方法生產(chǎn)的抗體具有靈敏度高、特異性強的特點解析：選C人體中B細胞的種類繁多，為獲得相應(yīng)的抗體基因，可提取人體B細胞中的總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄獲得目的基因，再通過PCR技術(shù)擴增，最后篩選出目的基因，A正確；對于大腸桿菌來說，目的基因表達的抗體屬于外來蛋白質(zhì)，會被蛋白酶分解，因此應(yīng)選擇蛋白酶缺陷型的大腸桿菌作為受體細胞，B正確；由題意可知，以噬菌體DNA為載體，插入抗體基因形成重組噬菌體，利用噬菌體的特性感染大腸桿菌，將抗體基因運進受體細胞中，不需要用Ca2＋處理大腸桿菌，C錯誤；利用該方法生產(chǎn)的抗體種類單一、純度高，因而具有靈敏度高、特異性強的特點，D正確。11．堿裂解法是一種應(yīng)用廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，其基本原理是基于大分子DNA與質(zhì)粒DNA變性與復(fù)性的差異而達到分離目的，流程如下。下列說法錯誤的是()eq\x(\a\al(菌體,獲取))→eq\x(\a\al(加入強堿,pH＝12.6溶液))→eq\x(\a\al(加入緩沖液調(diào),pH至中性))→eq\x(\a\al(離心、,沉淀等))A．質(zhì)粒屬于小型環(huán)狀雙鏈DNAB．離心、沉淀后應(yīng)棄上清液取沉淀物C．加入強堿處理的目的是使DNA氫鍵斷裂，為后續(xù)步驟作準備D．加入緩沖液處理的結(jié)果是只有質(zhì)粒DNA能夠正常復(fù)性解析：選B質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、具有自我復(fù)制能力的小型雙鏈環(huán)狀DNA分子，A正確；變性的質(zhì)粒DNA可恢復(fù)原來的構(gòu)型，保存在溶液中，而大分子DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心質(zhì)粒DNA留在上清液中，B錯誤，D正確；在pH為12.6的堿性條件下，大分子DNA和質(zhì)粒DNA的氫鍵斷裂，為后續(xù)作準備，C正確。12．在試管嬰兒的培育過程中，培養(yǎng)有兩種選擇，可選擇不同時期的胚胎進行移植。第一種是精卵細胞結(jié)合后在體外培養(yǎng)3天，成為卵裂期胚胎；第二種是讓卵裂期胚胎繼續(xù)發(fā)育2天，直到第5天發(fā)育成為囊胚。不是所有的卵裂期胚胎都能繼續(xù)發(fā)育，有些會停止分裂，即培育失敗。下列敘述中正確的是()A．從卵巢中分離出的卵細胞可以直接與獲能的精子完成受精作用B．在卵裂時期，胚胎的總體積并不會增加但細胞的數(shù)量不斷增加C．體外受精后5天對胚胎的質(zhì)量進行檢查，以確定胚胎是否具有發(fā)育為囊胚的能力D．培養(yǎng)3天的胚胎比培養(yǎng)5天的胚胎全能性強，胚胎移植后更容易發(fā)育成完整個體解析：選B從卵巢中分離的卵細胞因發(fā)育程度不同，不能直接與獲能精子完成受精作用，需要對卵細胞進行培養(yǎng)至MⅡ期，A錯誤；卵裂時期是在透明帶內(nèi)進行的分裂，所以卵裂過程細胞總數(shù)在增加，胚胎總體積并不增加，B正確；體外受精后5天，胚胎已經(jīng)發(fā)育為囊胚或已經(jīng)停止分裂，因此應(yīng)該是體外受精后3天對胚胎的質(zhì)量進行檢查，以確定是否具有發(fā)育為囊胚的能力，C錯誤；體外受精后培養(yǎng)3天的胚胎為卵裂期胚胎，體外受精后培養(yǎng)5天的胚胎為囊胚期胚胎，因為不是所有卵裂期胚胎都能繼續(xù)發(fā)育，故胚胎移植后囊胚期胚胎更容易發(fā)育成完整個體，D錯誤。13．在體細胞克隆猴培育過程中，為調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達，提高胚胎的發(fā)育率和妊娠率，研究人員將組蛋白去甲基化酶(Kdm4d)的mRNA注入了重構(gòu)胚，同時用組蛋白脫乙酰酶抑制劑(TSA)處理，具體培育流程如下圖所示。下列說法正確的是()A．去核時使用的差速離心、紫外線長時間照射和化學(xué)物質(zhì)處理等方法都沒有穿透卵母細胞的透明帶B．卵母細胞在去核環(huán)節(jié)實際操作中被去除的不是核膜包被的細胞核，而是紡錘體－染色體復(fù)合物C．組蛋白甲基化和乙?；谋碛^遺傳修飾都不利于重構(gòu)胚的分裂和發(fā)育D．為得到遺傳背景相同的克隆猴用于科研，可用機械方法將早期胚胎隨機切割成2份或4份后再進行胚胎移植解析：選B核移植技術(shù)中普遍使用的去核方法是顯微操作法，也可以采用梯度離心、紫外線短時間照射、化學(xué)物質(zhì)處理等，A錯誤；將卵母細胞培養(yǎng)到MⅡ期后進行去核操作，此時卵母細胞中的“核”其實是紡錘體－染色體復(fù)合物，去核事實上是去除卵母細胞的紡錘體－染色體復(fù)合物，B正確；將組蛋白去甲基化酶(Kdm4d)的mRNA注入重構(gòu)胚，同時用組蛋白脫乙酰酶抑制劑處理重構(gòu)胚，這樣可降低組蛋白的甲基化水平，提高組蛋白的乙?；?，從而改變組蛋白的表觀遺傳修飾來調(diào)控基因表達，C錯誤；為得到遺傳背景相同的克隆猴用于科研，可用機械方法將早期胚胎均勻切割成2份或4份后再進行胚胎移植，D錯誤。14.農(nóng)桿菌特有的T-DNA能夠提高其對宿主細胞的轉(zhuǎn)化，進而使宿主長出冠癭瘤。如圖為T-DNA上的部分結(jié)構(gòu)，有關(guān)分析錯誤的是()A．T-DNA是Ti質(zhì)粒上特有的序列，在基因工程中廣泛應(yīng)用B．T-DNA整合到宿主細胞基因組DNA上可能會導(dǎo)致基因突變C．T-DNA結(jié)構(gòu)的完整性是誘導(dǎo)宿主植株產(chǎn)生冠癭瘤的重要條件D．農(nóng)桿菌通過改變植物激素的種類與比例誘導(dǎo)細胞的分化方向解析：選AT-DNA是農(nóng)桿菌特有的序列，該序列可存在于農(nóng)桿菌所有DNA中，不是Ti質(zhì)粒所特有的，A錯誤；基因突變是指DNA分子中堿基對的增添、替換或缺失而引起基因堿基序列的改變，故T-DNA整合到宿主細胞基因組DNA上可能會導(dǎo)致基因突變，B正確；基因的結(jié)構(gòu)決定功能，基因要表達功能應(yīng)保證其具有完整性，故T-DNA結(jié)構(gòu)的完整性是誘導(dǎo)宿主植株產(chǎn)生冠癭瘤的重要條件，C正確；據(jù)圖可知，重組質(zhì)粒上有生長素合成基因和細胞分裂素合成基因，可通過改變植物激素的種類與比例誘導(dǎo)細胞的分化方向，D正確。15．如圖是一種靶向基因敲除技術(shù)即TALEN技術(shù)。該技術(shù)的敲除工具是由DNA識別域TALE和非特異性內(nèi)切核酸酶FoKI兩個部分組成的蛋白質(zhì)。TALE的二連氨基酸(字母N、I、G、H、D分別代表一種氨基酸)與四種堿基(A、G、C、T)有恒定的對應(yīng)關(guān)系。FoKI是一種形成二聚體后具有內(nèi)切核酸酶活性的蛋白單體。下列相關(guān)敘述錯誤的是()A．單獨使用FoKI對基因的切割敲除具有隨機性B．TALE蛋白的合成通常涉及PCR技術(shù)和蛋白質(zhì)工程C．二連氨基酸能與四種含氮堿基發(fā)生恒定的堿基互補配對D．TALE蛋白左右臂的二連氨基酸序列的設(shè)計依據(jù)靶基因堿基序列解析：選CFoKI是非特異性內(nèi)切核酸酶，單獨使用FoKI對基因的切割敲除具有隨機性，A正確；TALE蛋白的合成通常涉及PCR技術(shù)和蛋白質(zhì)工程，B正確；氨基酸內(nèi)沒有堿基，不能與四種含氮堿基發(fā)生恒定的堿基互補配對，只是存在恒定的對應(yīng)關(guān)系，C錯誤；由于TALE的二連氨基酸與四種堿基有恒定的對應(yīng)關(guān)系，TALE蛋白左右臂的二連氨基酸序列的設(shè)計依據(jù)靶基因堿基序列，D正確。16．為確定W基因在染色體上的位置，研究人員進行了操作：①破裂細胞后將染色體固定在玻片上，去除mRNA及染色體上的蛋白質(zhì)，拍攝染色體得到顯微照片1；②制備32P標記的W基因探針(單鏈DNA)；③將玻片上的染色體DNA變性為單鏈后，置于含W基因放射性探針的雜交溶液中溫育一段時間；④洗脫玻片上未雜交的放射性探針，對玻片進行放射性自顯影處理得到照片2；⑤將照片1和照片2疊加，確定W基因所在染色體及位置。下列分析錯誤的是()A．可用A－32P～P～P制備W基因的放射性探針B．W基因探針的堿基序列與W基因中某條單鏈的部分堿基序列相同或互補C．去除染色體上的蛋白質(zhì)并將DNA變性為單鏈有利于DNA與探針完成雜交D．若不去除mRNA，對實驗結(jié)果會產(chǎn)生干擾解析：選AW基因探針為單鏈DNA，可用dA－32P～P～P制備W基因的放射性探針，A錯誤；W基因所在的DNA是堿基互補的兩條鏈，W基因探針能與W基因中的一條單鏈進行堿基互補配對，因此W基因探針的堿基序列與W基因中某條單鏈的部分堿基序列相同或互補，B正確；染色體主要是由蛋白質(zhì)和DNA組成的，同時DNA是雙鏈結(jié)構(gòu)，而探針是單鏈DNA，因此去除染色體上的蛋白質(zhì)并將DNA變性為單鏈有利于DNA與探針完成雜交，C正確；DNA可與mRNA發(fā)生部分的堿基互補配對，因此若不去除mRNA，會對實驗結(jié)果產(chǎn)生干擾，D正確。二、非選擇題(本題共5小題，共60分)17．(10分)我們生活中已經(jīng)離不開傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)制作的食品，酸奶、果酒、果醋、霉豆腐、泡菜等極大地滿足了人們對飲食多元化發(fā)展的需求。(1)釀制果酒開始時要先通氣，其目的是________________________________。若要進一步檢測所得果酒中活體酵母菌的密度，可采用________________法，但此方法最終計算得出的菌體數(shù)往往比實際數(shù)目低。(2)食用醋的乙酸濃度通常在5%～8%，白酒的酒精濃度在38%～60%，一般情況下先有酒再有醋，但醋的價格往往比白酒低，試結(jié)合釀造工藝分析可能的原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________________(寫出一點即可)。(3)現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)霉豆腐要嚴格控制無菌環(huán)境，對豆腐滅菌宜采用______________法。從微生物培養(yǎng)的角度看，豆腐是________培養(yǎng)基，豆腐為主要菌種毛霉生長繁殖提供______________等營養(yǎng)物質(zhì)。解析：(1)釀制果酒開始時要先通氣，使酵母菌進行有氧呼吸進而大量繁殖，增加菌體數(shù)量，可減少發(fā)酵時間；若要進一步檢測所得果酒中活體酵母菌的密度，可采用稀釋涂布平板法，由于可能兩個或多個酵母菌共同形成一個菌落，其最終計算得出的菌體數(shù)往往比實際數(shù)目低。(2)食用醋的乙酸濃度通常在5%～8%，白酒的酒精濃度在38%～60%，一般情況下先有酒再有醋，但醋的價格往往比白酒低，根據(jù)二者的釀造工藝分析，其可能的原因是酒比醋需要的發(fā)酵產(chǎn)物量大；無色透明和有品質(zhì)保證的酒要通過蒸餾得到，而乙酸不用蒸餾得到等。(3)豆腐相當(dāng)于毛霉生長的培養(yǎng)基，所以滅菌的方法是高壓蒸汽滅菌法；從物理性質(zhì)上看，豆腐是固體培養(yǎng)基；培養(yǎng)基的成分一般包含水、無機鹽、碳源、氮源等，故豆腐為主要菌種毛霉生長繁殖提供水、無機鹽、碳源、氮源等營養(yǎng)物質(zhì)。答案：(1)讓酵母菌進行有氧呼吸從而大量繁殖稀釋涂布平板(2)酒比醋需要的發(fā)酵產(chǎn)物量大；無色透明和有品質(zhì)保證的酒要通過蒸餾得到，而乙酸不用蒸餾得到(寫出一點即可)(3)高壓蒸汽滅菌固體水、無機鹽、碳源、氮源18．(11分)某實驗室利用保加利亞乳桿菌和乳脂鏈球菌(均屬于乳酸菌)，采用固定化技術(shù)(將游離微生物固定在一定空間內(nèi))對單菌種發(fā)酵和雙菌種發(fā)酵進行了研究。實驗步驟如下，回答下列問題：表1pH對固定化發(fā)酵的影響pH6.56.05.55.04.5乳酸產(chǎn)量/g－4.957.814.70－表2單菌種與雙菌種固定化發(fā)酵菌種保加利亞乳桿菌乳脂鏈球菌雙菌種乳酸產(chǎn)量/g7.687.838.90表3雙菌種固定化方式對發(fā)酵的影響固定化方式分別固定，1∶1混合1∶1混合之后固定乳酸產(chǎn)量/g8.927.65注：以上表內(nèi)數(shù)據(jù)為100mL發(fā)酵液每小時的產(chǎn)酸量，發(fā)酵時間為3h。(1)乳酸菌屬于厭氧微生物，因此發(fā)酵時需要提供______條件；發(fā)酵所用的鮮牛奶中不能含有抗生素，原因是________________________________________________________________________________________________________________________________。(2)篩選乳酸菌高產(chǎn)菌株時可在固體培養(yǎng)基中加入碳酸鈣，培養(yǎng)一段時間后，選取菌落周圍__________________________，即為高產(chǎn)菌株。(3)將固定化細胞顆粒裝入滅菌的反應(yīng)器中，并加入滅菌牛奶，開始發(fā)酵。據(jù)表1中數(shù)據(jù)分析，一段時間后，乳酸產(chǎn)生的速度減慢的原因可能是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(4)據(jù)表2、表3中數(shù)據(jù)分析，對產(chǎn)酸最有利的發(fā)酵方式是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。解析：(1)乳酸菌屬于厭氧微生物，因此發(fā)酵時需要提供無氧條件；由于抗生素會抑制乳酸菌的活性，導(dǎo)致發(fā)酵失敗，因此發(fā)酵所用的鮮牛奶中不能含有抗生素。(2)篩選乳酸菌高產(chǎn)菌株時可在固體培養(yǎng)基中加入碳酸鈣，培養(yǎng)一段時間后，乳酸菌產(chǎn)生的乳酸可以將碳酸鈣分解形成透明圈，選取菌落周圍透明圈與菌落直徑比例大的，即為高產(chǎn)菌株。(3)將固定化細胞顆粒裝入滅菌的反應(yīng)器中，并加入滅菌牛奶，開始發(fā)酵。據(jù)表1中數(shù)據(jù)分析，發(fā)酵一段時間后，發(fā)酵液pH下降，乳酸菌活性受到抑制，乳酸產(chǎn)生的速度減慢。(4)據(jù)表2、表3中數(shù)據(jù)分析，采用雙菌種，先分別固定再1∶1混合發(fā)酵是對產(chǎn)酸最有利的發(fā)酵方式。答案：(1)無氧抗生素會抑制乳酸菌的活性，導(dǎo)致發(fā)酵失敗(2)透明圈與菌落直徑比例大的(3)發(fā)酵一段時間后，發(fā)酵液pH下降，乳酸菌活性受到抑制(4)采用雙菌種，先分別固定再1∶1混合發(fā)酵19．(12分)人誤食被金黃色葡萄球菌污染的食物后，可能出現(xiàn)腹瀉、嘔吐等癥狀。研究者嘗試用蜻蜓腸道共生菌的代謝產(chǎn)物開發(fā)新型抑菌藥物，部分實驗步驟如圖所示，圖中數(shù)字編號代表實驗步驟。(1)培養(yǎng)蜻蜓腸道共生菌的培養(yǎng)基配方如表所示。據(jù)表中信息和所學(xué)知識判斷，馬鈴薯為共生菌生長提供的營養(yǎng)成分包括________。馬鈴薯葡萄糖瓊脂水200.0g20.0g20.0g1000mLA.碳源 B．氮源C．無機鹽 D．生長因子(2)為避免雜菌污染，圖中實驗操作應(yīng)采用的正確方法是________。A.步驟①用自來水浸泡蜻蜓B．步驟②在超凈工作臺上操作C．步驟③加入蒸餾水研磨蜻蜓腸道D．實驗器材需要高壓滅菌(3)研究者分離出蜻蜓腸道菌株A，提取其代謝產(chǎn)物并用丙酮定容制成“藥液”。欲比較“藥液”與慶大霉素(用無菌水配制的抗生素溶液)對金黃色葡萄球菌的抑菌效果，請把下列實驗主要步驟填寫完整(所有實驗均在無菌環(huán)境操作)。實驗主要步驟：①將_______________________________________________________________均勻涂布在圖中所示的平板培養(yǎng)基上；②用無菌鑷子將分別浸過A、B、C液和無菌水的圓紙片瀝干后均勻置于上述培養(yǎng)基表面。A、B、C液分別為____________________________________________________________；③在恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)一段時間后，檢測“因變量”的方法是________________________________________________________________________；④為使實驗結(jié)果更準確的做法是_________________________________________。解析：(1)馬鈴薯中含有糖類、蛋白質(zhì)、少量脂肪和礦物質(zhì)等，如題表所示的培養(yǎng)基中，馬鈴薯可為共生菌生長提供碳源、氮源、無機鹽、生長因子。(2)自來水中有雜菌，步驟①應(yīng)該用無菌水浸泡蜻蜓，A錯誤；超凈工作臺是一種提供局部無塵無菌工作環(huán)境的空氣凈化設(shè)備，為防止雜菌污染，步驟②在超凈工作臺上操作，B正確；步驟③加入無菌水研磨蜻蜓腸道，C錯誤；為防止雜菌污染，實驗器材需要高壓滅菌，D正確。(3)欲比較“藥液”與慶大霉素(用無菌水配制的抗生素溶液)對金黃色葡萄球菌的抑菌效果，則實驗的自變量為抑菌液的種類，因變量為抑菌效果，具體的實驗步驟為①將稀釋的金黃色葡萄球菌“菌液”均勻涂布在題圖中所示的平板培養(yǎng)基上；②用無菌鑷子將分別浸過丙酮溶液、相同濃度的“藥液”和慶大霉素以及無菌水的圓紙片瀝干后均勻置于上述培養(yǎng)基表面；③因變量為抑菌效果，金黃色葡萄球菌若受到抑菌液的抑制，則圓紙片周圍會出現(xiàn)清晰區(qū)，因此可用直尺測量每個圓紙片周圍清晰區(qū)的寬度，并記錄，從而檢測因變量；④為使實驗結(jié)果更準確，應(yīng)遵循實驗的平行重復(fù)原則，重復(fù)上述實驗步驟多次，并對各組測量的數(shù)據(jù)求平均值。答案：(1)ABCD(2)BD(3)①稀釋的金黃色葡萄球菌“菌液”②丙酮溶液、相同濃度的“藥液”和慶大霉素③用直尺測量每個圓紙片周圍清晰區(qū)的寬度，并記錄④重復(fù)上述實驗步驟多次，并對各組測量的數(shù)據(jù)求平均值20．(13分)已知某病毒的S抗原基因編碼的S蛋白是感染人體細胞的主要抗原，研究人員利用S蛋白制備單克隆抗體，其制備流程如下圖：(1)該病毒中含有RNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等多種物質(zhì)，進行①過程時，利用的是這些物質(zhì)在____________________________方面存在的差異性進行RNA的提取。②過程所需酶是________________。檢測④過程是否獲得成功的方法是________________。(2)⑤⑥利用基因工程技術(shù)制備了可以無限增殖的細胞，⑥常采用________________法。細胞Y的特點是________________________________________________________________________。為確保細胞Y在無菌的環(huán)境中培養(yǎng)，除了對培養(yǎng)液和培養(yǎng)用具進行滅菌處理外，還需在培養(yǎng)液中加入一定量的________________。在體外進行懸浮培養(yǎng)時需要用____________法來收集Y細胞，再進行分瓶培養(yǎng)。(3)我國某科研團隊成功開發(fā)了一種以人復(fù)制缺陷腺病毒為載體的重組病毒基因疫苗。制備該基因疫苗過程中常利用________技術(shù)擴增S抗原基因，為了便于S抗原基因與腺病毒載體連接，需要在引物的5′端加上________________位點。解析：(1)RNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等多種物質(zhì)在物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)上存在差異，可以利用這種差異提取RNA。②過程為在RNA的指導(dǎo)下合成DNA的過程，因此，該過程為逆轉(zhuǎn)錄，該過程需要在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下完成。④過程為獲得病毒S蛋白的過程，要檢測是否成功獲得S蛋白，需要用抗原—抗體雜交的方法。(2)⑥過程為將帶有無限增殖調(diào)控基因的質(zhì)粒導(dǎo)入細胞X的過程，常用的方法為顯微注射技術(shù)，細胞X為漿細胞，經(jīng)過⑥過程的X細胞若成功導(dǎo)入了無限增殖調(diào)控基因，則細胞X將無限增殖。結(jié)合圖中信息可知，細胞Y應(yīng)該能夠無限增殖并且能夠合成并分泌與S蛋白發(fā)生特異性結(jié)合的抗體?？股啬芤种萍毦纳L，所以為確保細胞Y在無菌的環(huán)境中培養(yǎng)，除了對培養(yǎng)液和培養(yǎng)用具進行滅菌處理外，還需在培養(yǎng)液中加入一定量的抗生素。在體外進行懸浮培養(yǎng)時需要用離心法來收集Y細胞，再進行分瓶培養(yǎng)。(3)已知病毒的S抗原基因編碼的S蛋白在感染人體細胞的過程中起到關(guān)鍵作用。制備腺病毒載體病毒疫苗時，首先需要在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以病毒的遺傳物質(zhì)RNA為模板經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄得到S抗原基因。利用PCR技術(shù)擴增S抗原基因，為了便于S抗原基因與腺病毒載體連接，需要在引物的5′端加上限制酶切割位點。答案：(1)物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)逆轉(zhuǎn)錄酶抗原－抗體雜交技術(shù)(2)顯微注射既能快速大量繁殖又能產(chǎn)生特異性抗體抗生素離心(3)PCR限制酶切割21．(14分)棉鈴蟲和蚜蟲是常見的植物害蟲，Cry1A基因的表達產(chǎn)物對棉鈴蟲等鱗翅目昆蟲有較強的毒性，GNA基因的表達產(chǎn)物對蚜蟲等刺吸式口器的昆蟲有較強的毒性?？蒲腥藛T將Cry1A基因與GNA基因連接在一起，構(gòu)建了雙抗蟲基因的重組表達載體，并轉(zhuǎn)入煙草細胞，獲得了具有雙抗性的轉(zhuǎn)基因煙草，其部分過程如圖1所示，請分析并回答以下問題：注：Klenow能將黏性末端轉(zhuǎn)變?yōu)槠侥┒?；圖中不同限制酶切出的黏性末端均不同。(1)過程③將Cry1A基因與GNA基因相連，可選用______________(填“E.coliDNA連接酶”或“T4DNA連接酶”)。(2)過程④應(yīng)該選用______________(填圖中限制酶)切割植物表達載體，以便和目的基因相連，形成重組表達載體。(3)將重組表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌之前，一般先用________處理農(nóng)桿菌，使其成為____________細胞。(4)讓農(nóng)桿菌侵染煙草葉片前，需要通過實驗篩選農(nóng)桿菌：將培養(yǎng)農(nóng)桿菌的培養(yǎng)基倒平板后均分為A、B兩組，在A組培養(yǎng)基中涂布一定量的鏈霉素，在B組培養(yǎng)基中涂布等量的卡那霉素和鏈霉素。往A組培養(yǎng)基中接種適量農(nóng)桿菌，待長出菌落后，用影印法接種到B組培養(yǎng)基上，實驗結(jié)果如圖2，其中________(填圖中對應(yīng)的數(shù)字)菌落對應(yīng)的農(nóng)桿菌可能是符合要求的，即含有____________________的農(nóng)桿菌。(5)通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)農(nóng)桿菌侵染的煙草葉片，獲得煙草幼苗，此技術(shù)依據(jù)的原理是________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。欲從個體水平檢測這些植株是否成功導(dǎo)入目的基因，方法是________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。解析：(1)過程①和②分別用不同的限制酶切割Cry1A基因與GNA基因，形成的黏性末端是不同的，故兩個基因無法直接相連，經(jīng)Klenow處理后，兩個基因片段一端的黏性末端變?yōu)槠侥┒?。E.coliDNA連接酶只能連接黏性末端，T4DNA連接酶可以連接黏性末端，也可以連接平末端，故過程③將Cry1A基因與GNA基因相連，應(yīng)選用T4DNA連接酶。(2)通過過程③得到的雙抗蟲基因(Cry1A基因＋GNA基因)兩側(cè)分別是EcoRⅠ和HindⅢ切出的黏性末端，故過程④應(yīng)該選用EcoRⅠ和HindⅢ切割植物表達載體，形成和目的基因相同的黏性末端，以便讓植物表達載體與目的基因相連，形成重組表達載體。(3)將重組表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌之前，一般先用Ca2＋處理農(nóng)桿菌，使其成為感受態(tài)細胞，以利于重組表達載體進入農(nóng)桿菌。(4)讓農(nóng)桿菌侵染煙草葉片前，需要通過實驗篩選農(nóng)桿菌，獲得含有重組表達載體的農(nóng)桿菌。由于HindⅢ的切割位點在抗卡那霉素基因內(nèi)部，故含有重組表達載體的農(nóng)桿菌可以在含有鏈霉素的培養(yǎng)基上生長，不能在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上生長。據(jù)此分析可知，A組中1、3對應(yīng)的菌株為含有重組表達載體的農(nóng)桿菌，2、4、5對應(yīng)的菌株為含有植物表達載體的農(nóng)桿菌。(5)植物組織培養(yǎng)技術(shù)依據(jù)的原理是植物細胞具有全能性。從個體水平檢測目的基因是否成功導(dǎo)入受體細胞，可將適量的棉鈴蟲和蚜蟲接種到轉(zhuǎn)基因植株上，觀察其是否具有抗蟲特性。答案：(1)T4DNA連接酶(2)EcoRⅠ和HindⅢ(3)Ca2＋感受態(tài)(4)1、3重組表達載體(5)植物細胞的全能性將適量的棉鈴蟲和蚜蟲接種