淋巴細胞表面抗原檢測1113碩士班課件

淋巴細胞外表抗原檢測--免疫熒光法2021-11-13碩士班2根本概念

所有參與免疫應(yīng)答以及與免疫應(yīng)答相關(guān)的細胞均被稱為免疫細胞。

包括淋巴細胞、單核-巨噬細胞、DC、各種粒細胞、紅細胞、肥大細胞、干細胞。3免疫細胞別離方法：根據(jù)不同免疫細胞外表標志:FACS、MACS根據(jù)細胞理化性質(zhì)：1〕根據(jù)細胞比重差異：自然沉降法、密度梯度離心法、改變細胞密度法2〕根據(jù)細胞黏附特性：B細胞黏附于尼龍棉3〕根據(jù)細胞對滲透壓變化的敏感度：紅細胞對低滲敏感淋巴細胞是指在適應(yīng)性免疫中起關(guān)鍵作用的白細胞，由淋巴器官產(chǎn)生，機體免疫應(yīng)答功能的重要細胞成分。主要指B淋巴細胞和T淋巴細胞，二者外表抗原受體具有高度多樣性，經(jīng)抗原激發(fā)可分化為抗原特異性效應(yīng)細胞，分別介導體液免疫和細胞免疫。淋巴器官根據(jù)其發(fā)生和功能的差異可分為：中樞淋巴器官〔又名初級淋巴器官〕：包括胸腺、腔上囊或其相當器官。它們無須抗原刺激即可不斷增殖淋巴細胞，成熟后將其轉(zhuǎn)送至周圍淋巴器官。周圍淋巴器官〔又名次級淋巴器官〕：包括脾、淋巴結(jié)等。成熟淋巴細胞需依賴抗原刺激而分化增殖，繼而發(fā)揮其免疫功能。在此我們將要討論CD4+

和CD8+

T淋巴細胞檢測的方法和意義。2023/11/21淋巴細胞5T淋巴細胞是機體免疫系統(tǒng)中的主要調(diào)節(jié)及效應(yīng)細胞，在正常機體內(nèi)各淋巴細胞亞群相互作用，可通過對抗原識別、處理、遞呈引起多種細胞因子同多種細胞之間的網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系，構(gòu)成維持免疫功能的生理平衡，維持著機體正常免疫功能。當不同淋巴細胞亞群的數(shù)量和功能發(fā)生異常時，可導致機體免疫功能紊亂并發(fā)生一系列病理變化。因此，Ｔ淋巴細胞亞群的免疫分型能夠提供有關(guān)患者免疫狀態(tài)的重要信息。T淋巴細胞2023/11/21早期將T細胞中的CD4+T細胞分為Thl和Th2兩個亞群。Thl細胞通過分泌IL-2、、IL-12、IFN-γ和TNF-

α等細胞因子，介導與細胞毒和局部炎癥有關(guān)的免疫應(yīng)答，參與細胞免疫及遲發(fā)型超敏反響。在抗感染、抗腫瘤反響中發(fā)揮重要作用。Th2細胞那么通過分泌IL-4、IL-5、

IL-6、IL-10和IL13等細胞因子，其主要功能為刺激B細胞增殖并產(chǎn)生抗體，促進機體的體液免疫應(yīng)答。2023/11/21調(diào)節(jié)T細胞(Treg細胞)也是近年來認識的一種重要的免疫調(diào)節(jié)細胞，CD4+T細胞在TGF-β單獨的誘導下那么而分化成Treg細胞，分泌TGF-β并表達Foxp3，參與免疫的調(diào)節(jié)。Thl7是一種能產(chǎn)生IL-17卻不產(chǎn)生IFN-γ和IL-4的CD4+T細胞，目前的研究證實了TGF-β和IL-6在Thl7細胞分化啟動過程中的重要作用。同時，轉(zhuǎn)錄因子STAT3和RORγt，在Thl7的分化過程中也起著重要的調(diào)節(jié)作用。2023/11/21Th1/Th2

亞群及其相互之間的平衡在免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵的作用，Th1/Th2

平衡的失調(diào)與多種疾病的發(fā)生開展和預(yù)后有著密切的關(guān)系。目前已發(fā)現(xiàn)許多感染性疾病、自身免疫性疾病、過敏性疾病以及移植排斥反響等都與Th1/Th2

平衡有關(guān)。建立穩(wěn)定有效的細胞內(nèi)因子檢測方法對于準確說明Th1/Th2細胞的作用非常重要。目前檢測的主要方法：酶聯(lián)免疫法、ELISPOT法、熒光定量法及原位雜交等方法。2023/11/21分化抗原cIusterofdifferentiation,CD不同譜系細胞在分化、成熟、活化過程中,出現(xiàn)或消失的細胞外表標志。細胞外表標志通常用單克隆抗體來識別。每個抗體都有指定的CD編號,能被特定抗體識別的特定抗原通常具有相同的編號,例如,被“CD1抗體〞識別的抗原稱為“CD1抗原〞。CD4細胞，作為淋巴細胞的一種，是人體中調(diào)控免疫系統(tǒng)最重要的樞紐細胞，其數(shù)量能夠最直接的反響人體免疫功能的狀態(tài)。CD4細胞檢測廣泛應(yīng)用于對人體免疫功能狀況的評估，有助于腫瘤、糖尿病、冠心病、艾滋病等疾病的早期發(fā)現(xiàn)及臨床診療2023/11/21人體內(nèi)的淋巴細胞在光學顯微鏡下的形態(tài)根本是一樣的，但其功能各異，對T細胞、B細胞和醞細胞及其有關(guān)的亞群的相應(yīng)外表標志檢測，藉以判斷機體的免疫水平。一、T淋巴細胞外表標志的檢測T細胞外表標志抗體致敏細胞花環(huán)法免疫細胞化學法免疫熒光法T細胞亞群檢測

2023/11/21T細胞外表標志

T細胞是參與機體細胞免疫反響和在免疫應(yīng)答反響中起主導調(diào)節(jié)作用的一組免疫細胞。所有的T細胞均有共同的標志性抗原，不同功能的T細胞亞群又具有各自的標志性抗原。最常用單克隆抗睞鑒定和檢測計數(shù)T細胞及亞群的外表標志抗體致敏細胞花環(huán)法

用相應(yīng)的抗CD3單克隆抗體吸附于醛化的紅細胞(致敏)，當其與受檢的細胞混勻后，結(jié)合有蘭細胞的單抗與待測細胞上的CD3抗原結(jié)合形成橋聯(lián)，由于參加的紅細胞多于受檢細胞，陽性的受程細胞能與致敏的紅細胞結(jié)合而形成玫瑰把戲的花環(huán)，凡受檢細胞周圍黏附3個和3個以上紅細胞牽為花環(huán)形成細胞，計算花環(huán)形成細胞與計數(shù)淋巴細胞之比。

2023/11/21免疫細胞化學法

通常以酶作為抗體標記物，采用細胞酶免疫組化技術(shù)完成，并常采用生物素一鏈霉親合素放大系統(tǒng)提高靈敏度。該類方法可用普通顯微鏡觀察，凡著色的細胞即為相應(yīng)CD抗原陽性的細胞，計算陽性細胞占總計數(shù)細胞的百分率進行定量分析。免疫熒光法

本法是將別離得的外周血單個核細胞與相應(yīng)的以熒光物質(zhì)標記的CD單克隆抗體作用(直掃法)，或與抗相應(yīng)CD單克隆抗體作用后，洗去游離的抗體，繼而參加熒光素標記的抗小鼠IgG抗皿清，經(jīng)溫育結(jié)合后，洗去多余的標記抗體(間接法)，制片后用熒光顯微鏡觀察結(jié)果，計算陽性細胞占總計數(shù)細胞的百分率。如有條件，采用流式細胞儀計數(shù)，結(jié)果客觀準確。

2023/11/21T細胞亞群檢測

采用三色標記單克隆熒光抗體標記單個核細胞懸液，用流式細胞儀進行檢測分析，可對

T細胞及亞群作出精確分類。2023/11/21免疫細胞定量檢測，如T淋巴細胞亞群〔CD3、CD4、CD8等〕檢測，能精確觀察免疫細胞數(shù)值變化，評估免疫狀況。通常采用流式細胞儀法，特別針對CD4細胞檢測，此方法已被稱作“金標準〞。T淋巴細胞亞群檢測T淋巴細胞檢測免疫細胞活性檢測，如T淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗，根據(jù)淋巴細胞轉(zhuǎn)化程度測定免疫應(yīng)答功能，但功能檢測仍需結(jié)合細胞定量檢測，結(jié)果更可靠。流式細胞儀T細胞外表標志及其亞群T細胞有兩大亞群：CD4+CD8+根據(jù)具體功能有分不同亞群：TdTiThTcTs受抗原或細胞因子激活就是活化的T細胞不同的活化細胞功能不同：Tc活化后成CTL主要殺傷被病毒感染的細胞或癌細胞，Ts活化主要抑制B細胞產(chǎn)生抗體和其他T細胞的分化，起調(diào)節(jié)免疫作用，Td活化那么適當多種淋巴因子導致炎癥，排除抗原，Th也主要協(xié)助其他免疫細胞發(fā)揮功能，是免疫應(yīng)答必不可少的。2023/11/21T細胞外表標志及其亞群

CD3+CD4+CD8-輔助性T細胞〔helpTcell,Th〕CD3+CD4-CD8+細胞毒性T細胞〔cytotoxicTcell,TcorCTL〕CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞〔regulatoryTcell,TrorTreg〕2023/11/2117SmIg、Fc受體、補體受體、EB病毒受體，局部CD分子是B細胞的重要外表標志，其中以SmIg為B細胞所特有，是鑒定B細胞可靠的指標。CD19/CD5分子：可將B細胞區(qū)分為B1細胞和B2細胞，B1細胞為CD19和CD5雙陽性，而B2細胞僅為CD19陽性，B2細胞為通常所指的B細胞。B細胞外表標志18

人類NK細胞外表標志主要以CD16、CD56來認定，臨床將CD3-CD56+CD16+淋巴細胞認定為NK細胞。NK細胞外表標志19流式細胞儀由激光光源系統(tǒng)，氣控單細胞層流系統(tǒng)，光檢測及信息處理系統(tǒng)和細胞別離純化系統(tǒng)組成。

流式細胞術(shù)(FCM)是一種對處在液流中的單個細胞或其它生物微?！踩缂毦车冗M行快速定量分析和分選的技術(shù)，它將免疫熒光與細胞生物學、流體力學、光學和電子計算機等多種學科的高新技術(shù)融為一體，進行細胞和分子水平的根底理論與臨床應(yīng)用研究。將熒光標記的單克隆抗體參加PBMC懸液內(nèi)，使二者特異性結(jié)合，通過流式細胞儀自動檢測，既可很快得到T、B細胞及其亞群百分率和絕對值的有關(guān)數(shù)據(jù)，又能以每秒高達5000個細胞(18×106細胞/h)的速度別離和收集無菌的淋巴細胞，純度可達90%～99%，細胞活性亦不受影響，可用于淋巴細胞的各種免疫生物學功能測定。FACS流式細胞術(shù)在流動的狀態(tài)中檢測細胞或顆粒的各項特性特異性強，靈敏度高，速度快，并能實現(xiàn)多參數(shù)分析可檢測的樣本種類多樣：外周血，骨髓，細胞穿刺液，洗脫液，實體組織，培養(yǎng)細胞，微生物2023/11/21流式細胞術(shù)檢測樣本0.4um40um流式細胞術(shù)檢測指標

流式細胞術(shù)提供的信息：

-相對細胞大小

-相對細胞顆粒密度和內(nèi)部復雜度

-染色過細胞的相對熒光強度細胞結(jié)構(gòu)細胞大小細胞粒度DNA含量與細胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量染色體分析細胞功能細胞外表/胞漿/核的特異性抗原細胞活性細胞內(nèi)細胞因子酶活性激素結(jié)合位點細胞受體細胞凋亡在上述信號根底上的細胞分選流式細胞術(shù)的應(yīng)用流式細胞儀組成液流系統(tǒng)：形成層流系統(tǒng)，聚焦細胞光學系統(tǒng)：產(chǎn)生和收集光學信號電子系統(tǒng)：光信號轉(zhuǎn)化為電信號，進行信號處理25熒光激活細胞別離儀別離法2023/11/21光學系統(tǒng)

激發(fā)光學系統(tǒng)包括:-激光器-透鏡和反射鏡，將激光引導到檢測區(qū)域收集光學系統(tǒng)包括:濾光片，將產(chǎn)生的光信號引導到對應(yīng)的光學接收器光學系統(tǒng)

激發(fā)光學系統(tǒng)包括:-激光器-透鏡和反射鏡，將激光引導到檢測區(qū)域收集光學系統(tǒng)包括:濾光片，將產(chǎn)生的光信號引導到對應(yīng)的光學接收器懸浮狀態(tài)的細胞單個流過流動室細胞被激發(fā)產(chǎn)生散射光和熒光信號信號被采集轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號存儲于電腦上液流系統(tǒng)光學系統(tǒng)電子系統(tǒng)前向散射光forwardanglelightscatterFALS、FSC、FS光學檢測器在入射光的正前方所收集的低角度光信號,與細胞或顆粒的大小和體積有關(guān)。側(cè)向散射光sidescatter,SSC光學檢測器在入射光的直角處所收集的細胞散射的光信號,與細胞或顆粒的內(nèi)部和外表結(jié)構(gòu)復雜程度有關(guān),如細胞質(zhì)顆粒性、膜不規(guī)那么性及核形等。2023/11/21熒光強度fluorescenceintensity結(jié)合到細胞或顆粒上的熒光素的量。熒光信號的通道數(shù)越大提示熒光強度越強。在恰當?shù)臈l件下,熒光強度與一個細胞和特定熒光素相結(jié)合的位點數(shù)相關(guān)。自發(fā)熒光autofIuorescence未染色細胞白身發(fā)出的熒光。通常由嘧啶和黃素核苷酸所產(chǎn)生,自發(fā)熒光的強度取決于激發(fā)光的波長,且隨所分析細胞的類型和(或)細胞活化狀態(tài)而改變。通過特殊的標本處理方法可以降低自發(fā)熒光的強度(如用結(jié)晶紫孵育)。2023/11/21顏色補償coIorcompensation由于一種熒光素發(fā)射的熒光疊加到其他熒光素發(fā)射的波長范圍內(nèi)而造成熒光信號重疊，通過在其他熒光信號中扣除已測定熒光信號的一局部而糾正顏色重疊造成的計數(shù)錯誤?？鄢臒晒饬渴怯们‘?shù)膯稳緦φ諄泶_定的。被校正的信號反映了單熒光信號的發(fā)射情況。設(shè)門gate在流式細胞儀顯示的象限圖上基于一組參數(shù)(如熒光對SSC、FSC/SSC等)來確定的所要分析的目的細胞群。對限定區(qū)內(nèi)的目的細胞群通過其他參數(shù)(如熒光參數(shù))進一步分析其表達情況。2023/11/21數(shù)據(jù)采集

三種數(shù)據(jù)：

-前向散射光FSC

-側(cè)向散射光SSC

-各種熒光散射光FL1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3，F(xiàn)L4當使用激光光源時，在前向方向〔和激光行進的方向相同〕上可用前向散射光接收通道接收到一定量的散射光前向散射光的強度是和細胞或其他檢測顆粒的大小、形狀密切相關(guān)的數(shù)據(jù)采集-前向散射光當激光光源被使用時，側(cè)向也有一定量的散射光產(chǎn)生，可以用90o

角的側(cè)向散射光檢測通道來采集側(cè)向散射光的強度和細胞或其他檢測顆粒的顆粒密度、內(nèi)部復雜程度密切相關(guān)數(shù)據(jù)采集-側(cè)向散射光外周全血細胞散射光雙參數(shù)點圖

顆粒雜質(zhì)、氣泡對檢測的影響細胞標記上熒光物質(zhì)后，這種熒光物質(zhì)要求特定波長的激發(fā)光來激發(fā)，同時發(fā)出特定波長的光熒光物質(zhì)被激發(fā)以后產(chǎn)生的發(fā)射光將由特定的熒光通道來接收特定檢測是通過光學濾片和透鏡來控制的數(shù)據(jù)采集-熒光信號熒光強度是和細胞上標記上的熒光染料的量正相關(guān)數(shù)據(jù)采集電壓

信號放大方式：log、lin信號類型：A,W,H電壓的調(diào)節(jié):根據(jù)陰性對照管來調(diào)節(jié)閾值可以以任意參數(shù)及多個參數(shù)的組合作為閾值大多數(shù)樣本都可以設(shè)定FSC/SSC閾值以下的信號不存儲根據(jù)陰性對照管來調(diào)節(jié)目的是將不需要的雜質(zhì)信號，噪音信號，無用的細胞信號等扣除，使收集到的都是有用信號補償

補償方式：任意兩個通道之間，可以采用手動或自動補償。補償?shù)恼{(diào)節(jié):根據(jù)單染對照管來調(diào)節(jié)數(shù)據(jù)分析流式數(shù)據(jù)直方圖散點圖等高線圖密度圖三維圖統(tǒng)計數(shù)據(jù)直方圖直方圖(DistributionHistogram)橫坐標代表熒光信號或散射光信號相對強度，單位是對數(shù)，可以是線性或?qū)?shù)坐標?？v坐標一般是細胞數(shù)。散點圖散點圖(DotPlot)X坐標為該細胞一參數(shù)相對含量，Y坐標為該細胞另一參數(shù)的含量，可以將細胞亞群分開。等高線圖和密度圖三維圖統(tǒng)計數(shù)據(jù)Events百分比平均熒光強度熒光中位值CVSD……數(shù)據(jù)獲取與分析電壓閾值補償獲得數(shù)據(jù)畫圖設(shè)門統(tǒng)計熒光素標記的單克隆抗體采用熒光素直接標記的單克隆抗體(單抗)，稱直標抗體。選擇直標抗體是淋巴細胞亞群分析的關(guān)鍵步驟,要考慮所選抗體對細胞的反響性。單抗CD45、CD3、CD4、CD8、CD19、CD16、CD56。2023/11/21單抗對細胞的反響性CD45表達于所有白細胞;CD3表達于T淋巴細胞;CD4表達于T輔助/誘導淋巴細胞(CD4+T細胞)和單核細胞;CD8表達于細胞毒T細胞(CD8-T)和NK細胞;CD19表達于B淋巴細胞;CD16表達于NK細胞、單核巨噬細胞、粒細胞和樹突狀細胞等;CD56表達于NK細胞和細胞毒T細胞。單抗對淋巴細胞亞群的鑒定CD4、CD8、CD16和CD56單抗均不能特異性標記淋巴細胞某一亞群。采用CD45和(或)CD3作為設(shè)門抗體,同時兼做質(zhì)控試劑。CD3+T細胞標記為CD3+,CD4+T細胞標記為CD3+CD4+CD8+T細胞標記為CD3+CD8+B細胞標記為CD3-CD19+NK細胞標記為CD3-CD56+或CD3ˉCD(16+56)+2023/11/21直標抗體常用熒光染料異硫氰酸熒光素(FITC)藻紅蛋白(PE/RD1)藻紅蛋白偶聯(lián)物(PECY5)多甲藻葉綠素蛋白(PerCP)藻紅蛋白-德州紅偶聯(lián)物(ECD)別藻青蛋白(APC)除別藻青蛋白(APC)外,其他熒光染料均采用488nm的激發(fā)光源激發(fā),最大發(fā)射波長分別為525nm、575nm、670nm、675nm和613nm。別藻青蛋白(APC)的激發(fā)光源為630nm,最大發(fā)射波長為660nm。2023/11/21溶血素使用與儀器相匹配的溶血素(內(nèi)含固定液),并嚴格按照使用說明和本卷須知進行操作。如果使用沒有固定作用的溶血劑(如氯化銨和低滲緩沖液等),染色后標本需要保存在4℃,并在1h內(nèi)完成上機固定液0.1%-2.0%多聚甲醛或甲醛緩沖液是常用的固定液,用于對感染的標本在分析前進行滅活,能夠滅活HIV等病毒的3個-5個對數(shù)級的病毒載量。在染色過程中的最后一次離心后,用含有多聚甲醛或甲醛緩沖液(Ph7.0-7.4)處理,4℃保存待測。2023/11/2156流式細胞分析儀1973年BD公司與StanfordUniversity合作開發(fā)世界上第一臺商用流式細胞儀FACSI。

1980年北京師范大學引進中國第一臺流式細胞儀FACSIII。實驗應(yīng)用

流式細胞儀主要有兩個最根本的用途：可以定量分析鑒定活細胞外表表達的特異分子，進行特定的活細胞群的別離和純化。2023/11/21免疫細胞群的分類

靜止淋巴細胞之間從其外觀形態(tài)難以區(qū)分，都是以致密的核及少量細胞質(zhì)組成的小而圓的細胞為特征。然而，這些細胞確是由功能各異的不同細胞亞群所組成，各種細胞群表達各自特殊的外表分子。B淋巴細胞上表達有特異的膜外表免疫球蛋白〔mIg〕，而成熟的T淋巴細胞外表表達特異的CD3分子。T淋巴細胞又可進一步按其表達的不同外表標志細分成不同的亞群，如CD4+CD8-和CD4-CD8+亞群。因此，可由這些特征性的外表標志，將細胞分為不同的群或亞群。2023/11/21免疫細胞的分化發(fā)育

免疫細胞分化發(fā)育的不同階段，其外表標志也在不斷地發(fā)生著變化。如胸腺細胞〔發(fā)育過程中的T淋巴細胞〕，在發(fā)育的不同階段從不成熟到成熟，其外表標志經(jīng)歷了從雙陰性〔CD4-CD8-〕到雙陽性〔CD4-CD8-〕，直到單陽性〔CD4+CD8-或CD4-CD8+〕的過程。正常生理狀態(tài)下，發(fā)育不同階段的胸腺細胞以一定的比例存在于胸腺中。通過檢測這些標志，即可判定某些因素〔基因突變等〕對胸腺細胞發(fā)育的影響。2023/11/21

免疫細胞的分子表達

免疫細胞的不同因素的影響下，其表達的分子也會發(fā)生變化。通過檢測這些分子的變化，可分析細胞功能以及細胞分化狀態(tài)等。靜止的T淋巴細胞不表達或低水平表達CD69分子；而一經(jīng)活化，其表達CD69分子數(shù)量明顯增加?？赏ㄟ^檢測這些活化標志的變化來判定細胞狀態(tài)以及研究影響細胞活化狀態(tài)的因素。2023/11/21器材10ml圓底試管，F(xiàn)ACs專用離心管，滴管，吸管血