發(fā)酵中草藥中有機肥料添加劑的篩選

發(fā)酵中草藥中有機肥料添加劑的篩選

中藥補藥劑屬于天然藥物。根據(jù)大量研究，中藥補藥劑可以促進動物生長發(fā)育，提高飼料利用率，改善動物產(chǎn)品，提高動物免疫功能（李洪龍等，2007；劉根新等，2007；王立輝等，2007；李宗輝等，2002；唐安倫等，2000）。他的研究和應(yīng)用引起了國內(nèi)外研究人員的關(guān)注。但由于中草藥飼料添加劑的應(yīng)用和研究存在用藥成分復(fù)雜、含量低、適口性差、效果不穩(wěn)定、用量大且難以掌握、毒副作用等問題,阻礙了中草藥飼料添加劑的規(guī)模化推廣應(yīng)用。微生物發(fā)酵中草藥飼料添加劑是利用微生物的降解作用,將中草藥中的有效成分、活性物質(zhì)最大限度地釋放出來,并對中草藥活性成分進行修飾產(chǎn)生新的活性物質(zhì)。微生物在生長代謝過程中,可以產(chǎn)生各種各樣的防病助生長的次生代謝產(chǎn)物,可將動物難以消化吸收的大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化成易于吸收的小分子物質(zhì),還可產(chǎn)生各種不同的酶,從而促進動物生長發(fā)育,縮短飼養(yǎng)周期,提高飼料報酬率,增強藥效和降低飼養(yǎng)成本等。本文采用從不同中草藥中分離能夠發(fā)酵中草藥的微生物,對中草藥復(fù)方進行發(fā)酵,并測定了中草藥復(fù)方發(fā)酵前后抑菌活性和纖維素酶、酸性蛋白酶活力的變化規(guī)律,以期為開發(fā)發(fā)酵型中草藥飼料添加劑提供依據(jù)。1材料和方法1.1汽車東南角文獻中藥:青蒿、魚腥草、地骨皮、黃岑、貫眾、膽草、石菖蒲、夏枯草、紫草、金銀花、板藍根等中草藥,購于長沙市汽車東站中藥材市場,無霉變和蟲蛀。低溫烘干,粉碎后,過40目篩,備用。供試菌株:大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、普通變形桿菌(Proteusvulgaris)。1.2培養(yǎng)基1.2.1制備澄清液稱取適量的中草藥飼料添加劑復(fù)方,加入20倍的蒸餾水,煎煮30min后粗過濾,取濾液于8000r/min離心15min,取上清液,減壓濃縮5倍,備用。1.2.2細菌的分離培養(yǎng)基牛肉膏0.5%,蛋白胨1%,NaCl0.5%,中草藥飼料添加劑水煮液5%,瓊脂粉1.5%,pH7.2~7.5。1.2.3蘑菇的分離培養(yǎng)基馬丁氏固體培養(yǎng)基(沈萍和陳向東,2007)中加入0.8%去氧膽酸鈉和5%中草藥飼料添加劑水煮液,pH自然。1.2.4液體種子培養(yǎng)葡萄糖5%,豆餅粉1.5%,酵母粉0.5%,KH2PO40.2%,MgSO4·7H2O0.1%,CaCO30.4%。1.2.5酶3%,葡萄糖3%,kh2po3.3%,f33.5%,f33.3%,f7.2o中草藥飼料添加劑復(fù)方90%,麥麩5%,葡萄糖3%,(NH4)2SO41.5%,KH2PO40.3%,MgSO4·7H2O0.2%。1.3方法1.3.1中草藥稀釋液的稀釋分別稱取10g粉碎至40目的青蒿、魚腥草、地骨皮、黃岑、貫眾、膽草、石菖蒲、夏枯草等不同中草藥于90mL帶有玻璃珠的無菌水中,振蕩15min后,適當(dāng)稀釋。分別取0.1mL不同稀釋度的中草藥稀釋液于細菌和霉菌分離培養(yǎng)基平板中央,涂布均勻。細菌平板在37℃培養(yǎng)48h,霉菌平板在28℃恒溫培養(yǎng)3~5d進行初篩。將初篩得到的菌株采用平板劃線法分離純化后,分別接種于加有20%中草藥飼料添加劑浸煮液的細菌和霉菌培養(yǎng)基中進行復(fù)篩,將復(fù)篩得到的菌株于4℃冰箱中保存待用。1.3.2實驗培養(yǎng)液體種子菌種活化:將供試菌株和Y-1接種于牛肉膏蛋白胨和PDA培養(yǎng)基斜面上,分別置于37℃和28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48~72h,備用。液體種子培養(yǎng):將培養(yǎng)成熟的斜面菌種Y-1接種于液體種子培養(yǎng)基中,28℃,180r/min條件下培養(yǎng)72h。中草藥飼料添加劑的發(fā)酵:按配方稱取中草藥飼料添加劑發(fā)酵培養(yǎng)基30g于250mL三角瓶中,自來水調(diào)節(jié)含水量50%,充分拌勻,110℃滅菌30min后,按10%(V/m)的接種量接種培養(yǎng)好的液體種子,28℃培養(yǎng)96h,50℃烘干。同時以接種無菌水為對照。1.3.3y-1霉菌發(fā)酵中草藥飼料添加劑的抑菌效果及產(chǎn)酶規(guī)律培養(yǎng)方法同1.3.2,替換不同的條件,如中藥與麥麩的不同比例、碳源的種類、氮源的含量、起始pH值、含水量、溫度等,考察Y-1霉菌發(fā)酵中草藥飼料添加劑后對抑菌效果的影響及Y-1霉菌的產(chǎn)酶規(guī)律。1.3.4中草藥活性成分的制備和酶活測定發(fā)酵樣品處理:稱取10g不同菌種的發(fā)酵物和各組對照物,加入200mL蒸餾水,煮沸15min后,3000r/min離心15min,收集上清液,殘渣加入200mL蒸餾水提取后,離心,合并上清液,真空減壓濃縮至每毫升含1g生藥。抑菌試驗:取培養(yǎng)16~18h的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和鼠傷寒沙門氏菌新鮮培養(yǎng)液5mL,分別加入100mL冷卻至50℃左右的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中,混合均勻后,在直徑為9cm的標準培養(yǎng)皿中準確吸入15mL含菌培養(yǎng)基,冷卻成含菌平板。每個平板上放置3個滅菌的牛津杯,牛津杯中加入40μL中草藥飼料添加劑發(fā)酵浸提液。37℃培養(yǎng)24h,測定抑菌圈的大小。每處理設(shè)3次重復(fù)。同時以未接種的為對照。酶活測定:(1)粗酶液制備:稱取經(jīng)低溫烘干的固體中草藥發(fā)酵劑1.00g于100mLpH4.8的磷酸緩沖液中,40℃浸提2h,濾紙過濾,4000r/min離心15min,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?2)纖維素酶活力測定:參照Vallander和Erik(1985)提供的方法并略作修改進行測定。(3)羧甲基纖維素酶(CMCase)活力測定:于25mL具塞試管中加入濃度為1%CMC-Na-醋酸緩沖液(pH4.8)1.8mL,加入0.2mL粗酶液,50℃保溫30min后,加入3.0mLDNS試劑,水浴煮沸5min,冷卻后用蒸餾水定容,搖勻,于540nm處測定光密度值。酶活定義:在反應(yīng)條件下,30min水解羧甲基纖維素鈉產(chǎn)生1mg葡萄糖的酶量為一個酶活力單位(U);(4)FPA活力測定:于25mL具塞試管中加入pH4.8的醋酸緩沖液1.8mL、新華濾紙50.0mg以及酶液0.2mL,50℃保溫60min后,加入3.0mLDNS試劑,其他同CMCase酶活測定。酶活定義:在反應(yīng)條件下,每60min水解濾紙產(chǎn)生1mg葡萄糖的酶量為一個酶活力單位(U)。(5)酸性蛋白酶活力測定:參照姜錫(1999)提供的方法進行測定。2結(jié)果與分析2.1微生物菌株分離從青蒿、魚腥草、地骨皮、黃岑、貫眾、膽草、石菖蒲、夏枯草等中草藥中共分離出22株微生物菌株,其中細菌14株,霉菌8株。將純化的菌株點種在含藥濃度逐步遞增的固體培養(yǎng)基平板上,通過多次反復(fù)篩選,得到一株在中藥復(fù)方中生長良好、發(fā)酵能力較強的菌株,初步鑒定為米曲霉Y-1。2.2不同麥麩混養(yǎng)成分對菌株抑菌效果的影響分別配制中藥與麥麩不同比例(9∶1、8∶2、7∶3、6∶4)的發(fā)酵培養(yǎng)基,按10%(V/W)接種量接種Y-1種子培養(yǎng)液,28℃恒溫培養(yǎng)72h,測定酶活,同時提取發(fā)酵液進行抑菌實驗,結(jié)果見表1、圖1。從表1可以看出,中草藥飼料添加劑中添不同比例的麥麩發(fā)酵后對四種供試菌的抑菌效果都有不同程度的增加。當(dāng)中草藥飼料添加劑與麥麩的比例為7∶3時,發(fā)酵物料的蒸煮液對S.aureus、S.tyhimurium、E.coli、P.vulgaris的抑菌效果分別增加38.61%、22.32%、27.93%和11.4%。從產(chǎn)酶效果來看(如圖1),在一定范圍內(nèi),隨著麥麩比例的增加,纖維素酶的活力增強,當(dāng)中草藥飼料添加劑與麥麩的比例為7∶3時,CMCase酶活達9870U/g,FPA酶活為892U/g,主要原因為中草藥中含有大量的纖維素,能夠誘導(dǎo)真菌纖維素酶的分泌,高纖維素酶活力可以破壞中草藥的細胞壁,導(dǎo)致中草藥有效成分的充分釋放,從而提高了中草藥發(fā)酵后的抑菌效果。而蛋白酶的酶活隨著麥麩含量的增加而增加,主要原因為麥麩中含有一定量的蛋白質(zhì),可以誘導(dǎo)蛋白酶的合成和分泌。綜合抑菌效果和各種酶的含量,以下試驗均選擇中草藥飼料添加劑和麥麩的比例為7∶3。2.3添加不同碳源對發(fā)酵中草藥飼料添加劑抑菌效果的影響在其他條件相同的情況下,向培養(yǎng)基中分別加入1%的蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖、葡萄糖,以不加其他碳源為對照,28℃恒溫培養(yǎng)120h,測定纖維素酶和蛋白酶的酶活,并測定抑菌活力。結(jié)果分別見表2和圖2。從表2中可知,發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適量的不同碳源,可以明顯提高發(fā)酵中草藥飼料添加劑的抑菌效果。在添加的四種碳源中,以添加葡萄糖的處理,發(fā)酵物料蒸煮液的抑菌效果最好,其次是蔗糖。與對照相比,添加葡萄糖對S.aureus、S.tyhimurium、E.coli、P.vulgaris的抑菌效果分別提高了18.6%、24.79%、31.48%、17.6%。從圖2中可以看出,葡萄糖為碳源時,發(fā)酵后物料的CMCase酶、FPA酶和蛋白酶的活力最高,分別達到9017、1062U/g和7793U/g,蔗糖次之。說明在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適量葡萄糖,可以促進霉菌Y-1的生長和酶的分泌。2.4培養(yǎng)溫度對fpa活性的影響將中草藥飼料添加劑培養(yǎng)物分別置于不同的溫度(28、30、32、35℃和37℃)下恒溫培養(yǎng)120h,測定酶活和抑菌活性。結(jié)果分別見表3和圖3。從表3可知,培養(yǎng)溫度在28~32℃時,隨著溫度的升高,發(fā)酵物料的抑菌作用也隨之提高,當(dāng)培養(yǎng)溫度為32℃時,發(fā)酵物料對S.aureus、S.tyhimurium、E.coli、P.vulgaris的抑菌活性較28℃發(fā)酵時分別提高19.08%、16.94%、9.42%和12.6%。但培養(yǎng)溫度超過32℃,抑菌作用隨著培養(yǎng)溫度的升高而下降。不同培養(yǎng)溫度對纖維素酶和蛋白酶的酶活影響也很大,CMCase酶活和蛋白酶酶活在32℃時最高,隨著培養(yǎng)溫度升高,酶活降低較為明顯;FPA酶活在28~35℃變化不是很明顯,但培養(yǎng)溫度超過37℃,酶活同樣降低(見圖3)。因此確定培養(yǎng)溫度為32℃。2.5初始ph對抑菌效果及酶活的影響在上述的基礎(chǔ)上,選擇不同的起始pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)進行發(fā)酵,考察不同起始pH條件下抑菌效果及酶活變化規(guī)律。結(jié)果見表4和圖4。表4和圖4表明,發(fā)酵物料的初始pH值在6.0~7.0,對供試菌的抑菌效果變化不顯著;而纖維素酶和蛋白酶酶活在pH6.0~6.5保持較高的酶活力。因此,在發(fā)酵前可不需調(diào)節(jié)發(fā)酵物料的pH值,采用自然pH值即可。2.6水分和水分復(fù)合飲料分別調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量為30%、40%、50%、60%、70%,其他條件不變,考察不同含水量發(fā)酵條件下的抑菌效果和酶活變化。結(jié)果見表5和圖5。水是任何生物在生命活動過程中不可缺少的物質(zhì)。固體基質(zhì)中水分含量太少,會影響微生物對物質(zhì)的分解利用和微生物的代謝活動;水分含量太高,會影響原料顆粒之間的松散性,使原料顆粒成團,影響氧的傳遞和發(fā)酵熱的散失,并容易造成厭氧環(huán)境。從表5可以看出,當(dāng)發(fā)酵物料的含水量為50%時,對四種供試菌的抑菌活性最高;從產(chǎn)酶的變化規(guī)律分析,CMCase酶和蛋白酶酶活力在含水量為60%時,酶活最高,分別達到8107U/g和3158U/g,而FPA酶活在含水量為50%時最酵物料的含水量控制在50%~60%為宜。2.7不同發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響分析致產(chǎn)酶規(guī)律發(fā)展將中草藥飼料添加劑發(fā)酵培養(yǎng)基分別培養(yǎng)不同時間(24、48、72、96、120h),其他條件不變,取樣低溫干燥后測定抑菌效果和酶活。結(jié)果見表6、圖6。從試驗結(jié)果可以看出,發(fā)酵時間對酶的產(chǎn)量和抑菌效果影響較大。發(fā)酵前期,主要是微生物生長階段,隨著培養(yǎng)時間的延長,微生物酶特別是纖維素酶合成量加大,中草藥細胞壁破壞程度加劇,使中草藥中有效成分逐步釋放出來,到發(fā)酵72h,中草藥飼料添加劑發(fā)酵物料對四種供試菌的抑制效果較發(fā)酵前分別增加60.83%、41.32%、36.03%和27.64%,但發(fā)酵時間超過72h,抑菌活性下降,原因可能為部分中草藥有效成分被微生物酶修飾或被微生物轉(zhuǎn)化為其他產(chǎn)物。從發(fā)酵時間對產(chǎn)酶規(guī)律的影響分析,發(fā)酵第96h產(chǎn)酶達到高峰,CMCase、FPA酶和蛋白酶酶活分別達到9653、971U/g和6357U/g。綜合發(fā)酵物料的抑菌活性,確定發(fā)酵時間為72h。3中草藥飼料添加劑發(fā)酵條件的確定3.1通過在分離培養(yǎng)基中加入中草藥提取液,從中草藥青蒿、魚腥草、地骨皮、黃岑、膽草、