腫瘤放射敏感性檢測方法及腫瘤放射增敏的研究進展

腫瘤放射敏感性檢測方法及腫瘤放射增敏的研究進展

放療是腫瘤最重要的治療手段之一。長期以來，國內(nèi)外對腫瘤的治療效果做出了許多努力，但總體療效并不明顯。放射抗拒一直是制約腫瘤放療療效的瓶頸,是放療失敗的主要原因之一。放療效果與腫瘤、宿主及腫瘤和正常組織的放射劑量效應(yīng)有關(guān)。目前采用的各種腫瘤放療,大多是不同個體使用相似的放療方案,但是不同個體放射敏感性有明顯差異,因此,預(yù)測腫瘤放射抗拒性針對不同個體采用不同的放療方案具有重要意義。人們從兩個方面著手解決放射抗拒的問題,即腫瘤放射敏感性的預(yù)測和腫瘤放射抗拒的逆轉(zhuǎn)。目前國內(nèi)外基于DNA、RNA和蛋白質(zhì)水平進行腫瘤放射敏感性預(yù)測做了廣泛研究。另一方面,為提高腫瘤的放療效果,人們?yōu)槟孓D(zhuǎn)腫瘤放射抗拒或者腫瘤放射增敏進行了深入研究。本文對腫瘤放射敏感性檢測方法及腫瘤放射增敏的研究進展做一綜述。放射治療因其適應(yīng)證寬,療效較好而有著不可質(zhì)疑的重要地位。但常規(guī)的病理診斷常常無法得到腫瘤的放射敏感性信息。病理和臨床分期相同的腫瘤患者,在接受相同劑量和方式的放療后,患者卻有著不同的放療效果。隨著人類基因組計劃的完成,基于基因和蛋白質(zhì)診斷開展個體化治療是醫(yī)學(xué)發(fā)展的必然趨勢。2002年,歐洲放射治療和腫瘤學(xué)會(ESTRO)提出了GENEPI(geneticpathwaysforthepredictionoftheeffectsofirradiation)計劃。Alsbeih等認(rèn)為尋找基因生物標(biāo)志物預(yù)測腫瘤患者的放射敏感性對個體化放療具有重要意義。腫瘤發(fā)生發(fā)展與基因和蛋白質(zhì)改變有關(guān),基因和蛋白質(zhì)研究將為了解腫瘤生物學(xué)行為以及制訂腫瘤綜合治療方案提供指導(dǎo)。人類基因組計劃基本完成后,分子醫(yī)學(xué)的研究領(lǐng)域轉(zhuǎn)移到基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)研究?；蚪M學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)為揭示腫瘤放射抗拒機制、尋求放射治療靶標(biāo)、預(yù)測放療反應(yīng)和腫瘤放射敏感性、逆轉(zhuǎn)腫瘤放射抗拒或者腫瘤放射增敏提供了可能。在腫瘤放射敏感性的預(yù)測方法上,人們從DNA、RNA和蛋白質(zhì)和細(xì)胞水平上進行了腫瘤放射敏感性預(yù)測研究。另一方面,在惡性腫瘤的放療中經(jīng)常會遇到放療后腫瘤復(fù)發(fā)、放射抗拒、副作用大等問題。目前新的放射治療技術(shù)應(yīng)用雖對提高放射治療劑量、減少正常組織損傷有重要的意義,然而臨床治療效果仍不夠理想,即使用最大可能的照射劑量或改變照射方法,有時仍達(dá)不到根治目的。原因是多方面的,其中主要是由于腫瘤中存在一定數(shù)量的對射線具有抗拒作用的細(xì)胞,造成放射治療失敗而成為腫瘤容易復(fù)發(fā)的重要根源。而放射增敏劑則是能夠增強生物體放射敏感性的一類物質(zhì),它可增強射線對腫瘤的殺傷能力,特別是有助于解決實體腫瘤中乏氧細(xì)胞對射線的抗性而導(dǎo)致腫瘤放療治愈率低的問題,這對于臨床提高放射治療的效果具有重要意義。1腫瘤輻射敏感性檢測方法1.1不同方法檢測細(xì)胞放射性能癌細(xì)胞具有顯著的生物學(xué)異質(zhì)性和內(nèi)在放射敏感性差異,探求其放射敏感性相關(guān)參數(shù)以優(yōu)化治療計劃是亟待解決的問題。放射造成DNA損傷,包括雙鏈斷裂(doublestrainedbreak,DSB)、單鏈斷裂(singlestrainedbreak,SSB)等,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和發(fā)生不可逆細(xì)胞周期阻滯,發(fā)揮放射治療作用,而細(xì)胞的輻射防御功能能對DNA損傷進行修復(fù)。因此,DNA損傷程度和細(xì)胞對損傷DNA的修復(fù)能力與放射敏感性密切相關(guān)。檢測DNA損傷和修復(fù)可預(yù)測腫瘤放射敏感性,已有的檢測方法包括密度梯度沉降法、羥基磷灰石柱層析分析法、微孔濾膜洗脫法、熒光快速測定法、放射自顯影法和電鏡法、脈沖電場凝膠電泳法、熟前凝聚染色體分析、PCC(prematurechromosomecondensation,PCC)聯(lián)合FISH技術(shù)、熒光原位雜交技術(shù)和“彗星”分析法等?！板缧恰狈治龇?cometassay)可以通過熒光顯微鏡直接定量地檢測單個細(xì)胞的DNA損傷,需要細(xì)胞數(shù)少,是一種可以直接檢測DNA損傷與修復(fù)的方法,具有靈敏、穩(wěn)定、簡便和快速等優(yōu)點。高遠(yuǎn)紅等應(yīng)用“彗星”分析法檢測包括人鼻咽鱗癌在內(nèi)的3種人癌細(xì)胞株的裸鼠移植瘤的放射敏感性,以尾力距之比(RTM)作為終指標(biāo),結(jié)果顯示經(jīng)與對照組進行“本底”校正后的RTM所反映放射敏感性由高到低的變化趨勢依次為:食管鱗癌>鼻咽鱗癌>肺腺癌,符合臨床一般印象,認(rèn)為“彗星”分析法可用于檢測人體腫瘤的放射敏感性,只是需做本底校正,是一種有潛力的放射敏感性分析法。呂紀(jì)馬等用鹼性“彗星”法檢測了放射治療肺癌標(biāo)本的初始DNA損傷,初步探討了其與療效的相關(guān)性,以經(jīng)本底較正的平均尾力矩(RTM)為評價指標(biāo),同時以胸部CT掃描評價局部腫瘤反應(yīng)率和腫瘤進展時間,結(jié)果提示該檢測是一種有希望的肺癌細(xì)胞放射敏感性分析法。王宏等進行了單細(xì)胞凝膠電泳檢測輻射誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂修復(fù)時效性研究,探討了細(xì)胞DNA輻射損傷修復(fù)時效性,擬合修復(fù)曲線和修復(fù)平面模型,顯示不同劑量下的損傷修復(fù)呈線性關(guān)系,認(rèn)為修復(fù)曲面模型可用于輻射原發(fā)損傷估算。高黎等應(yīng)用改良“彗星”分析法檢測鼻咽癌放射敏感性,認(rèn)為改良“彗星”分析法檢測人鼻咽癌活檢標(biāo)本,在放射治療前能對鼻咽癌的臨床放射敏感性作出預(yù)測,方法簡單、檢測周期短,具有較強的臨床應(yīng)用潛力。張玉晶等用中性彗星分析法檢測了人鼻咽高分化鱗癌CNE1等細(xì)胞株的放射敏感性,認(rèn)為中性彗星分析法適于檢測DNA的殘留損傷,能反應(yīng)出細(xì)胞內(nèi)在的放射敏感性。另有應(yīng)用微核技術(shù)和早熟染色體凝集PCC技術(shù)預(yù)測細(xì)胞輻射敏感性。放射線照射是導(dǎo)致遺傳物質(zhì)損傷誘發(fā)微核形成的一個重要因素,微核主要來源于細(xì)胞分裂時,不能被納入子核的無著絲粒的染色體斷片或整條染色體。早熟染色體凝集PCC技術(shù)是一種研究輻射誘導(dǎo)細(xì)胞染色體損傷的成熟方法,尤其對G2期細(xì)胞,這一技術(shù)效果更佳。江波等探討了花萼海綿體誘癌素A(CalyculinA)誘導(dǎo)的早熟染色體凝集(PCC)與輻射劑量之間的劑量-效應(yīng)關(guān)系。另外,丹麥的Andreassen等研究了5個已知與輻射反應(yīng)有關(guān)基因的單核苷酸多肽性(singlenucletidepolymorphisms,SNPs),發(fā)現(xiàn)攜帶某個核苷酸雙拷貝的患者比攜帶其他核苷酸雙拷貝的患者對輻射更為敏感,而那些只攜帶單拷貝核苷酸患者輻射敏感性居于二者之間,這說明SNP影響輻射敏感性,這些位點的特殊的遺傳模式與輻射敏感性的增強和減弱相關(guān)聯(lián),并認(rèn)為正常組織輻射敏感性應(yīng)被視為一個依賴于多個基因組合效果的性狀,而SNP在這樣的遺傳效果中起到了實質(zhì)性的決定作用,也就是說正常組織的放射敏感性可通過個體的遺傳特征來預(yù)測。然而上述檢測方法都各有利弊,檢測DSB的方法只適用于小分子DNA以及低敏感性細(xì)胞,對于高劑量下產(chǎn)生的大片段卻無能為力,而且操作條件不易控制,得到的結(jié)果不能保持穩(wěn)定,另外在實驗操作過程中的剪切作用增加DSB的數(shù)量,影響實驗結(jié)果。除了檢測DNA損傷之外,其他預(yù)測指標(biāo)包括:姐妹染色體交換(SCE)和次黃嘌呤轉(zhuǎn)磷核糖基酶(HPRT)位點突變頻率、DNA含量與細(xì)胞增殖動力學(xué)的測定、腫瘤細(xì)胞潛在倍增時間等,但是這些方法需建立穩(wěn)定、簡化和標(biāo)準(zhǔn)化的操作程序。1.2細(xì)胞克隆形成率克隆生存實驗是測定單個細(xì)胞增殖能力的有效方法之一。長期以來,人們一直把輻射后得到的克隆源性細(xì)胞的數(shù)目作為判斷細(xì)胞對放射反應(yīng)的金標(biāo)準(zhǔn)。細(xì)胞接種存活率只表示接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞數(shù),但貼壁后的細(xì)胞不一定每個都能增殖和形成克隆,而形成克隆的細(xì)胞必為貼壁的、有增殖活力的細(xì)胞?？寺⌒纬陕史从臣?xì)胞群體依賴性和增殖能力兩個重要性狀。由于細(xì)胞生物學(xué)性狀不同,細(xì)胞克隆形成率差別也很大,一般初代培養(yǎng)細(xì)胞克隆形成率弱,傳代細(xì)胞系強;二倍體細(xì)胞克隆形成率弱,轉(zhuǎn)化細(xì)胞系強;正常細(xì)胞克隆形成率弱,腫瘤細(xì)胞強;放射敏感細(xì)胞放射后克隆形成率弱,放射抗拒細(xì)胞放射后克隆形成率強。很多研究人員采用克隆生存實驗分析了鼻咽癌的放射敏感性。Feng和王亞利等用克隆生存實驗分析了NPC細(xì)胞株CNE2和它衍生的放射抗拒亞株的放射敏感性,表明利用該技術(shù)測定NPC放射敏感性是一種比較可靠的方法,只是克隆生存實驗應(yīng)用于臨床預(yù)測NPC放射敏感性不現(xiàn)實,因為需要的活細(xì)胞數(shù)量多,且放射后形成細(xì)胞克隆需要較長時間,操作復(fù)雜,不易于臨床應(yīng)用。1.3細(xì)胞活力能提高檢測MTT是檢測細(xì)胞活力的實驗方法,由于細(xì)胞活力與細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān),因此也常常用來檢測細(xì)胞的增殖情況?；罴?xì)胞有琥珀酸脫氫酶,將MTT還原成棕褐色沉淀。細(xì)胞放射后的細(xì)胞活力在一定程度上能反應(yīng)細(xì)胞的放射敏感性,很多研究者利用MTT對鼻咽癌進行了放射敏感性分析。其優(yōu)點是快速、方便、可重復(fù),但準(zhǔn)確度不如克隆形成法,真正應(yīng)用于臨床檢測預(yù)測NPC放射敏感性尚少,多用于NPC放射敏感性的研究。1.4基因表達(dá)譜分析腫瘤細(xì)胞具有放射敏感異質(zhì)性,同種類腫瘤患者放療反應(yīng)不盡相同?；虮磉_(dá)譜能從mRNA表達(dá)水平反映細(xì)胞或組織特異性表型,可以構(gòu)建腫瘤放射敏感性的基因表達(dá)譜對腫瘤進行分子分型。微陣列技術(shù)分析基因表達(dá)譜可預(yù)測腫瘤的放射敏感性。通過對腫瘤基因芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)作聚類分析可找出與腫瘤放射敏感性密切相關(guān)的基因群?，F(xiàn)在常用于研究腫瘤放射敏感性的微陣列(cDNAmicroarray)技術(shù)屬于生物芯片的一種,是在硅片、玻片、聚丙烯或尼龍膜等固相支持物上用光電化學(xué)的方法固定上萬種寡核苷酸或DNA探針,經(jīng)過標(biāo)記的靶核酸序列通過DNA堿基配對和序列互補原理進行分子雜交,通過適當(dāng)?shù)臋z測手段獲得雜交信號,經(jīng)過電腦系統(tǒng)處理、分析獲得資料。一次實驗可對上萬種基因的表達(dá)、突變和多態(tài)性進行快速和準(zhǔn)確的檢測。根據(jù)微陣列上探針的不同,將DNA芯片分為cDNA芯片和寡核苷酸芯片兩種。許多研究者用微陣列技術(shù)進行了腫瘤放射敏感性預(yù)測研究。已發(fā)現(xiàn)不少與放射敏感性相關(guān)的基因,并且通過生物信息分析方法初步篩選出能代表放射敏感性的標(biāo)志基因組合,主要包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞損傷修復(fù)等功能密切相關(guān)的基因。這些基因可以用來判斷患者的放射敏感性,從而更好地進行個性化治療。陳甲信等用包含14112點的人類全長基因cDNA表達(dá)譜芯片研究放射敏感與放射抵抗的鼻咽癌組織基因表達(dá)差異,尋找預(yù)測鼻咽癌放射敏感性基因指紋,并用T-test檢驗、聚類和LOOCV等方法進行生物信息分析,發(fā)現(xiàn)了包括已知的與放射敏感性密切相關(guān)的基因PRKD,DCK等;還有大部分以前沒有描述與放射敏感性相關(guān)的基因,如SIRT1,RABAC1,PPP1CC,ZNF638,APPBP1,RABAC1等,它們主要與細(xì)胞周期、S期和M期調(diào)控點、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞生長、DNA綁定和RNA綁定等功能有關(guān);還有一些新發(fā)現(xiàn)的功能尚未明確的基因,如CUTA,ZNF148,Sep15,TMTC3,TOP1等,提示可利用差異基因簇進行放射敏感性分類,進而用基因指紋法進行鼻咽癌放射敏感性預(yù)測。王亞利等用X射線多次照射鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2,建立了放射抗拒性細(xì)胞株CNE-2R,采用BioStarH-141s型基因芯片檢測CNE-2與CNE-2R差異表達(dá)基因,發(fā)現(xiàn)CNE-2和CNE-2R細(xì)胞有差異表達(dá)的基因308條,上調(diào)176個,下調(diào)132個。在差異表達(dá)的基因中,有76個位點出現(xiàn)6倍以上的差異,其中36個下調(diào),40個上調(diào),包括與DNA修復(fù)相關(guān)、細(xì)胞周期、凋亡、細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白、細(xì)胞增殖、代謝、蛋白質(zhì)合成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫等相關(guān)的基因,基因表達(dá)變化較明顯的主要是DNA修復(fù)相關(guān)基因、細(xì)胞骨架、細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)基因,認(rèn)為CNE-2細(xì)胞產(chǎn)生放射抗拒性與基因水平改變相關(guān)?；虮磉_(dá)譜分析預(yù)測腫瘤放射敏感性是基于RNA水平的檢測,而且大多數(shù)研究僅限于篩選出放射敏感基因和放射抵抗基因,并沒有在此基礎(chǔ)上將這些差異基因與放療效果聯(lián)合起來分析?；虮磉_(dá)測定雖然定量了,但缺少臨床效果評價。如何將放射敏感或放射抗拒基因的表達(dá)程度與治療方案聯(lián)系,指導(dǎo)腫瘤的放療,是我們需關(guān)注的問題。但是在常規(guī)應(yīng)用于臨床之前,還有要解決的問題,有的涉及技術(shù)本身,有的涉及臨床效用。另外一些人主張用cDNA微陣列檢測腫瘤組織表達(dá)譜,但用表達(dá)譜檢測腫瘤放射敏感性的最大困難是標(biāo)準(zhǔn)化問題?？傊?目前沒有關(guān)于將微陣列實驗的結(jié)果轉(zhuǎn)變?yōu)槿菀资褂玫呐R床放射敏感性檢測方法的報道。有研究認(rèn)為,可以從表達(dá)譜中選出少數(shù)標(biāo)志基因,用傳統(tǒng)的方法如免疫組化、原位雜交或PCR來深入研究它們與腫瘤放射敏感性的關(guān)系。mRNA的表達(dá)水平(mRNA的種類和含量)并不足以估計蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。實際上,對于某些基因,當(dāng)mRNA的水平相等時,其蛋白質(zhì)表達(dá)水平可以相差20倍以上;當(dāng)某一蛋白質(zhì)的表達(dá)穩(wěn)定于某一水平時,其mRNA的水平也可相差30倍。所以說mRNA的檢測結(jié)果并不能完全反映出生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)水平,要想得到完整的生物信息,其解決辦法之一就是直接研究基因的表達(dá)產(chǎn)物即蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)是生命活動的執(zhí)行者,基因轉(zhuǎn)錄水平只能在一定程度上反映基因表達(dá)產(chǎn)物的變化,蛋白質(zhì)研究才能真實解釋各種生命現(xiàn)象。1.5seldi-ms成像蛋白質(zhì)是細(xì)胞的生命現(xiàn)象和生理活動的主要執(zhí)行者,從整體的角度分析動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成分,將有助于揭示和預(yù)測腫瘤的放射敏感性。用單個蛋白質(zhì)檢測預(yù)測NPC放射敏感性的研究不少,但敏感性較低,多個標(biāo)志物的聯(lián)合應(yīng)用能使敏感性得到很大提高,但隨著組合數(shù)的增加,特異性又會相應(yīng)降低,同時還增加了患者的經(jīng)濟負(fù)擔(dān),因此不斷尋找最優(yōu)化的蛋白質(zhì)檢測組合是目前研究預(yù)測腫瘤放射敏感性的主要目標(biāo)。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的興起,在蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)日益發(fā)展的今天,應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)有可能篩選出最優(yōu)化的蛋白質(zhì)檢測組合?，F(xiàn)有的蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法,如雙向電泳和質(zhì)譜分析等可以高通量檢測和分析大量蛋白質(zhì)。用于蛋白質(zhì)等生物大分子鑒定的質(zhì)譜分為兩大類:即基質(zhì)輔助激光解吸離子化-飛行時間質(zhì)譜(matrixassociatedlaserdesorptionionization-timeofflight-massspectrometry,MALDI-TOF-MS)和電噴霧離子化質(zhì)譜(electrosprayionizationmassspectrometry,ESI-MS)。近年來,隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展,又出現(xiàn)了幾種新型的質(zhì)譜,如圖像質(zhì)譜(imagingMS)和表面增強激光解吸離子化質(zhì)譜(surfaceenhancedlaserdesorption-ionizationmassspectrometry,SELDI-MS)等。圖像質(zhì)譜可直接對存在于組織切片中的蛋白質(zhì)等生物分子作圖,在腫瘤生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)、組織定位和了解腫瘤細(xì)胞的分子復(fù)雜性等方面都有潛在的應(yīng)用價值。SELDI-MS實際上是一種為蛋白質(zhì)芯片檢測而開發(fā)的質(zhì)譜技術(shù),它通過使用特殊的增強表面或芯片直接捕獲待測樣品中的蛋白質(zhì)分子,然后經(jīng)激光解吸離子化-飛行時間質(zhì)譜測定被捕獲的蛋白質(zhì)的質(zhì)量和電荷。與圖像質(zhì)譜一樣,SELDI-MS無須將待測樣品中的蛋白質(zhì)進行2-DE分離等處理,從而克服了2-DE固有的一些缺陷,提高了蛋白質(zhì)鑒定的速度。這兩種新型質(zhì)譜已分別在神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和前列腺癌等多種腫瘤的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中嘗試應(yīng)用,由于SELDI-MS已有商品化的儀器出售,且對于各種組織細(xì)胞和體液樣品中的蛋白質(zhì)檢測均適用,因此相對而言,有關(guān)SELDI-MS在腫瘤研究中應(yīng)用的報道較多。SELDI-TOF產(chǎn)生離子光譜,這種光譜不能確認(rèn)蛋白,但可根據(jù)蛋白荷質(zhì)比來確定樣品蛋白表達(dá)的相對豐度,利用此原理可以檢測樣品中高表達(dá)蛋白。該技術(shù)已應(yīng)用于腫瘤特異性標(biāo)志物的篩選。蛋白質(zhì)芯片或陣列(array)也是當(dāng)前正在發(fā)展的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)之一。該方法先將蛋白質(zhì)(例如純化的蛋白質(zhì)、重組表達(dá)的蛋白質(zhì)和/或粗的蛋白質(zhì)混合物等)或抗體點在經(jīng)過處理的載玻片或膜上形成有規(guī)則的陣列,然后再與熒光染料或其他方法標(biāo)記的蛋白質(zhì)或細(xì)胞裂解液反應(yīng),通過蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)及其他分子的相互作用識別和鑒定蛋白質(zhì)。如果將蛋白質(zhì)芯片與質(zhì)譜聯(lián)用,可進一步提高分析檢測的靈敏度和自動化程度。盡管蛋白質(zhì)芯片在功能蛋白質(zhì)組學(xué)研究和疾病蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化方面已展示了美好的前景,但就目前而言還有某些不足需要克服,這包括應(yīng)發(fā)展高通量的蛋白質(zhì)表達(dá)和純化技術(shù)以及大規(guī)模產(chǎn)生高質(zhì)量抗體技術(shù)等,因為迄今為止蛋白質(zhì)還沒有如PCR那樣的DNA擴增技術(shù),制備蛋白質(zhì)和抗體陣列相對于DNA陣列來說花費更大。生物信息學(xué)為我們提供了一條可以直接由基因或蛋白質(zhì)序列進行蛋白質(zhì)功能預(yù)測和結(jié)構(gòu)分析的捷徑。生物信息學(xué)是80年代未隨著人類基因組計劃的啟動而興起的,是生物與計算機科學(xué)以及應(yīng)用數(shù)學(xué)學(xué)科相互交叉而形成的一門新興學(xué)科。它涉及生物學(xué)、數(shù)學(xué)、計算機科學(xué)和工程學(xué),依賴于計算機科學(xué)、工程學(xué)和應(yīng)用數(shù)學(xué)的基礎(chǔ),依賴于生物實驗和衍生數(shù)據(jù)的大量儲存。它通過對生物學(xué)實驗數(shù)據(jù)的獲取、加工、存儲、檢索與分析,達(dá)到解釋數(shù)據(jù)所蘊含的生物學(xué)意義的目的。由于基因組和蛋白質(zhì)組研究提供了極為豐富的數(shù)據(jù),因而需要我們對這些數(shù)據(jù)進行高度自動化管理,建立嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臄?shù)據(jù)庫并編寫相應(yīng)的軟件,這項工作本身也極大地推動了生物信息學(xué)的發(fā)展,而生物信息學(xué)在蛋白質(zhì)組的研究中將發(fā)揮特殊作用。生物信息學(xué)技術(shù)是一門理論概念與實踐應(yīng)用并重的學(xué)科。它是建立在已經(jīng)獲得的分子生物學(xué)知識基礎(chǔ)之上,是對既往理論知識的充分而有效的運用并作合理推論,以指導(dǎo)實驗,大大節(jié)約時間和費用,但仍需要進一步的實驗室工作驗證和補充。目前要選出一種比較理想的預(yù)測腫瘤放射敏感性的臨床檢測方法具有挑戰(zhàn)性,可以首先利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選出大量差異蛋白質(zhì),再進行生物學(xué)信息分析,然后用常規(guī)檢測方法進行分析,這樣有可能把蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果轉(zhuǎn)變?yōu)槿菀资褂玫拿庖呓M化等方法,用于臨床個體化放射劑量的制定,實現(xiàn)腫瘤的個體化放療。Feng等首先建立了高質(zhì)量的放射抗拒CNE2-IR細(xì)胞與放射敏感CNE2細(xì)胞的2-DE圖譜,質(zhì)譜共鑒定出34種差異表達(dá)的蛋白質(zhì),其中14-3-3σ和Maspin表達(dá)在放射抗拒的CNE2-IR細(xì)胞中明顯下調(diào),而GRP78和Mn-SOD表達(dá)明顯上調(diào);為探討差異表達(dá)蛋白質(zhì)能否作為預(yù)測NPC放療敏感性的分子標(biāo)志,Feng等采用免疫組化檢測14-3-3σ、Maspin、GRP78和Mn-SOD蛋白在39例放射抗拒和51例放射敏感NPC組織中的表達(dá),采用ROC(ReceiverOperatingCharacteristic,ROC)曲線分析了4個蛋白質(zhì)預(yù)測NPC放療敏感性的價值,結(jié)果顯示4個蛋白質(zhì)組合判別NPC的敏感性更有意義。1.6關(guān)于rna的研究用DNA、RNA或蛋白質(zhì)預(yù)測腫瘤放療反應(yīng)各有利弊。DNA不隨時間或組織類型的改變而改變,標(biāo)本可前瞻性或回顧性獲得,前者來自血液、口腔刮片和毛囊等,后者來自冰凍或固定的存檔組織。然而,DNA分析不能提供對功能的理想預(yù)測。分析DNA對預(yù)測放射敏感性是有前途的方法,但它不能揭示腫瘤細(xì)胞內(nèi)基因組的不穩(wěn)定性。RNA研究能提供除來自DNA的另外信息如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié),但技術(shù)是個難題,因為RNA容易被降解。通常來說,使用庫存組織較少反映病人的現(xiàn)狀,對于個體化治療幫助不大?？傊?腫瘤RNA分析能更好地說明腫瘤的動態(tài)過程,但是因技術(shù)和倫理學(xué)不容易實現(xiàn)。蛋白分析在手術(shù)標(biāo)本容易操作,該技術(shù)在大部分病理科都開展,但是免疫組化只是半定量。定量技術(shù)需要獲得新鮮組織,標(biāo)本獲得比較困難。另外,大部分抗體存在特異性問題,如不能區(qū)分蛋白修飾和突變蛋白等。蛋白分析同樣需要靶組織,由于用原發(fā)腫瘤去預(yù)測復(fù)發(fā)腫瘤無法得到一致結(jié)果,因此它也存在與RNA一樣的限制即不易獲得靶組織。1.7單個或多個基因目前大部分研究都是用傳統(tǒng)的方法如免疫染色、Westernblot或Northernblot等方法檢測分子標(biāo)志物預(yù)測放射反應(yīng),用這些方法只是檢測單個或幾個基因,而且研究結(jié)果在不同研究中得到的結(jié)果不同,甚至有些結(jié)果是相反的。當(dāng)然我們不能否認(rèn)這些研究證實了腫瘤相關(guān)基因表達(dá)變化影響放射線反應(yīng)。但是單個基因并不能說明腫瘤的整體情況,因為腫瘤基因的表達(dá)受多種因素、多種途徑調(diào)控,不同機體狀態(tài)會得出不同結(jié)果。高通量基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展為腫瘤放射敏感性的預(yù)測注入了活力,相信隨著這些高通量技術(shù)的發(fā)展,其研究成果可以預(yù)測腫瘤放射敏感性,并且能轉(zhuǎn)化為常規(guī)診斷以指導(dǎo)腫瘤的個體化放療。2腫瘤放射治療根據(jù)放射增敏作用的機制,放射增敏劑主要有如下幾類。2.1氨基咪唑類化合物親電性乏氧細(xì)胞增敏劑是Adams于1963年首先發(fā)展起來的,大量實驗證明親電性的硝基咪唑類化合物有放射增敏作用。其強電子親和力使之能從放射作用的靶分子上奪去電離產(chǎn)生的電子,減少了靶分子復(fù)原的幾率,并形成DNA自由基,造成穩(wěn)定損傷。增敏劑還可以進一步與產(chǎn)生的DNA自由基結(jié)合,形成穩(wěn)定的加成物,導(dǎo)致細(xì)胞死亡,但對正常的組織影響也較大,主要是神經(jīng)毒性。該類化合物研究較多的是硝基咪唑類,包括2-硝基咪唑類或5-硝基咪唑類,該類化合物的代表藥物是米索硝唑(MISO),但由于其周圍神經(jīng)毒性限制了使用劑量,致使瘤體濃度達(dá)不到增敏的足夠濃度。因此以MISO為先導(dǎo)化合物,對其結(jié)構(gòu)改造的有哌莫硝唑、依他硝唑(SR-2508)。SR-2508對離體腫瘤的乏氧細(xì)胞的增敏比為1.8;Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗都證明其毒性比MISO低,可使用比MISO高5～7倍的劑量。解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)放射研究室經(jīng)過19年的科學(xué)研究,于1984年世界首個MISO類低毒高效放射增敏劑甘氨雙唑鈉已投入生產(chǎn)。他們成功合成了甘氨雙唑鈉(商品名:希美納),希美納是一種親腫瘤、低毒、對放、化療有明顯增敏作用的新型硝基咪唑類化合物。希美納對惡性腫瘤放射治療增敏效果明顯,毒副作用較小,安全性好。2.2模型材料類化學(xué)該類修復(fù)抑制劑能阻斷腫瘤細(xì)胞DNA斷鏈修復(fù)及抑制參與修復(fù)的酶。細(xì)胞的亞致死放射損傷和潛在性放射損傷在一定條件下能被細(xì)胞修復(fù)。該類化合物包括潛在性致死損傷修復(fù)的抑制物和對DNA修復(fù)的抑制劑,如胸苷類似物等。吉西他濱(gemcitabine)是人工合成的阿糖胞苷同類藥物,1996年美國FDA批準(zhǔn)用于治療非小細(xì)胞肺癌和胰腺癌等惡性腫瘤,其放射增敏比可達(dá)1.7。吉西他濱是一種新型的細(xì)胞周期特異性抗腫瘤藥物,其放射增敏機制可能與抑制DNA雙鏈斷裂修復(fù)有關(guān),但目前尚無如何將吉西他濱治療劑量與放射合用的公認(rèn)方案。吉西他濱雖然毒性較大,但吉西他濱同步放化療仍然值得深入研究。Specenier等研究表明在頭頸部癌中使用吉西他濱同步放化療,3～4度黏膜毒性發(fā)生率為69%～85%,有效率100%,作者認(rèn)為雖然黏膜毒性較大,但認(rèn)為是可行的,療效令人鼓舞。2.3生物還原性藥物作用途徑生物還原活性物是一種前藥,本身無毒性,在體內(nèi)還原生成一種具有細(xì)胞毒性作用的代謝產(chǎn)物,能直接引起腫瘤細(xì)胞的死亡,同時可增加某些抗癌藥物的細(xì)胞毒性作用,能選擇性作用于乏氧細(xì)胞,使乏氧細(xì)胞的敏感性增加。生物還原性藥物作用途徑有:①特異性或利用乏氧方式激活藥物,使之產(chǎn)生細(xì)胞毒性代謝物殺死乏氧細(xì)胞。②利用不同細(xì)胞類型還原酶水平的差別使抗癌藥作用于特定的腫瘤細(xì)胞。它包括具有放射增敏和生物還原毒性兩種功能的硝基雜環(huán)化合物(如RSU-1069)、雜環(huán)氮氧化合物(如TPZ)和醌類化合物(如EO9和AZQ4N)等。TPZ現(xiàn)已用于臨床。其作用機制是在乏氧環(huán)境下,被細(xì)胞色素P450還原成SR4233基團,該基團在某些特定酶的作用下與腫瘤細(xì)胞中的氫離子結(jié)合,導(dǎo)致細(xì)胞DNA單鏈或雙鏈斷裂。在有氧環(huán)境下,SR4233基團則被氧化,也不引起DNA鏈的斷裂。因此SR4233能選擇性地殺滅腫瘤內(nèi)的乏氧細(xì)胞。2.4定雙鏈法治療腫瘤細(xì)胞對射線的抗拒性與其細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)的表達(dá)量有關(guān)。反義物能與表達(dá)該物質(zhì)的正義鏈互補形成穩(wěn)定雙鏈,阻礙mRNA的正常翻譯,抑制基因的表達(dá),使增加放射抗拒性的蛋白量下降,從而提高腫瘤組織對射線的敏感性。KasidU等研究報道,RAF反義寡核苷酸藥物ErafAON和ISIS5132在Ⅰ期臨床試驗中表現(xiàn)出明顯的放射增敏作用,其作用機制可能與RAF-1信號通道有關(guān)。2.5安迪在氧催化作用中的臨床應(yīng)用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明,活血化瘀類方藥可改善腫瘤細(xì)胞的微循環(huán),減少乏氧腫瘤細(xì)胞,使細(xì)胞存活曲線的肩區(qū)變窄,于低劑量照射時有較好的乏氧增敏作用。如地龍膠囊、莪術(shù)油、川紅注射液、通竅活血湯等,均有不同程度的增敏效果,其增敏機制可能為改善血液循環(huán),加快血液流速,破壞腫瘤組織周圍和內(nèi)部纖維蛋白的聚集,增加瘤床和瘤體的血流量,提高氧分壓,從而提高瘤體的氧效應(yīng),改善乏氧細(xì)胞放射敏感性。其他中藥的增敏機制則不盡相同,如清熱解毒藥馬藺子甲素則是通過抑制DNA的合成,增強乏氧細(xì)胞DNA的單鍵斷裂及抑制損傷后DNA斷鏈重接作用而起到放射增敏效應(yīng)。紫杉醇(taxol)則可作為細(xì)胞周期選擇性放射增敏劑,因為它能使細(xì)胞停留在對放射敏感的G2和M期。樊銳太等采用多西紫杉醇同步放療治療食管癌,近期有