猴艾滋病模型細(xì)胞亞群動態(tài)變化規(guī)律研究

猴艾滋病模型細(xì)胞亞群動態(tài)變化規(guī)律研究

猴病模型是公認(rèn)的調(diào)查艾滋病的“金錢模式”，用于研究核電站的病機(jī)學(xué)，以及抗高血壓藥物和疫苗的作用。隨著研究的深入,近年來急性感染期越來越受到關(guān)注,但臨床上由于涉及患者隱私和艾滋病未發(fā)病時不易察覺等特點,使得急性感染期患者很難被發(fā)現(xiàn),因此對急性感染期的報道很少,關(guān)于急性感染期T細(xì)胞各亞群動態(tài)變化的描述更是鮮有見到。本研究針對SIVmac239感染中國恒河猴急性感染期10周內(nèi)各監(jiān)測指標(biāo)進(jìn)行了研究,希望能對臨床有一個借鑒和參考作用,具體結(jié)果報道如下。1材料和方法1.1動物運動動物中國產(chǎn)恒河猴15只,雄性,體質(zhì)量4~7kg,猴齡3~5歲之間,外觀健康。經(jīng)體檢無淺表淋巴結(jié)腫大,經(jīng)血清學(xué)檢測SIV、猴逆轉(zhuǎn)錄D型病毒(SRV)、猴T淋巴細(xì)胞I型病毒(STLV-I)和B病毒抗體陰性,結(jié)核菌素陰性,痢疾菌素陰性。動物由廣東靈長類實驗動物中心提供,許可證編號:SCXK粵2009-0025。以蒸餾水及標(biāo)準(zhǔn)猴飼料為飲食,喂飼于高要市康達(dá)實驗動物中心獲GLP認(rèn)證的靈長類動物實驗室。本實驗經(jīng)廣東省靈長類動物實驗中心動物倫理委員會批準(zhǔn)(文件編號:K09004-IACUC),實驗嚴(yán)格按照廣東省靈長類動物實驗中心標(biāo)準(zhǔn)操作/作業(yè)流程執(zhí)行,并按照K09004-IACUC文件中內(nèi)容給予相應(yīng)的動物福利。1.2猴的感染試驗SIVmac239,中國科學(xué)院昆明動物所鄭永唐博士饋贈,5MID100(5個100%猴感染劑量)1ml靜脈注射,共感染15只猴。1.3熒光定量pcr和外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測SIVRNA抽提采用一管式體液病毒核酸抽提試劑。逆轉(zhuǎn)錄酶RevertAidTMReverseTranscriptase、RNA酶抑制劑和探針法熒光定量PCR試劑盒MaximaProbe/ROXqPCRMasterMix(2×)均購自立陶宛Fermentas公司;熒光定量PCR檢測采用美國生物系統(tǒng)公司ABI7300型熒光定量PCR儀。外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測用熒光標(biāo)記單克隆抗體CD3—別藻藍(lán)蛋白(APC)、CD4—多甲藻黃素-葉綠素-蛋白質(zhì)復(fù)合物(PERCP)、CD8—藻紅蛋白(PE)、CD28—異硫氰酸熒光素(FITC)、CD45RA—異硫氰酸熒光素(FITC)均購自美國BD公司;LysingsolutionforFACS購自聯(lián)科公司;外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測采用美國BD公司的FACSCaliber型流式細(xì)胞儀。血常規(guī)和血生化指標(biāo):血常規(guī)包括白細(xì)胞(WBC)、淋巴細(xì)胞(LYM)、紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)、血小板(PLT)用HORIBAABXPENTRA60全自動血細(xì)胞分析儀測定;血生化包括谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、血清尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)(采用EX-3600全自動生化儀測定)。1.4方差齊性檢驗采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)建立及分析,用TestofHomogeneityofVariances進(jìn)行方差齊性檢驗,方差齊性時用LSD方法進(jìn)行多重比較,方差不齊時用DunnettT3方法進(jìn)行多重比較;用One-WayANOVA單因素方差分析不同組間差異是否具有顯著性,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1不同時間點的病毒用戶貝以病毒1.5.5表1顯示:經(jīng)單因素方差分析,感染半月、感染一月、感染兩月、感染兩個半月4個時間點的病毒拷貝Log值有明顯差異(P<0.01);兩兩比較發(fā)現(xiàn):感染半月與其余3個時間點間病毒拷貝Log值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),而感染一月、感染兩月、感染兩個半月3個時間點間病毒拷貝Log值無明顯差異。2.2cd3+t細(xì)胞配比檢測由表2可知,感染前后體質(zhì)量沒有明顯變化;另外,感染前后T細(xì)胞各亞群百分比與個數(shù)變化基本趨勢一致,如圖1、圖2、圖3所示(注:圖中橫軸A代表感染前,B代表感染后一月,C代表感染后兩月)。感染后CD4+T細(xì)胞百分比相比感染前顯著下降,并且感染兩月后恢復(fù)不到感染前水平;而感染一月時CD8+T細(xì)胞百分比相比感染前明顯升高,感染兩月時又幾乎恢復(fù)到感染前水平。CD3+T細(xì)胞百分比綜合CD4+T細(xì)胞百分比和CD8+T細(xì)胞百分比變化的結(jié)果,感染一月時雖然CD4+T細(xì)胞百分比顯著下降,但CD8+T細(xì)胞百分比明顯升高,故CD3+T細(xì)胞百分比沒有明顯變化;而在感染兩月時,雖然CD8+T細(xì)胞百分比幾乎恢復(fù)到感染前水平,但CD4+T細(xì)胞百分比未能恢復(fù),仍處于較低水平,故導(dǎo)致此時CD3+T細(xì)胞百分比開始明顯降低。CD4/CD8亦隨著CD4+T細(xì)胞百分比和CD8+T細(xì)胞百分比的變化相應(yīng)變化。CD4+CD28-T細(xì)胞與CD8+CD28+T細(xì)胞(殺傷性T細(xì)胞)在急性感染期變化不明顯,而CD4+CD28+T細(xì)胞相比感染前顯著下降(P<0.01),CD8+CD28-T細(xì)胞(抑制性T細(xì)胞)相比感染前顯著升高(P<0.01);CD4純真細(xì)胞(CD4+CD45RA+)感染后一月時相比感染前下降,但感染后兩月時回升。CD4記憶細(xì)胞(CD4+CD45RA-)感染后呈下降趨勢,未出現(xiàn)回升,變化趨勢與CD4+T細(xì)胞一致。CD8純真細(xì)胞(CD8+CD45RA+)和CD8記憶細(xì)胞(CD8+CD45RA-)變化趨勢與CD8+T細(xì)胞一致。2.3wbc、rbc、hbc、hbc、crea、alt感染時間由表3可知,經(jīng)單因素方差分析,感染前后血常規(guī)和血生化指標(biāo)中WBC、LYM、RBC、HGB、CREA、ALT3個時間點間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,其中感染后WBC和CREA相比感染前升高,而感染后LYM、RBC、HGB、ALT相比感染前不同程度下降,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。3cd4+t細(xì)胞對siv感染的影響本研究中,實驗猴感染SIV半月時與感染一月、感染兩月、感染兩個半月3個時間點間病毒拷貝Log值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,而感染一月、感染兩月、感染兩個半月這3個時間點間病毒拷貝Log值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,說明感染一月后逐步向平臺期過渡。研究發(fā)現(xiàn),感染前后體質(zhì)量沒有明顯變化。另外,T細(xì)胞各亞群百分比與個數(shù)變化基本一致,提示我們評價T細(xì)胞各亞群個數(shù)變化時可以參考其百分比。CD28分子是T細(xì)胞正常激活所必須的第二信號分子,CD28分子的表達(dá)是CD4+T細(xì)胞發(fā)揮正常免疫應(yīng)答的必要條件。CD8+T細(xì)胞根據(jù)CD28的表達(dá)與否分為殺傷性T細(xì)胞(表型為CD8+CD28+)和抑制性T細(xì)胞(表型為CD8+CD28-)。CD8+CD28+T細(xì)胞能直接對病毒和病毒感染的細(xì)胞發(fā)揮作用;CD8+CD28-T細(xì)胞對Th細(xì)胞有抑制作用,對各種免疫功能起負(fù)調(diào)節(jié)作用。本研究中急性感染期CD4+CD28-T細(xì)胞與CD8+CD28+T細(xì)胞(殺傷性T細(xì)胞)感染前后變化不明顯,而CD4+CD28+T細(xì)胞相比感染前顯著下降(P<0.01),說明CD4+T細(xì)胞的功能受到影響;CD8+CD28-T細(xì)胞(抑制性T細(xì)胞)相比感染前顯著升高(P<0.01),推測機(jī)體可能通過抑制性T細(xì)胞的大量增加來加強(qiáng)抑制CD4+T細(xì)胞增殖活化的作用,從而減少CD4+T細(xì)胞感染SIV,是一種被動的保護(hù)機(jī)制。T細(xì)胞未接觸其特異性抗原刺激之前,以純真細(xì)胞(CD45RA+CD4+)的形式存在,主要參與機(jī)體對未接觸過的抗原起免疫應(yīng)答,是機(jī)體細(xì)胞免疫的后備力量。受特異性抗原刺激后,純真T細(xì)胞轉(zhuǎn)變成記憶T細(xì)胞(CD45RO+CD4+或CD45RA-CD4+)成為抗原特異性淋巴細(xì)胞,主要參與對已接觸過的抗原產(chǎn)生迅速而有效的免疫反應(yīng)。本研究中發(fā)現(xiàn),CD4純真細(xì)胞(CD4+CD45RA+)感染后一月時相比感染前下降,但感染兩月時回升;而CD4記憶細(xì)胞(CD4+CD45RA-)感染后呈下降趨勢,未出現(xiàn)回升,變化趨勢與CD4細(xì)胞一致。說明在急性感染期減少的CD4細(xì)胞是記憶性CD4+T細(xì)胞。這與國外HIV的相關(guān)研究“感染的早期以記憶T細(xì)胞減少為主,純真T細(xì)胞的減少尚不明顯”的研究結(jié)果相一致。感染前后血常規(guī)和血生化指標(biāo)出現(xiàn)不同程度變化,其中感染后WBC和CREA相比感染前升高,說明感染存在炎癥,對腎功能有一定程度損傷;感染后LYM、RBC、HGB相比感染前不同程度下降,提示SIV感染后對實驗猴即造成消耗。綜上,本