鼻咽癌p53結(jié)合蛋白的共沉淀組學(xué)分析

鼻咽癌p53結(jié)合蛋白的共沉淀組學(xué)分析

p53基因是一個(gè)重要的腫瘤基因，可以阻止細(xì)胞周期，開始細(xì)胞死亡，并維持組織系統(tǒng)的穩(wěn)定。p53基因突變與許多人類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。至少50%以上的人類腫瘤存在p53基因的高頻率突變和失敗感。有趣的是，p53基因的突變與其他腫瘤不同。在pc中，p53基因的突變是罕見的，突變頻率低于10%。根據(jù)大量研究，60%以上的敏感性唾液和大多數(shù)潛力性清潔劑含有p53蛋白（過表達(dá)）或聚集（accumia）。此外，p53蛋白的過表達(dá)與鼻子組織的發(fā)育、血管密度、顱底侵蝕、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及患者預(yù)后與斌氏病毒系統(tǒng)h組有關(guān)。也就是說(shuō)，對(duì)于p53基因聚集的腫瘤患者，細(xì)胞活性物質(zhì)的血管密度增加，腫瘤易遭到破壞和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后低，腫瘤組織經(jīng)常存在未知的病毒。這表明p53蛋白的過表達(dá)是異常的，沒有活動(dòng)，不能發(fā)揮阻礙細(xì)胞周期和誘導(dǎo)副作用的生物學(xué)作用。此外，p53蛋白的異質(zhì)結(jié)遺傳因子位于鼻細(xì)胞細(xì)胞株的基因治療中。p53蛋白功能失活的主要原因有4個(gè),最常見的原因是p53基因點(diǎn)突變或缺失.其他3個(gè)p53蛋白功能失活的原因不涉及p53基因突變,屬于非遺傳原因(extragenic).其一是細(xì)胞蛋白與野生型p53蛋白結(jié)合,如MDM2瘤蛋白與p53結(jié)合后、加速p53蛋白泛素化和降解;其二是野生型p53蛋白核外排(nuclearexclusion),即p53蛋白被分隔(sequestration)于細(xì)胞漿,不能進(jìn)入細(xì)胞核而發(fā)揮作用,如熱休克蛋白70(HSP-70)和HSP-90家族成員可通過此種方式使p53蛋白功能失活;其三是病毒蛋白與野生型p53蛋白結(jié)合,如SV40大T抗原、HPVE6蛋白、腺病毒E1B和E4/F4蛋白,以及乙肝病毒x抗原(HBx)等與p53蛋白結(jié)合使之失活.由于鼻咽癌中p53突變失活的可能性小,因此極有可能是細(xì)胞蛋白或病毒蛋白與其結(jié)合后使其功能異?；蚴Щ?但至今尚未識(shí)別鑒定出鼻咽癌中p53的結(jié)合蛋白.為此,本文以p53蛋白為誘餌,先采用抗p53抗體免疫共沉淀,從鼻咽癌細(xì)胞中的p53結(jié)合蛋白,再采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)技術(shù)對(duì)含p53結(jié)合蛋白的復(fù)合物進(jìn)行分離,然后采用液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(liquidchromatography-tandemelectrospraymassspectrometry,LC-ESI-MS/MS)結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)查詢鑒定p53結(jié)合蛋白,試圖闡明鼻咽癌中p53蛋白聚集及功能異常的分子機(jī)制.1材料和方法1.1材料表面1.1.1細(xì)胞鼻咽癌細(xì)胞系HNE1和HNE2由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所建立.用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液進(jìn)行傳代培養(yǎng).1.1.2抗羊igg的試劑小牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基和蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)為GibicoBRL產(chǎn)品;兔抗人p53多克隆抗體、羊抗人HSP78多克隆抗體、辣根過氧化物酶偶聯(lián)的兔抗羊IgG均為美國(guó)SantaCruz公司產(chǎn)品;ECL試劑盒、ProteinGSepharose4Bbeads、TritonX-100、NP-40、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、甘氨酸、Tris、SDS、銀染和考馬斯亮藍(lán)R-250試劑盒均為Pharmacia公司產(chǎn)品;碳酸氫胺(NH4HCO3)、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺、TPCK處理的胰蛋白酶(TPCK-trypsin)、三氟乙酸(TFA)均為Sigma公司產(chǎn)品;乙腈(ACN)為國(guó)產(chǎn)色譜純.1.1.3設(shè)備SDS電泳儀(Bio-Rad公司),Q-TOFmicroTM(英國(guó)Micromass公司).1.2方法1.2.1免疫共沉淀法檢測(cè)細(xì)胞總蛋白分別收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HNE1和HNE2細(xì)胞,加入抽提緩沖液(20mmol/LTris-HCl、pH7.5,150mmol/LNaCl,1mmol/LEDTA,5mmol/LDTT,1%TritonX-100,10%蛋白酶抑制劑混合物,1%磷酸化酶抑制劑Ⅰ,1%磷酸化酶抑制劑Ⅱ),冰上裂解30min,12000r/min、4℃離心15min去除細(xì)胞碎片,吸取上清液,即為細(xì)胞總蛋白,用BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,立即用于免疫共沉淀.1.2.2合成p33s的抗凝劑在含2mg細(xì)胞總蛋白的1ml抽提緩沖液中,加入1μl正常兔血清和30μlproteinG-Sepherose4B珠子,4℃、振蕩2h,9000r/min離心5min去除珠子以消除非特異結(jié)合蛋白,保留上清.在上清液中加入5μl兔抗人p53抗體和30μlproteinG-Sepherose4B珠子,4℃,振蕩過夜,9000r/min離心5min去上清,保留珠子.TBST緩沖液洗滌含免疫復(fù)合物的珠子4次,每次5min,離心收集珠子.以BSA取代p53抗體作為對(duì)照.1.2.3proing-東南角的sds-東南角電泳加30μl2×SDS上樣緩沖液(4%SDS,125mmol/LTris-HClpH6.8,4%β-巰基乙醇和10%甘油)于含proteinG-Sepherose4B珠子的試管中,煮沸3min.短暫離心后取上清進(jìn)行12.5%SDS.電泳結(jié)束后,考馬斯亮藍(lán)R-250和硝酸銀試劑盒進(jìn)行凝膠染色.實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次.1.2.4膜法分離蛋白質(zhì)從膠中切取分辨較好的5條蛋白質(zhì)帶,置于1.5mlEppendorf管中,對(duì)經(jīng)兩種染色的蛋白質(zhì)帶分別進(jìn)行脫色、還原、烷基化、酶解、萃取和脫鹽等處理,將制備好的樣品用于質(zhì)譜分析.1.2.5kv.4細(xì)胞自動(dòng)進(jìn)樣的自動(dòng)分析制備好的樣品在電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(LC-ESI-MS/MS)儀上進(jìn)行分析.所有測(cè)定均在正離子方式下進(jìn)行.質(zhì)譜儀的校正是用PPG2000串聯(lián)質(zhì)譜碎片校正的,質(zhì)量準(zhǔn)確度小于0.1u.霧化氣體為氮?dú)?碰撞氣體為氬氣.源溫80℃,錐孔電壓50V左右.TOF加速電壓為0.2kV.MCP檢測(cè)器電壓為2.7kV.當(dāng)進(jìn)行LC-ESI-MS/MS全自動(dòng)分析時(shí),毛細(xì)管電壓為3000V.自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)裝備一個(gè)C18脫鹽預(yù)柱(長(zhǎng)5mm,內(nèi)徑180μm).在進(jìn)樣后的前3min通過預(yù)柱脫鹽,以后的時(shí)間通過梯度洗脫經(jīng)C18毛細(xì)管柱(75μm×15cm)進(jìn)行肽段分離,分離后直接進(jìn)入質(zhì)譜儀,儀器一級(jí)掃描范圍為400～1600u.一級(jí)和二級(jí)之間通過母離子強(qiáng)度和母離子電荷自動(dòng)轉(zhuǎn)換.進(jìn)行CID的母離子單掃描強(qiáng)度域值設(shè)為5counts,電荷條件設(shè)定為:2、3、4,同時(shí)滿足以上兩個(gè)條件的一級(jí)離子自動(dòng)進(jìn)行二級(jí)分析.一次分析離子的最大個(gè)數(shù)設(shè)定為4,間隔時(shí)間0.1s.二級(jí)分析7.7s后轉(zhuǎn)換為一級(jí)繼續(xù)掃描.碰撞能量根據(jù)肽段電荷和質(zhì)量范圍的不同而異.測(cè)定結(jié)果儀器自動(dòng)以peaklist文件形式給出,通過Mascot查詢SWISSPROT,OWL或NCBI即可對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定.也可借助Micromass公司配備的專用軟件MASseq直接推導(dǎo)出肽段序列,再用推斷的序列與肽段質(zhì)量相結(jié)合,查詢數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定.1.2.6單次給藥對(duì)羊抗人hsp鋼的侵害p53抗體分別與2mgHNE1、HNE2細(xì)胞總蛋白進(jìn)行免疫共沉淀,收集的蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)行12.5%SDS分離,膠中蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上.印跡膜在5%脫脂牛奶中4℃封閉過夜;在1∶1000稀釋的羊抗人HSP78一抗中室溫溫育2h,PBS洗滌3次,每次10min;在1∶1500稀釋的兔抗羊二抗中室溫溫育2h,PBS洗滌3次,ECL試劑發(fā)光、顯影和定影.未進(jìn)行免疫共沉淀的100μgHNE1總蛋白凝膠同時(shí)電泳、轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析作為對(duì)照.2結(jié)果2.1核心蛋白表達(dá)蛋白質(zhì)混合物的分離和鑒定抗p53抗體分別與鼻咽癌細(xì)胞系HNE1和HNE2的總蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫共沉淀,收集的免疫共沉淀蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)行SDS分離,凝膠考馬斯亮藍(lán)染色和銀染后結(jié)果如圖1所示,在HNE1和HNE2細(xì)胞中分別檢測(cè)到5條分子質(zhì)量相同的p53結(jié)合蛋白條帶.它們的分子質(zhì)量分別為100ku、75ku、72ku、60ku和25ku左右.實(shí)驗(yàn)共重復(fù)5次,所獲結(jié)果一致.2.2質(zhì)譜、質(zhì)譜條件選擇一個(gè)可以移動(dòng)分子中一個(gè)分子分別從電泳凝膠中切取分辨率較好的5條蛋白質(zhì)帶(圖1).經(jīng)過脫色、還原、烷基化、酶解、萃取等處理,樣本凍干后入HPLC的C18毛細(xì)管柱進(jìn)行梯度洗脫,根據(jù)蛋白質(zhì)疏水強(qiáng)弱對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離,分離后進(jìn)入質(zhì)譜分析,對(duì)同時(shí)達(dá)到母離子強(qiáng)度和母離子電荷標(biāo)準(zhǔn)的一級(jí)離子進(jìn)行二級(jí)分析(色譜峰見圖2),獲得部分多肽碎片離子的肽序列標(biāo)簽(圖3).2.3grp-97,-actinin4和mcm3蛋白表達(dá)儀器自動(dòng)以peaklist文件形式給出LC-ESI-MS/MS測(cè)定結(jié)果,通過Mascot軟件查詢SWISSPROT,OWL或NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)成功鑒定了9個(gè)蛋白質(zhì)(表1).其中HNE1和HNE2細(xì)胞的蛋白質(zhì)條帶1鑒定了3個(gè)蛋白質(zhì),分別是GRP-94,α-actinin4和DNA復(fù)制準(zhǔn)許因子/MCM3蛋白;條帶3鑒定了3個(gè)蛋白質(zhì),在HNE1細(xì)胞為GRP-78和LaminA/C,在HNE2細(xì)胞為GRP-75和LaminA/C;HNE1和HNE2細(xì)胞的條帶4鑒定了3個(gè)蛋白質(zhì),分別是CD98/4F2heavychain、PKC和Ezrin/Cytovillin.但HNE1和HNE2細(xì)胞蛋白的條帶2和條帶5重復(fù)幾次都未能搜出結(jié)果,可能是蛋白量太小的緣故.2.4hne1和hne2蛋白表達(dá)水平抗人p53抗體分別與HNE1、HNE2細(xì)胞總蛋白免疫共沉淀,免疫復(fù)合物電泳轉(zhuǎn)膜后與抗人HSP78抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析.結(jié)果顯示:HNE1蛋白條帶3含p53結(jié)合蛋白質(zhì)HSP78,未進(jìn)行免疫共沉淀的HNE1總蛋白在相同位置HSP78亦為陽(yáng)性,而HNE2蛋白條帶3無(wú)p53結(jié)合蛋白質(zhì)HSP78(圖4).這與LC-ESI-MS/MS分析鑒定的結(jié)果一致.3細(xì)胞骨架蛋白和p33蛋白相互作用本文應(yīng)用免疫共沉淀與LC-ESI-MS/MS分析相結(jié)合的方法,首次從兩株鼻咽癌細(xì)胞株中鑒定了9個(gè)p53結(jié)合蛋白.在鑒定的蛋白質(zhì)中,有的為已知的能與p53蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì).如HSP-70家族成員GRP-78和GRP-75,以及HSP-90家族成員GRP-94.HSP-70和HSP-90家族成員為分子伴侶、具有許多重要的生物學(xué)功能,它們也稱為細(xì)胞死亡和惡性轉(zhuǎn)化的決定因子,通過影響細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)(p53,pRB和p27)的活性而發(fā)揮致瘤作用.HSP-70家族成員GRP-75,GRP-78,HSP-70可與p53穩(wěn)定結(jié)合,導(dǎo)致p53在細(xì)胞漿異常聚集、不能進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮作用,并延長(zhǎng)p53的半衰期.但至今尚未見鼻咽癌中HSP-70和HSP-90家族成員與p53蛋白結(jié)合的報(bào)道.本文在鼻咽癌中識(shí)別GRP-78、GRP-75和GRP-94與p53蛋白結(jié)合,這不僅為闡明鼻咽癌中p53聚集及失活的機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),而且為進(jìn)一步通過分子遺傳學(xué)技術(shù)恢復(fù)鼻咽癌中p53的活性、開展鼻咽癌基因治療研究提供了重要線索.本文鑒定的其他p53結(jié)合蛋白是文獻(xiàn)中未見報(bào)道的新的p53結(jié)合蛋白,其中有3個(gè)細(xì)胞骨架蛋白(LaminA/C、α-actinin4和Ezrin/Cytovillin)和PKC.雖然這些細(xì)胞骨架蛋白與p53蛋白結(jié)合的意義目前尚不清楚,但細(xì)胞骨架蛋白降解是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵事件之一,因此它們是否影響p53蛋白誘導(dǎo)凋亡的功能有待澄清.PKC是細(xì)胞生長(zhǎng)和分化信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵激酶之一,具有調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞p53活性的作用,但文獻(xiàn)中尚未見在鼻咽癌細(xì)胞中PKC與p53蛋白結(jié)合的報(bào)道,其機(jī)理和意義有必要進(jìn)一步研究.另外一個(gè)值得關(guān)注的新的p53結(jié)合蛋白是DNA復(fù)制準(zhǔn)許因子(DNAreplicationlicensingfactor),或稱為MCM3蛋白(minichromosomemaintenance3protein,MCM3),MCM3蛋白在進(jìn)化過程中高度保守,從原核生物到人類均有該因子表達(dá).MCM3蛋白是細(xì)胞周期前復(fù)制物(pre-replicationcomplexes,pre-RC)的關(guān)鍵成分之一,pre-RC在晚M1期和G1期組裝,在S期被活化,然后與DNA復(fù)制啟始位點(diǎn)結(jié)合,啟動(dòng)DNA的復(fù)制和延伸.文獻(xiàn)報(bào)道MCM3蛋白在宮頸癌等腫瘤中高水平表達(dá),并能反映癌組織增殖程度.Schwab等也報(bào)道,MCM3蛋白降解與細(xì)胞凋亡有關(guān).因此,MCM3蛋白是否影響鼻咽癌細(xì)胞中p53蛋白功能值得進(jìn)一步研究.本文識(shí)別的另外一個(gè)新的p53結(jié)合蛋白是CD98/4F2heavychain,CD98為跨膜糖蛋白,由80～85ku重鏈(4F2heavychain)和40～45ku輕鏈組成,大量的研究顯示,活化的CD98具有促進(jìn)細(xì)胞增生和轉(zhuǎn)化的作用,但是CD98位于細(xì)胞膜,理論上應(yīng)不能與位于胞漿和胞核中的p53結(jié)合,因此CD98是否為p53的結(jié)合蛋白需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證.分析鑒定蛋白質(zhì)相互作用的方法有許多,如酵母雙雜交,生物傳感芯片技術(shù),免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜分析法等.每種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn),如酵母雙雜交是一種高通量的分析相互作用蛋白質(zhì)的方法,適用于大規(guī)模篩選相互作用蛋白.應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)識(shí)別相互作用蛋白,靶蛋白本身被作為誘餌(biat)去分離它的結(jié)合蛋白,與酵母雙雜交系統(tǒng)和蛋白質(zhì)芯片技術(shù)比較,該方法主要有如下優(yōu)點(diǎn):完全加工、修飾和成熟的蛋白質(zhì)被作為誘餌;蛋白質(zhì)的相互作用在接近生理?xiàng)l件下進(jìn)行;操作簡(jiǎn)單,含多個(gè)蛋白質(zhì)的復(fù)合物經(jīng)過一步操作就能被鑒定.免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜分析研究蛋白質(zhì)相互作用的一個(gè)重要步驟,是對(duì)分離出來(lái)的微量蛋白