利用靈芝發(fā)酵中藥的研究

利用靈芝發(fā)酵中藥的研究

中國(guó)的中醫(yī)藥歷史悠久，中醫(yī)資源豐富，為確保廣大人民群眾的身體健康發(fā)揮了巨大作用。但近幾十年來(lái),我國(guó)在中藥現(xiàn)代化方面進(jìn)展緩慢,其中原因之一就是中藥加工技術(shù)陳舊,近來(lái)有學(xué)者提出了中藥發(fā)酵制藥技術(shù)。藥用真菌是中藥的組成部分,它們中的許多種類都能以液體發(fā)酵進(jìn)行生產(chǎn),以適當(dāng)?shù)闹兴帪榕囵B(yǎng)基或在培養(yǎng)基中添加適量的中藥,利用它們強(qiáng)大的分解轉(zhuǎn)化能力,不僅可對(duì)中藥中的纖維、糖類和蛋白等物質(zhì)加以利用,而且在代謝過(guò)程中可能對(duì)中藥中的一些成分進(jìn)行轉(zhuǎn)化,從而提高中藥活性成分在復(fù)合制劑中的比例及效價(jià);另外中藥中的某些成分亦能促進(jìn)藥用真菌的生長(zhǎng)或活性產(chǎn)物的產(chǎn)生,這樣可生產(chǎn)出包含多種活性成分且藥效較簡(jiǎn)單組方配伍更佳的新型發(fā)酵制劑,為此,本實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展了利用靈芝等藥用真菌對(duì)中藥進(jìn)行發(fā)酵的研究,首先對(duì)適合靈芝發(fā)酵的中藥進(jìn)行了篩選。本文報(bào)道了部分中藥對(duì)靈芝在液體培養(yǎng)中生長(zhǎng)(生物量)及代謝產(chǎn)物(胞外多糖)的影響,為利用靈芝進(jìn)行中藥發(fā)酵提供基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1細(xì)菌靈芝(Ganodermalucidum),由江南大學(xué)生物工程學(xué)院生物資源研究室篩選保存。1.1.2皮粉、豆餅粉添加量種子培養(yǎng)基:每升含葡萄糖20g,玉米粉10g,麩皮粉5g,豆餅粉5g。發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基:每升含葡萄糖40g,蛋白胨4g,MgSO40.75g,KH2PO41.5g,VB10.01g,pH6.5。1.1.3山禾藥企業(yè)來(lái)源黃芪(Astragalusmembranaceus)、薏苡仁(Coixlachryma-jobi)、枸杞子(Lyciumbarbarum)、當(dāng)歸(Angelicasinensis)、玄參(Scrophularianingpoensis)、山藥(Dioscoreaopposita)、黨參(Codonopsispilosula)、牛膝(Achyranthesbidentata)和石斛(Dendrobiumnobile)均購(gòu)自江蘇無(wú)錫山禾藥業(yè)集團(tuán)。蘆薈(Aloevera)為鮮葉曬干自制。1.2藥汁的制備稱取中藥材(已切片),加6倍量水浸泡1h,用電爐煎熬,調(diào)整適當(dāng)?shù)募訜釡囟?使保持溫和的沸騰狀態(tài)。煮沸30min,倒出藥汁,補(bǔ)加適量冷水于藥渣中,再煮沸20min,倒出藥汁。合并藥汁(控制至適當(dāng)體積),過(guò)濾,以3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylicacid,DNS)法測(cè)定藥汁中還原糖含量,藥汁用于靈芝液體培養(yǎng)。1.3藥汁還原糖含量測(cè)定稱取一定量中藥材,加10倍量70%乙醇浸提48h,過(guò)濾,減壓蒸去乙醇,再加水至適當(dāng)體積,靜置24h,過(guò)濾,以DNS法測(cè)定藥汁中還原糖含量,藥汁用于靈芝液體培養(yǎng)。1.4不同還原糖溶液的接種將72mL藥汁倒入250mL三角瓶中,加入發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(控制各試驗(yàn)樣品與對(duì)照樣品中還原糖濃度相同),每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。121℃滅菌30min。冷卻后接入靈芝液體種,接種量10%。搖瓶條件:三角瓶250mL,裝液量80mL,30℃150r/min培養(yǎng)7d。1.5生物量計(jì)算將發(fā)酵液離心(4000r/min,10min),沉淀用水洗兩次,再離心,沉淀在105℃烘干至恒重,稱重得生物量。1.6加65%乙醇-乙醇法發(fā)酵液經(jīng)離心所得的上清液合并,減壓濃縮到發(fā)酵液體積的2/5～3/5,加95%酒精到乙醇含量為30%,在冰箱中靜置24h。離心,棄去沉淀,上清液再加95%乙醇到乙醇含量達(dá)到60%,在冰箱中靜置24h。離心,沉淀用蒸餾水溶解并定容到25mL,用苯酚-硫酸法測(cè)多糖含量。2結(jié)果2.1不同水提液對(duì)不同從根本上影響巖石家系中巖石多糖含量的影響取黃芪等10味中藥各15g,制成水提液后,研究其對(duì)靈芝液體發(fā)酵生物量及胞外多糖的影響,結(jié)果見(jiàn)表1。其中對(duì)照為在不添加中藥的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中發(fā)酵的結(jié)果,其它條件相同。由表1可見(jiàn),在每升培養(yǎng)基為187.5g生藥量的劑量下,除黃芪外,薏苡仁、枸杞子、當(dāng)歸、玄參、山藥、黨參、牛膝、石斛和蘆薈的水提液均能促進(jìn)靈芝的生長(zhǎng)(生物量增加),以牛膝、山藥效果顯著,生物量分別為對(duì)照的2.35和2.12倍;在胞外多糖方面,加入中藥水提液的發(fā)酵樣比對(duì)照高2.46～9.22倍,抑制靈芝生長(zhǎng)的黃芪水提樣亦比對(duì)照高3.3倍,中藥中某些成分雖可促進(jìn)靈芝胞外多糖的分泌,但這一結(jié)果更可能是中藥水提液中本身中藥多糖的含量高。為排除中藥本身多糖的干擾,我們研究了中藥醇提液對(duì)靈芝液體發(fā)酵的影響。2.2不同的醇提液對(duì)不同生物量感官的影響取薏苡仁等6味中藥各15g,制成醇提液后,研究其對(duì)靈芝液體發(fā)酵生物量及胞外多糖的影響(表2)。結(jié)果顯示,在每升培養(yǎng)基為187.5g生藥量的劑量下,薏苡仁、山藥、黨參和牛膝的醇提液能促進(jìn)靈芝的生長(zhǎng),生物量分別比對(duì)照增加1.74～2.23倍,對(duì)靈芝胞外多糖的分泌亦有不同程度的提高;而當(dāng)歸和石斛的醇提液顯著抑制靈芝的生長(zhǎng),但能促進(jìn)靈芝胞外多糖的分泌。2.3不同的醇提液對(duì)不同生物量感官的影響為了觀察中藥量的變化對(duì)靈芝發(fā)酵的影響,分別取5、10、15和20g的當(dāng)歸、石斛、黨參和牛膝制成醇提液,研究了其對(duì)靈芝生物量及胞外多糖的影響(圖1和圖2)。結(jié)果表明,當(dāng)歸和石斛的醇提液對(duì)靈芝生物量的抑制成劑量效應(yīng),但不同劑量的當(dāng)歸、石斛醇提液均能不同程度地促進(jìn)靈芝胞外多糖的分泌。黨參和牛膝的醇提液在較低劑量(<187.5g生藥量/L培養(yǎng)基)能促進(jìn)靈芝生物量及胞外多糖的增加;黨參在較高劑量(>250g生藥量/L培養(yǎng)基)促進(jìn)靈芝生長(zhǎng)的作用下降,而牛膝則抑制靈芝的生長(zhǎng),但它們都不抑制靈芝胞外多糖的分泌。3不同中藥的活性成分和活性代謝產(chǎn)物的制備工藝靈芝是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥,現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其功效顯著,近年來(lái)利用液體深層發(fā)酵生產(chǎn)靈芝活性成分的技術(shù)日趨成熟。中藥材本身含有多種活性成分,而且其中的某些成分可促進(jìn)靈芝的生長(zhǎng)或代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。靈芝酶活力強(qiáng),利用其強(qiáng)大的分解轉(zhuǎn)化能力,以中藥為培養(yǎng)基或在培養(yǎng)基中添加適量中藥,可能對(duì)中藥中的某些成分進(jìn)行轉(zhuǎn)化,降低中藥的毒副作用或提高其效價(jià)。將現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)與中藥材的加工進(jìn)行有機(jī)的結(jié)合,利用靈芝等藥用真菌對(duì)中藥材進(jìn)行發(fā)酵,可生產(chǎn)包含中藥活性成分、靈芝菌體及其活性代謝產(chǎn)物且藥效較簡(jiǎn)單組方配伍更佳的新型制劑。本文研究了黃芪、薏苡仁、枸杞子、當(dāng)歸、玄參、山藥、黨參、牛膝、石斛和蘆薈的提取液對(duì)靈芝發(fā)酵的影響,除黃芪外,其它中藥的水提液均能促進(jìn)靈芝的生長(zhǎng);薏苡仁、山藥、黨參和牛膝的醇提液亦能促進(jìn)靈芝生物量的增加,但當(dāng)歸和石斛的醇提液則抑制靈芝生長(zhǎng),且呈劑量關(guān)系。在所試驗(yàn)的中藥中,利用靈芝對(duì)薏苡仁、枸杞子、山藥、黨參和牛膝進(jìn)行發(fā)酵加工