薏苡仁多糖提取分離及純化工藝研究

薏苡仁多糖提取分離及純化工藝研究

愛(ài)斯隆又名愛(ài)斯隆，是水稻科的一種干燥、成熟的種子。它寒冷、甜、淡，具有健脾除濕、除關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)痛、清熱解毒的功效。早期藥理研究表明薏苡仁有解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜的作用,對(duì)離體心臟、腸管、子宮有興奮作用。從20世紀(jì)60年代開(kāi)始,中外學(xué)者陸續(xù)報(bào)道了薏苡仁的抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降壓、抗病毒及抑制胰蛋白酶、誘發(fā)排卵等方面的藥理活性。薏苡仁中特有的多糖成分經(jīng)藥理學(xué)研究證明其具有免疫興奮、降低血糖等多種活性功能[11,12,13,14,15,16,17,18],因此薏苡仁多糖提取及純化工藝研究十分必要。1機(jī)器、材料和試劑1.1儀器和檢測(cè)設(shè)備GBCCintra20紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(澳大利亞照生公司);MA200電子天平(上海良平儀器儀表有限公司);DHG-900A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海光地儀器設(shè)備有限公司);HH-Z數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州澳華儀器有限公司)。1.2物薏養(yǎng)殖及其他必修種的制備薏苡仁(貴州興義出產(chǎn),經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系劉芃教授鑒定為禾本科植物薏苡CoixlacrymajobiL.var.mayuen(Roma)Stapf的干燥成熟種仁);葡萄糖(AR);5%重蒸苯酚溶液;濃硫酸;10%三氯乙酸;95%乙醇,試劑均為分析純。2重量測(cè)定2.1對(duì)照溶液的制備精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖對(duì)照品30.08mg,置100mL容量瓶中,加蒸餾水溶解并定容,得葡萄糖對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。2.2油脂法預(yù)處理精密稱取薏苡仁粉末(過(guò)2號(hào)篩)50g,9份,經(jīng)除油脫脂后分別按正交實(shí)驗(yàn)條件,精密加入一定體積的蒸餾水,回流,過(guò)濾,得濾液。精密吸取1mL于50mL容量瓶中,蒸餾水定容至刻度,作為樣品溶液。測(cè)定前充分振搖。2.3試驗(yàn)方法：采用苯乙二醇法測(cè)定茶多酚含量2.3.1濃硫酸鈉wcl顯色法精密稱取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品30.08mg,置100mL容量瓶中,加蒸餾水稀釋至刻度得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取3.0mL,5.0mL,7.0mL,9.0mL,11.0mL,13.0mL分別置于50mL容量瓶中,稀釋至刻度,搖勻后再精密吸取1.0mL至10mL容量瓶中。分別滴加5.0%苯酚溶液(用前配制)1.0mL,搖勻,迅速分別滴加濃硫酸5.0mL,搖勻后置沸水浴中加熱30min,取出用冰水浴迅速冷卻至室溫后,以蒸餾水顯色溶液為空白,于485nm處測(cè)定吸光度值。以取樣量X(mg)為橫坐標(biāo),吸光度Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為:Y=9.0353X-0.0153(r=0.9994)。2.3.2多糖糖代謝成分配測(cè)定精密稱取在40℃干燥至恒重的薏苡多糖50mg,置100mL容量瓶中,用蒸餾水稀釋至刻度,搖勻。經(jīng)除蛋白、脫色等處理后,精密量取處理后溶液的體積,精密吸取處理液0.5mL按2.3.1項(xiàng)下自“加苯酚試劑1mL”起操作,測(cè)定吸光度,求出薏苡多糖供試液中葡萄糖濃度,按公式f=W/C*D計(jì)算換算因子,式中W為多糖質(zhì)量(g),C為多糖液中葡萄糖的濃度(mg·mL-1),D為多糖的稀釋倍數(shù)。結(jié)果f=1.6。2.3.3多糖含量測(cè)定精密量取供試品溶液0.5mL加同等量的水于10mL容量瓶中,以1mL蒸餾水作空白,按2.3.1項(xiàng)方法,自“加苯酚試劑1mL”起操作,測(cè)定吸收度,按下述公式計(jì)算多糖含量:多糖含量%=C*D*f/W*100%。(式中:C為樣品溶液的葡萄糖的濃度(mg);D為樣品溶液的稀釋倍數(shù),f為換算因素,W為樣品的重量(mg))。3方法和結(jié)果3.1正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選用L9(34)正交表,以粗多糖的提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo),以提取次數(shù)(A)、溶劑用量(B)、提取時(shí)間(C)3個(gè)因素為考察對(duì)象,設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn),各因素水平見(jiàn)表1,正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2,方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。對(duì)多糖提取結(jié)果的數(shù)據(jù)進(jìn)行直觀分析并根據(jù)方差分析表,確定最佳提取工藝為A2B1C1,即料液比為1:10,提取次數(shù)為2次,提取時(shí)間為1小時(shí)。3.2最佳工藝放大試驗(yàn)為考察上述實(shí)驗(yàn)方案的穩(wěn)定性,在原處方量基礎(chǔ)上放大10倍,按優(yōu)選后的最佳工藝放大3批產(chǎn)品,分別測(cè)定總多糖的得率。結(jié)果差異較小,RSD<3%,表明該工藝穩(wěn)定可行。3.3關(guān)于粗糖純度的研究3.3.1冷藏、干燥均精密量取濃縮的多糖提取液6份,每份20mL,分別調(diào)醇濃度為40,50,60,70,80,90%,4℃冰箱冷藏過(guò)夜,4000rpm離心10min,沉淀干燥稱重。結(jié)果乙醇濃度和多糖含量呈正比關(guān)系,在90%乙醇濃度時(shí),多糖含量最大。見(jiàn)表4。3.3.2粗多糖含量測(cè)定精密量取濃縮的多糖提取液6份,每份20mL,分別加乙醇使醇含量達(dá)到90%,每隔3h取樣,離心后真空干燥得粗多糖,稱重。結(jié)果當(dāng)醇沉?xí)r間在9h以后,離心干燥所得多糖量變化不大,為節(jié)約時(shí)間和經(jīng)濟(jì)考慮,醇沉?xí)r間定為9h為最佳時(shí)間。見(jiàn)表5。3.4除蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)3.4.1水相蛋白凝膠的制備精密量取濃縮的多糖溶液50mL,逐次加入1/5體積的正丁醇-氯仿混合液(正丁醇:氯仿=1:5),并振搖30min,離心10min(4000rpm)后分去水層和溶劑層交界處的變性蛋白質(zhì)。取3mL水相溶液于比色皿中測(cè)定紫外吸收,蒸餾水為空白,測(cè)完將溶液倒回原液。再次用Sevag試劑除蛋白,多次處理,直到蛋白質(zhì)含量穩(wěn)定。結(jié)果從第6次開(kāi)始,溶液的吸光度趨于穩(wěn)定。3.4.2離心干燥、稱重對(duì)多糖損失率的影響精密量取濃縮的多糖溶液50mL,逐滴加入配制的10%三氯乙酸(臨用前配制)溶液,待溶液中不再有沉淀析出為止,4℃冰箱冷藏過(guò)夜,4000rpm離心20min,除去沉淀,并測(cè)定溶液的吸光度。結(jié)果從20mL開(kāi)始,溶液的吸光度趨于穩(wěn)定。用上述兩種方法除去多糖中蛋白質(zhì)以后的溶液,通過(guò)離心、干燥、稱重,并計(jì)算多糖損失率,結(jié)果見(jiàn)表6。從以上結(jié)果可以看出,用Sevag法和三氯乙酸法除蛋白時(shí),均能有效的除去多糖中的蛋白質(zhì),且用Sevag法比用三氯乙酸法對(duì)多糖的損失率要高,所以用三氯乙酸法除去薏苡仁多糖中的蛋白質(zhì)。4兩種脫蛋白方法所得多糖中總糖含量、聚乙酸、三氯乙酸法優(yōu)勢(shì)4.1在水提薏苡仁多糖中水溶性蛋白質(zhì)占去很大部分,所以蛋白質(zhì)的去除相當(dāng)重要。而經(jīng)過(guò)我們的實(shí)驗(yàn)Sevag法和三氯乙酸法都能很好去除蛋白,兩種脫蛋白方法所得多糖中蛋白質(zhì)的量以及多糖的損失率為:Sevag法為24.3%;