薏苡仁生物轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化及其對a549肺癌細(xì)胞的抑制作用

薏苡仁生物轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化及其對a549肺癌細(xì)胞的抑制作用

愛斯隆是水稻科的一種干燥成熟的植物。它通常被用作中藥。它具有健脾、補(bǔ)水、清熱、調(diào)肺的功效。它被稱為“營養(yǎng)之王”。根據(jù)本草綱目，它被稱為高品質(zhì)的休息藥。流行病學(xué)家認(rèn)為中國東南部癌癥發(fā)病率較低是因?yàn)槟抢锏娜讼彩侈曹?多種實(shí)驗(yàn)及臨床結(jié)果表明:薏苡仁在體內(nèi)、體外都有明顯的抗癌效果,特別是在預(yù)防癌癥方面有很好的效果。隨著中藥研究手段的改進(jìn),用生物轉(zhuǎn)化的方法處理中藥是促進(jìn)中藥發(fā)展、實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化的重要途徑。有關(guān)資料和筆者的活性測定表明:薏苡仁抗腫瘤活性主要在甲醇提取物中,為了優(yōu)化薏苡仁的生物轉(zhuǎn)化條件,提高其活性成分的含量,更好地發(fā)揮其藥用功效,本實(shí)驗(yàn)以薏苡仁甲醇總提取物得率為指標(biāo),考察多種因素對轉(zhuǎn)化條件的影響,并比較轉(zhuǎn)化前后甲醇總提取物對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用,為進(jìn)一步研究薏苡仁的生物轉(zhuǎn)化提供基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1目篩目篩新鮮干燥薏苡仁,購于藥材市場,粉碎至能過40目篩。云南大學(xué)教育部微生物資源開放研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室篩選到的米根霉(Rhizopusoryzae)。1.1.2小麥培訓(xùn)麥麩100g,加90mL蒸餾水,攪拌均勻,1.05kg/cm2,121.3℃滅菌20min,pH自然。1.1.3腫瘤細(xì)胞瘤人非小細(xì)胞A549肺癌細(xì)胞株為武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心提供。1.1.4甲基亞和mtt甲醇為分析純;鬼臼毒素:云南師范大學(xué)張無敵老師贈(zèng),純度在95%以上;二甲基亞砜(DMSO)、MTT均為Sigma公司產(chǎn)品;胰酶、RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco公司;胎牛血清,杭州四季青生物工程材料有限公司。1.1.5凈化設(shè)備和培養(yǎng)板SHI-22型水浴恒溫振蕩器(江蘇太倉醫(yī)療器械廠);電子天平(中山市新和基科技開發(fā)有限公司);真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(BUCHI公司生產(chǎn)),生物顯微鏡:日本Olympus公司生產(chǎn),BH-2型;倒置相差顯微鏡:日本Olympus公司生產(chǎn),CK-2型;醫(yī)用凈化工作臺(tái):蘇州凈化設(shè)備公司生產(chǎn),YJ-1450型;CO2培養(yǎng)箱:德國Hereaus公司生產(chǎn);低溫高速離心機(jī):德國Hereaus公司生產(chǎn),分別為Biofuge15R型和Megafuge1.0R型;一次性96孔培養(yǎng)板:美國Falcon公司生產(chǎn);酶標(biāo)板自動(dòng)讀數(shù)儀:美國Bioteck公司生產(chǎn),BL340型。1.2方法1.2.1轉(zhuǎn)化細(xì)菌飼料的制備米根霉接種于麥麩培養(yǎng)基,28℃培養(yǎng)48h,低溫干燥菌體培養(yǎng)物,粉碎至能過120目篩。1.2.2杏仁的微生物轉(zhuǎn)化稱取薏苡仁30g,加水50mL,使其充分濕潤。再加入不同量的轉(zhuǎn)化菌培養(yǎng)物,在不同溫度的振蕩器內(nèi)水浴振蕩處理不同的時(shí)間。1.2.3甲醇的提取在轉(zhuǎn)化處理后的薏苡仁中加入100mL甲醇,常溫浸泡提取24h,過濾,濾渣再用甲醇浸泡提取24h,合并濾液?；厥占状?得薏苡仁轉(zhuǎn)化后甲醇總提取物得率。1.2.4正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)預(yù)試驗(yàn),選轉(zhuǎn)化物用量、轉(zhuǎn)化溫度、轉(zhuǎn)化時(shí)間作為觀察的3個(gè)因素,每個(gè)因素選擇4個(gè)水平采用L16(45)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì),因素水平見表1。1.2.5細(xì)胞增殖抑制率測定取對數(shù)生長的人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞株,用0.05%胰蛋白酶消化離心,用4g/L臺(tái)盼藍(lán)染色后計(jì)算細(xì)胞存活率(Via>98%),調(diào)整細(xì)胞懸液密度為3×104/mL,接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每空90μL,其中四個(gè)孔不加培養(yǎng)基和細(xì)胞,作為空白對照。細(xì)胞在37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,使細(xì)胞貼壁。用培養(yǎng)基將薏苡仁轉(zhuǎn)化前后甲醇提取物稀釋成不同倍數(shù)樣品,將樣品分別加入孔中,其中每一設(shè)4個(gè)垂直孔,每孔10μL。陰性對照為等體積的RPMI-1640完全培養(yǎng)液,陽性對照為鬼臼毒素。置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中溫育48h后,每空加入5mg/mLMTT20μL,繼續(xù)保溫4h。吸去培養(yǎng)基,每孔加入DMSO150μL,在水平搖床上振蕩30min至結(jié)晶全部溶解,用酶標(biāo)儀在570nm波長下測定吸光度(A)值。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=(1-A實(shí)驗(yàn)/A對照)×100%1.2.6統(tǒng)計(jì)分析全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13軟件處理,統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用成組數(shù)據(jù)的t檢驗(yàn)。2結(jié)果與分析2.1轉(zhuǎn)化時(shí)間和轉(zhuǎn)化溫度對納米企業(yè)甲醇總提取物得率的影響結(jié)果見表2,方差分析見表3。從極差R值和方差F值分析可見,各因素指標(biāo)對轉(zhuǎn)化后薏苡仁甲醇總提取物量的影響程度依次為C>A>B,方差分析表明,轉(zhuǎn)化溫度對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有非常顯著性的影響(P<0.01),而加入的轉(zhuǎn)化物含量及轉(zhuǎn)化時(shí)間不同水平間無顯著差異(P>0.05)。生物轉(zhuǎn)化的實(shí)質(zhì)是酶促反應(yīng),酶活性的發(fā)揮需要一個(gè)最適溫度,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明60℃對米根霉培養(yǎng)物中的酶類來說是一個(gè)相對最合適的溫度,有利于薏苡仁中不同化學(xué)成分的轉(zhuǎn)化。甲醇總提取物得率隨著轉(zhuǎn)化物含量的提高而提高,說明在轉(zhuǎn)化物含量為5%的時(shí)候,其中的酶類還沒有被底物飽和,還有繼續(xù)增加轉(zhuǎn)化物含量的余地,考慮到實(shí)際應(yīng)用的問題,過高菌體含量會(huì)影響轉(zhuǎn)化產(chǎn)物成分的分離,故將米根霉轉(zhuǎn)化物含量定為5%。轉(zhuǎn)化時(shí)間對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不大,但考慮到酶促反應(yīng)產(chǎn)物的量會(huì)隨著時(shí)間延長而增加,時(shí)間過長雜菌會(huì)生長起來,因此綜合正交試驗(yàn)結(jié)果,確定最佳轉(zhuǎn)化時(shí)間定為10h。經(jīng)多次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明采用優(yōu)化后的轉(zhuǎn)化條件處理薏苡仁,其甲醇總提取物得率無顯著性的差異,比較穩(wěn)定。綜合分析得中藥薏苡仁的最佳生物轉(zhuǎn)化條件組合為A4B2C2,即5%的轉(zhuǎn)化物含量,轉(zhuǎn)化時(shí)間為10h,轉(zhuǎn)化溫度為60℃。2.2在椰子轉(zhuǎn)化前后，甲醇總提取物對5a49細(xì)胞的細(xì)胞毒作用結(jié)果見表4。轉(zhuǎn)化處理后,薏苡仁甲醇提取物對A549人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株體外增殖的抑制率在相同濃度下均明顯高于轉(zhuǎn)化前。3主要的微生物轉(zhuǎn)化及活性成分的確定通過正交試驗(yàn)分析可知,轉(zhuǎn)化溫度是影響轉(zhuǎn)化效果的主要因素,通過生物轉(zhuǎn)化薏苡仁的甲醇總提取物得率得到了大幅度的提高。可能的機(jī)制為:薏苡仁中大分子物質(zhì)經(jīng)轉(zhuǎn)化菌中的酶類降解,有利于小分子物質(zhì)的釋放;轉(zhuǎn)化菌能將一些大分子物質(zhì)直接降解成小分子物質(zhì),從而使小分子物質(zhì)的提取得率增加。米根霉是釀酒工業(yè)上常用的菌株,也是生物轉(zhuǎn)化研究中的常用菌株,它能夠產(chǎn)生豐富的酶類:糖化酶、淀粉酶、脂肪酶、酯酶等,這些酶類成分對薏苡仁中的多樣成分起到了一種復(fù)合轉(zhuǎn)化效果,這可能是轉(zhuǎn)化處理能提高薏苡仁的甲醇提取物含量的機(jī)制之一。相關(guān)資料報(bào)道薏苡仁甲醇提取物有抗肺癌、肝癌、乳腺癌等活性,本實(shí)驗(yàn)選擇A549細(xì)胞株,比較轉(zhuǎn)化前后甲醇提取物部位的抗腫瘤活性,結(jié)果表明轉(zhuǎn)化處理后薏苡仁甲醇總提取物的活性明顯高于未轉(zhuǎn)化薏苡仁,初步說明通過生物轉(zhuǎn)化能增加薏苡仁對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用,轉(zhuǎn)化處理增加其抗腫