卵母細胞漿內(nèi)單精子注射卵母細胞的卵母細胞及卵裂胚胎發(fā)育質(zhì)量分析

卵母細胞漿內(nèi)單精子注射卵母細胞的卵母細胞及卵裂胚胎發(fā)育質(zhì)量分析

自1992年以來，palm通過在全世界首次報告了卵母細胞內(nèi)單次精神試驗（icsi）技術獲得正常收養(yǎng)以來，icsi作為治療男性不育因素的有效措施，已成為世界上廣泛開發(fā)的一項重要的輔助生殖技術。顯微注射受精是ICSI技術中最關鍵的一個環(huán)節(jié),與手術的結果有著密切的關系,國內(nèi)目前對此研究很少,我們對顯微注射受精過程中最主要的兩個因素第一極體的位置和卵母細胞膜穿破類型對受精和胚胎發(fā)育的影響進行了研究。1數(shù)據(jù)和方法1.1男、女平均年齡和平均定位時間比較2001年8月至2002年1月在本中心接受ICSI治療的患者86例,共91個周期,女方平均年齡為(32.0±4.8)歲(21~46歲),男方平均年齡為(33.9±4.9)歲(29~48歲),平均不育時間為(6.4±3.5)年(2~15年)。適應證為嚴重少、弱、畸精癥、阻塞性無精癥或盡管精液分析正常,但曾行常規(guī)IVF受精失敗的患者。1.2方法1.2.1加用重組促卵激素與人絕經(jīng)期促性腺激素聯(lián)合促進泡菜發(fā)育所有患者均應用長方案誘導控制性超排卵,在手術周期前一個月的黃體高峰期應用促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a)降調(diào)節(jié),本周期月經(jīng)來潮第3d加用重組促卵泡成熟激素(Gonal-F)和人絕經(jīng)期促性腺激素(Pergonal)聯(lián)合促進卵泡發(fā)育。當2~3個優(yōu)勢卵泡直徑大于18mm時,注射人絨毛膜促性腺激素(profasi),35h后B超引導下經(jīng)陰道采卵。采卵后3~4h,將卵冠丘復合物(OCC)置于透明質(zhì)酸酶中脫顆粒,只有成熟的MⅡ期卵母細胞用于ICSI。精液應用上游法處理。1.2.2顯微注射方式使用Zeiss公司的倒置顯微鏡和顯微注射儀,IVM公司的顯微操作針進行顯微注射受精。隨機固定卵母細胞使第一極體于6點或12點的位置,進行顯微注射。根據(jù)顯微注射過程中卵母細胞胞膜穿破方式的不同,將其分為兩種,A:顯微注射針直接進入胞漿內(nèi),卵膜穿破,不形成凹痕,如果顯微注射針輕易穿破卵膜形成輕微凹痕者也歸于本組;B:顯微注射針進入卵母細胞內(nèi),回吸少量胞漿,卵膜在細胞中部穿破,形成輕微的凹痕。對于A、B兩組卵母細胞,顯微注射針進針后均回吸少量胞漿,再將精子注入,對極體位置和卵膜穿破方式分別進行記錄。顯微注射受精均由同一操作者完成。1.2.3卵裂球數(shù)目和碎片數(shù)量顯微注射受精后15~17h檢查原核,有兩個原核和兩個極體存在者認為是正常受精。將受精后第3d的胚胎根據(jù)卵裂球數(shù)目和碎片數(shù)量分為三級:Ⅰ級胚胎為卵裂球數(shù)目≥6個,大小基本一致,碎片≤10%;Ⅱ級為卵裂球數(shù)目≥4個,大小均勻或輕度不均勻,碎片≤50%;Ⅲ級為卵裂球數(shù)目<4個,大小均勻或差別較大,碎片>50%。1.2.4胎室患者hc、-hcg融合受精后第3d,選擇質(zhì)量較好的3~4個胚胎移植并給予黃體酮肌注進行黃體支持,移植后14d檢測尿、血HCG、β-HCG診斷妊娠,5周后B超檢查孕囊、胚芽和胎心搏動。1.3統(tǒng)計處理數(shù)據(jù)行χ2檢驗。2m期卵母細胞獲卵數(shù)及生物量本研究中86例患者91個采卵周期共獲卵947個,每周期平均獲卵數(shù)為10.4個,MⅡ期卵母細胞共782個(82.6%),生化妊娠35例,臨床妊娠34例。因為收集病例數(shù)目有限,故未將妊娠率納入本研究中進行評價。2.1卵母細胞存活率、受精率、卵裂胚胎發(fā)育情況顯微注射受精過程中,第一極體位于6點時的卵母細胞存活率、卵母細胞受精率、卵裂胚胎發(fā)育質(zhì)量均略高于12點位置,但差異均無顯著性(P>0.05),見表1。2.2引物多態(tài)性與卵母細胞特征經(jīng)顯微注射受精的A、B組卵母細胞分別為172個和610個,A組的卵母細胞存活率為83.7%,B組為96.7%,A組明顯低于B組,差異具有極顯著的統(tǒng)計學意義(P<0.01),見表2。正常受精的A、B組卵母細胞分別為121個和507個,A組受精率為70.3%,B組為84.2%,差異具有顯著性(P<0.05)。受精后第3d卵裂胚胎中,A組的Ⅰ級胚胎占25.8%,B組的Ⅰ級胚胎占37.7%,A組高質(zhì)量胚胎明顯少于B組,差異具有顯著性(P<0.05)。3討論3.1極體部位的影響多項研究表明90%左右的卵母細胞的紡錘體位于第一極體附近的位置,故顯微注射受精時多用第一極體作為卵母細胞紡錘體位置的定位參照。對于第一極體位置與卵母細胞受精和卵裂的關系,許多學者的結論并不完全一致。Asch等認為進行顯微操作時,注射針從3點的位置穿破卵母細胞膜,針尖開口向下,則注射針下方的胞漿及其顯微結構更有可能因回吸引起丟失和破壞,既使得卵母細胞易于退化,也進而影響受精和胚胎發(fā)育。精子在卵母細胞內(nèi)沉積的位置及其與紡錘體的距離也非常重要,當精子注入卵母細胞內(nèi)之后,距離紡錘體越近,就有可能更好更早地激活卵母細胞,使之受精;距離越遠,則受精延遲,胚胎的發(fā)育也相對緩慢,因此極體位于6點時有較高的受精率,也利于胚胎的早期發(fā)育。本研究結果顯示極體位于6點時的卵母細胞存活率、卵母細胞受精率均略高于12點位置,但差異不顯著,與Nagy等的結論一致,而在Nagy的研究中,極體位于6點時發(fā)育成的胚胎質(zhì)量優(yōu)于12點的位置,Blake等對不同極體位置的研究顯示極體位于7點或11點時高質(zhì)量胚胎的比例和胚胎的種植率最高,本研究極體在6點位置時卵母細胞的受精和胚胎發(fā)育的質(zhì)量略優(yōu)于12點位置,但差別不顯著,關鍵是顯微注射受精時精子沉積的位置既要靠近紡錘體利于受精,又要避免對紡錘體周圍的胞漿影響過大,這是促進受精和胚胎發(fā)育的關鍵。最近PolScope和SpindleView影像系統(tǒng)的出現(xiàn)使操作者在顯微操作過程中可以直接看到紡錘體,從而方便了顯微注射點和精子沉積位置的選擇,將有助于提高受精率和胚胎的發(fā)育。3.2膜穿破方式a組的優(yōu)點本研究顯示A組卵母細胞的存活率、卵母細胞受精率、卵裂胚胎發(fā)育質(zhì)量均低于B組,差異具有顯著性,與以往文獻報道一致。卵母細胞膜穿破的方式與許多主、客觀因素有關,如操作者的操作技巧、熟練程度,顯微注射針的質(zhì)量,顯微操作系統(tǒng)的機械問題等都會影響ICSI的效果。在眾多的因素中,卵母細胞膜的彈性是最為重要的。對鼠卵母細胞顯微注射受精的研究提示B組卵母細胞膜穿破方式中形成的凹痕可防止卵母細胞退化,因為彈性凹痕的形成緩沖了胞漿回吸造成的壓力,有助于胞膜完整性的恢復,減少了胞漿和部分細胞器的破壞和丟失,A組膜穿破方式提示卵母細胞膜彈性不足,脆性偏高,使得注射針的沖擊力對卵母細胞顯微結構的破壞性加強,故而A組細胞存活率低,易退化。另一方面,卵膜的穿破方式和卵母細胞本身的質(zhì)量有密切的關系,有研究指出卵母細胞膜穿破方式的差異可能是由膜本身脂蛋白結構上的糖基支鏈等的不同所決定的。Palermo等還認為A組卵膜穿破方式和病人促排卵時間短