souiq-5誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞自噬

souiq-5誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞自噬

端粒是真核細(xì)胞染色體的自然末端。它在預(yù)防染色末期的分解和融合、維護(hù)染色體穩(wěn)定性以及抵制染色末端的復(fù)制方面發(fā)揮著重要作用。人端粒DNA由5′-(TTAGGG)-3′重復(fù)序列和一個(gè)3′懸突端(overhang)組成,富含鳥(niǎo)嘌呤重復(fù)序列的DNA鏈能夠形成G-四鏈體。SYUIQ-5是具有吲哚和喹啉結(jié)構(gòu)的白葉藤堿衍生物,我們?cè)鴪?bào)道它能穩(wěn)定和誘導(dǎo)G-四鏈體,并能抑制c-myc啟動(dòng)子和端粒酶活性。自噬是一種進(jìn)化過(guò)程高度保守的細(xì)胞行為,是細(xì)胞在能量缺乏、代謝等壓力下的自我降解過(guò)程。自噬不僅具有維持細(xì)胞自我穩(wěn)態(tài)、促進(jìn)細(xì)胞生存的作用,過(guò)度上調(diào)的自噬作用也可以引起細(xì)胞死亡,即“自噬性細(xì)胞死亡”,也稱為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡。很多研究表明自噬在細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育和疾病發(fā)生中起著重要的作用。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)Atg5敲除能抑制SYUIQ-5介導(dǎo)的自噬和細(xì)胞死亡,說(shuō)明SYUIQ-5通過(guò)誘導(dǎo)自噬促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究SYUIQ-5誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬及其分子機(jī)制。1材料和方法1.1血清因子及谷氨酰胺的制備人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2、CNE1、HONE1由中山大學(xué)腫瘤防治中心保存,用含有10%的胎牛血清、100μg/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素、2mmol/L谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。細(xì)胞在37℃和5%CO2實(shí)驗(yàn)條件下培養(yǎng)。所有實(shí)驗(yàn)均在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行。1.2菌株和試劑胎牛血清購(gòu)自Gibco公司;化學(xué)發(fā)光劑(ECL)及Beclin1、FOXO3a抗體購(gòu)自CellSignal公司;Akt、p-Akt、BNIP3、GAPDH以及HRP標(biāo)記的二抗均為SantaCruz公司產(chǎn)品;LC3抗體購(gòu)于Novus生物公司,細(xì)胞裂解液來(lái)自Upstate生物技術(shù)公司;BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自Pierce公司;M-MLV來(lái)自Promega公司;逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR)反應(yīng)試劑、Taq酶均購(gòu)自上海申能博采公司;siRNA由上海吉瑪公司合成;引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成;白葉藤堿類似物SYUIQ-5由中山大學(xué)藥學(xué)院合成,用100%DMSO溶解,濃度為50μg/mL,-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?.3逆轉(zhuǎn)錄pcr收集經(jīng)處理的細(xì)胞,PBS洗滌2次,加入細(xì)胞裂解液100μL,12000r/min離心15min,定量蛋白,取20μg蛋白,加入上樣緩沖液,95℃下變性10min。10%~15%的聚丙烯酰胺SDS凝膠電泳后,電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上,5%脫脂牛奶封閉后依次加入一抗、二抗,在室溫下孵育2h,TBST緩沖液(10mmol/LTris-HCl,pH7.4,150mmol/LNaCl,0.1%Tween20)洗滌3次,每次10min,暗室ECL顯色。收集經(jīng)藥物處理的細(xì)胞,PBS洗滌2次,加入1mL的Trizol(Invitrogen),按照說(shuō)明書(shū)提示的步驟抽提出RNA。在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中,先將2μgRNA與0.5μgOlig(dT)混合,加DEPC水定量至15μL,70℃孵育5min后置于冰上;再加5μL5×M-MLV反應(yīng)緩沖液,1.25μL4×dNTP(10mmol/L),1μLM-MLV(Promega,200U/μL),0.625μLRNaseOUTTM(40U/μL),并加DEPC水總反應(yīng)體系調(diào)量至25μL,42℃孵育60min,然后在75℃孵育10min中止反應(yīng)。PCR反應(yīng)過(guò)程中,在冰上依次加入反應(yīng)體系:10×PCR緩沖液(內(nèi)含有MgCl2)2.5μL,4×dNTP(10mmol/L)0.5μL,cDNA1μL,P10.5μL,P20.5μL,Taq酶0.25μL,ddH2O19.75μL。按下列反應(yīng)條件反應(yīng):變性94℃30s(第一個(gè)循環(huán)5min),退火55~68℃40s,延伸72℃60s(最后一次循環(huán)為10min),擴(kuò)增30~35個(gè)循環(huán)。取10μL擴(kuò)增產(chǎn)物上樣到1.2%瓊脂糖凝膠電泳,紫外光下觀察攝影。LC3引物序列:上游引物5′-GTTGCTGACTGACCCTCCA-3′;下游引物5′-CGTCTTTCTCCTGCTCGTAG-3′。BNIP3引物序列:上游引物5′-GAAACAGATACCCATAGCA-3′;下游引物5′-GAACGCAGCATTTACAGA-3′。GAPDH引物序列:上游引物5′-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3′;下游引物5′-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCAGGTCCACC-3′。1.5免疫組化處理取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,稀釋成3×105個(gè)/mL,接種于24孔板(孔板上鋪有NUNC玻片)。24h后見(jiàn)細(xì)胞基本貼壁,加入藥物作用一定時(shí)間后,取出玻片,PBS洗2次,用4%多聚甲醛固定細(xì)胞20min,并加入0.1%TritonX-10010min,PBS洗3次。在常溫下用封閉液封閉1h后加入一抗FOXO3a,在室溫下孵育2h,PBS洗3次。然后在避光下加入標(biāo)記羅丹紅的兔二抗,室溫下孵育1h。PBS洗3次。再用DAPI染核,90%的甘油封片。最后在共聚焦顯微鏡下觀察。1.6轉(zhuǎn)染、實(shí)驗(yàn)和培養(yǎng)取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE2細(xì)胞,用10%RPMI-1640培養(yǎng)液(不含血清)稀釋成5×105個(gè)/mL,接種于6孔板。24h后見(jiàn)細(xì)胞基本貼壁,細(xì)胞密度為50%~70%,將原培養(yǎng)液吸出,加入轉(zhuǎn)染試劑,轉(zhuǎn)染終濃度為100nmol/L,培養(yǎng)6~8h后將轉(zhuǎn)染液吸出,再加入10%RPMI-1640培養(yǎng)液(不含血清),并加入藥物,培養(yǎng)一定時(shí)間后收細(xì)胞并進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。siBNIP3:正義鏈5′-GCUACUCUCAGCAUGAGAAtt-3′,反義鏈5′-UUCUCAUGCUGAGAGUAGCtg-3′。2結(jié)果2.1dmso檢測(cè)用0.25~2.0μg/mL的SYUIQ-5分別處理CNE2、CNE1和HONE1細(xì)胞48h,0.1%的DMSO為對(duì)照,Westernblot檢測(cè)可見(jiàn)LC3(LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ)表達(dá)增強(qiáng),LC3-Ⅱ較LC3-Ⅰ增強(qiáng)更明顯。BNIP3蛋白表達(dá)也隨SYUIQ-5濃度的增加而增強(qiáng),而CNE2細(xì)胞中Beclin1表達(dá)無(wú)明顯改變(圖1)。2.2sq-5處理用不同濃度SYUIQ-5(0.25~2.0μg/mL)處理CNE224h或48h,不同濃度SYUIQ-5處理CNE1或HONE148h,0.1%DMSO作為對(duì)照。PCR檢測(cè)LC3和BNIP3的表達(dá)。結(jié)果可見(jiàn),SYUIQ-5處理后,LC3在mRNA水平出現(xiàn)上調(diào),而B(niǎo)NIP3mRNA無(wú)明顯變化(圖2)。2.3pakt蛋白表達(dá)水平測(cè)定用不同濃度的SYUIQ-5(0.25~2.0μg/mL)處理CNE2細(xì)胞48h后,Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)pAkt蛋白表達(dá)水平明顯下降,并呈劑量依賴性(圖3);而總的Akt在這一過(guò)程中無(wú)明顯變化。2.4細(xì)胞定位觀察用0.1%DMSO和3.0μg/mL的SYUIQ-5分別作用CNE2細(xì)胞24h后,在共聚焦顯微鏡下觀察用藥前后FOXO3a在細(xì)胞中的定位。結(jié)果表明,對(duì)照組FOXO3a主要在胞漿中分布,SYUIQ-5處理組則顯示FOXO3a集中分布在胞核中(圖4)。2.5westernbnip3表達(dá)用siRNA干擾BNIP3,陰性對(duì)照為一無(wú)意義的RNA片段。24h后再分別用0.1%DMSO或SYUIQ-5(0.25~2.0μg/mL)處理CNE2細(xì)胞24h,Westernblot結(jié)果如圖5所示。siBNIP3組BNIP3表達(dá)顯著下調(diào),說(shuō)明干擾有效;LC3表達(dá)相對(duì)NC組也明顯減弱,說(shuō)明BNIP3在SYUIQ-5誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬中起著重要作用。3syiq-5對(duì)cne2細(xì)胞自噬和bnip3表達(dá)的影響SYUIQ-5是具有吲哚和喹啉結(jié)構(gòu)的白葉藤堿衍生物,我們?cè)鴪?bào)道它能穩(wěn)定G-四鏈體結(jié)構(gòu),抑制腫瘤細(xì)胞端粒酶活性以及誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生遲發(fā)型凋亡。在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)SYUIQ-5能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬,抑制Akt的激活,誘導(dǎo)FOXO3a移位到胞核,并能上調(diào)自噬相關(guān)基因BNIP3的表達(dá)。本文主要探討SYUIQ-5誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的分子機(jī)制。自噬現(xiàn)象是一種高度保守的細(xì)胞行為,是細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝的重要途徑。相對(duì)于主要降解短半衰期蛋白質(zhì)的泛素—蛋白酶體系統(tǒng),細(xì)胞的自噬被認(rèn)為參與絕大多數(shù)長(zhǎng)半衰期蛋白質(zhì)的降解,表現(xiàn)為細(xì)胞漿中出現(xiàn)大量包裹著細(xì)胞漿和細(xì)胞器的空泡結(jié)構(gòu)和溶酶體對(duì)空泡內(nèi)成分的降解。自噬與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖以及腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。LC3是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中酵母ATG8(Aut7/Apg8)基因的同源物,定位于前自噬泡和自噬泡膜表面,是細(xì)胞自噬泡膜的通用標(biāo)記物。細(xì)胞中新合成的LC3經(jīng)過(guò)加工,成為胞漿可溶性LC3-Ⅰ,后者經(jīng)泛素樣加工修飾過(guò)程,與自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合,稱為L(zhǎng)C3-Ⅱ。LC3-Ⅱ含量的多少與自噬泡數(shù)量的多少成正比,因此LC3-Ⅱ含量的變化在某種程度上反映了細(xì)胞的自噬活性。當(dāng)用SYUQ-5處理CNE2、CNE1和HONE1細(xì)胞后,LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)均有增加,LC3-Ⅱ較LC3-Ⅰ表達(dá)更強(qiáng),增加更明顯。RT-PCR顯示LC3在mRNA水平也有所增強(qiáng),說(shuō)明SYUIQ-5處理后能在轉(zhuǎn)錄水平增強(qiáng)LC3的表達(dá),表明SYUIQ-5能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬,且上調(diào)LC3的表達(dá)。作為Forkhead轉(zhuǎn)錄因子家族的一員,FOXO3a在骨骼肌細(xì)胞中能促進(jìn)自噬相關(guān)基因LC3的轉(zhuǎn)錄。Forkhead轉(zhuǎn)錄因子家族成員是PI3K/AKTPKB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑下游重要的靶基因。AKT作為蛋白激酶,對(duì)細(xì)胞的生存和抗凋亡的調(diào)控是通過(guò)對(duì)一系列底物的磷酸化而實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)Akt沒(méi)有被激活時(shí),Forkhead蛋白通常位于細(xì)胞核內(nèi),促進(jìn)凋亡基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)不同的生長(zhǎng)因子刺激細(xì)胞并激活A(yù)kt后,Akt從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核并磷酸化FOXO3a。磷酸化的FOXO3a被轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞核后與胞質(zhì)蛋白14-3-3鰲合在一起而失去了對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄功能,從而不能促進(jìn)凋亡基因的轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致細(xì)胞增殖。因此,當(dāng)細(xì)胞處于增殖狀態(tài)時(shí),FOXO3a主要分布在胞漿中。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí),FOXO3a則主要分布在胞核中。為探討SYUIQ-5對(duì)CNE2細(xì)胞Akt-FOXO3a途徑的影響,我們用SYUIQ-5處理CNE2細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)p-AKT水平下調(diào),而總的AKT表達(dá)不受影響。共聚焦顯微鏡下觀察到對(duì)照組(0.1%DMSO)的FOXO3a主要分布在胞漿,而SYUIQ-5處理組則集中分布在胞核中。這說(shuō)明SYUIQ-5可能通過(guò)抑制CNE2細(xì)胞中Akt的激活使FOXO3a定位于胞核,從而促進(jìn)LC3的轉(zhuǎn)錄,增加LC3的表達(dá),誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬。Beclin1和BNIP3都是自噬過(guò)程中重要的調(diào)節(jié)因子。哺乳動(dòng)物Beclin1是酵母Apg6/Vps30基因的同源物。有研究表明,Beclin1是Autophagy重要的正調(diào)節(jié)因子。BNIP3是bcl-2家族中BH3-only亞家族的成員,具有BH3結(jié)構(gòu)域和跨膜區(qū),屬于促凋亡蛋白。BNIP3可以通過(guò)促進(jìn)線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開(kāi)放和線粒體損傷而誘導(dǎo)凋亡,其表達(dá)受缺氧和其他因素的影響。VandeVelde等首次報(bào)道了BNIP3誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡與自噬現(xiàn)象的發(fā)生有關(guān)。BNIP3的高表達(dá)能導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生自噬。盡管有一些實(shí)驗(yàn)?zāi)茏C明BNIP3誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡與自噬有關(guān),但其具體機(jī)制仍不太清楚。用SYUIQ-5處理后,CNE2、CNE1和HONE1的BNIP3在蛋白水平表達(dá)增強(qiáng),而mRNA沒(méi)有明顯改變,說(shuō)明SYUIQ-5引起的BNIP3高表達(dá)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后環(huán)節(jié)。用siRNA干擾CNE2細(xì)胞中BNIP3的表達(dá)后,LC3也隨之減弱,說(shuō)明在SYUIQ-5誘導(dǎo)的自噬過(guò)程中BNIP3起重要作用。目前,對(duì)于自噬究竟是阻礙腫瘤發(fā)生的屏障還是腫瘤的自我保護(hù)應(yīng)答仍存在爭(zhēng)議。在本研究中我們發(fā)現(xiàn),靶向G-四鏈體的小分子化合物SYUIQ-5可能通過(guò)抑