葉酸受體修飾的cdecds量子點熒光探針的制備及初步驗證

葉酸受體修飾的cdecds量子點熒光探針的制備及初步驗證

量化點（quantumdot，qd）是納米原子和分子的集合，粒徑范圍為2.20nm，通常由-w族或-w族元素組成。因其介于體相材料與分子間的物質(zhì)狀態(tài),故展示出許多特殊的光、電、磁、催化等性質(zhì)。近年來,量子點的研究備受關(guān)注,其應(yīng)用領(lǐng)域越來越廣泛,特別是其在免疫生物學(xué)和臨床檢驗學(xué)等研究中顯示出潛在的良好應(yīng)用前景。在生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用中,量子點和傳統(tǒng)有機熒光染料相比具有以下特性:激發(fā)光譜寬而連續(xù),吸光系數(shù)大,熒光強度高,熒光發(fā)射峰窄而對稱,無長波拖尾等,而且量子點不同的組成或粒徑大小具有不同顏色的熒光,這樣就可以在同一激發(fā)光下獲得不同顏色的標(biāo)記成像。利用上述特點可以合成高品質(zhì)的量子點熒光探針。Ⅱ-Ⅵ型量子點有高量子效率和高質(zhì)量光發(fā)射,隨尺寸改變在可見光區(qū)具有寬的發(fā)射范圍,而CdTe量子點發(fā)射光譜隨尺寸變化可覆蓋整個可見光區(qū),從而成為研究熱點之一。在量子點應(yīng)用方面,量子點的量子產(chǎn)率和穩(wěn)定性對其應(yīng)用有最直接的影響。因此,如何合成高量子產(chǎn)率的量子點成為CdTe量子點研究的重要課題之一。研究表明:不同的pH、穩(wěn)定劑及Cd、Te、穩(wěn)定劑之間比例均對量子點的量子產(chǎn)率及穩(wěn)定性產(chǎn)生較大影響。國內(nèi)外很多學(xué)者有這方面研究,例如:Zhao等通過改變Cd與Te的物質(zhì)的量之比,將CdTe量子點的熒光量子產(chǎn)率提高到34%;Shavel等通過改變Cd與TGA的物質(zhì)的量之比及反應(yīng)的pH值,合成了熒光量子產(chǎn)率為50%的CdTe量子點。癌癥是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一,僅僅2008年大約有1270萬新增病例,760萬患者死于癌癥。目前降低癌癥死亡率的最佳途徑就是早期診斷。葉酸(folicacid,FA)是一種人體必需的維生素,它主要通過葉酸受體轉(zhuǎn)運,除了在脈絡(luò)叢、胎盤、肺、胸腺、腎臟中葉酸受體低水平表達(dá)外,在大多數(shù)正常組織極少表達(dá)。而在許多腫瘤包括頭頸部腫瘤組織中葉酸受體呈高水平表達(dá)。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌細(xì)胞株HNE-1、喉癌組織及細(xì)胞株Hep-2也高表達(dá)葉酸受體?；谌~酸受體表達(dá)的組織分布特點、葉酸與葉酸受體的高度親和性,為葉酸受體介導(dǎo)的腫瘤熒光探針檢測和靶向治療提供了良好的分子基礎(chǔ)。為了尋找一種新的鼻咽癌早期診斷方法,我們首先采用水相合成法,以巰基丁二酸為穩(wěn)定劑,在pH=10,n(Te2+):n(Cd2-):n(MSA)=1:10:10.5條件下合成了一種穩(wěn)定的量子產(chǎn)率高達(dá)72.5%的CdTe量子點,再通過雙氨基聚乙二醇(PEG(NH2)2)作為偶聯(lián)中介,制備了偶聯(lián)葉酸的量子點熒光探針,并對高表達(dá)葉酸受體的鼻咽癌細(xì)胞進(jìn)行體外標(biāo)記成像研究,現(xiàn)將結(jié)果報道如下。1材料和方法1.1試劑和儀器CNE-2,中山大學(xué)動物實驗中心細(xì)胞庫提供;HNE-1和Hep-2,中南大學(xué)細(xì)胞庫提供;碲粉(Te純度為99.99%,購于Sigma公司),硼氫化鈉(NaBH4,AR級)、氯化鎘(CdCl2,AR級)、巰基丁二酸(MSA,AR級)、硫化鈉(Na2S,AR級)、聚乙二醇(PEG2000,AR級)均購于上海晶純試劑有限公司,氫氧化鈉(NaOH,AR級)、氯化氫(HCl,CP級),購自國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司;葉酸(FA,AR級),購自廣東光華化學(xué)廠有限公司;F-4500型紫外分光光度計(Hitachi日本)、F-4500型熒光分光光度計(Hitachi日本)、JEM-2010HR透射電鏡(JEOL日本)、D8-advanceX線粉末衍射儀(Brucker德國)、倒置熒光顯微鏡(Nikon日本)。1.2地殼和地殼之間的合成和精制1.2.1超聲處理法稱取碲粉0.025g,硼氫化鈉0.04g裝入乳膠塞密閉的小試管中,注入3mL去離子水,留一小排氣孔,超聲處理20min后靜置1h。反應(yīng)過程中溶液由紫色漸漸變?yōu)榉奂t色,再變?yōu)闊o色透明,氣泡也漸漸減少。1.2.2oh溶液調(diào)節(jié)溶液的ph值稱取CdCl20.35g,巰基二丁酸0.3g,溶于100mL蒸餾水中,用1mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值到10。把溶液加入100mL三頸瓶中,通氬氣30min后,把新鮮制備的NaHTe快速加入到氬氣保護(hù)下的CdCl2溶液中,溶液的顏色變成透明淡酒紅色,室溫攪拌20min后開始加熱,分別在加熱反應(yīng)5、15、20、30min取樣檢測熒光強度,全部反應(yīng)在氬氣保護(hù)下完成。1.2.3基二丁酸溶液將已純化干燥的CdTe量子點溶于80mL去離子水中,加入CdCl20.23g,巰基二丁酸0.1g后攪拌至溶液為透明橙色,1mol/LNaOH調(diào)整pH至8.5。通氬氣攪拌20min后開始以0.05mL/min的速度緩慢滴加20mg/mL的Na2S水溶液1mL,然后加熱30min(此過程持續(xù)通氬氣)。1.2.4離心沉淀干燥在制備好的量子點溶液中加入3倍體積的異丙醇后,4000r/min(r=16cm)離心10min,棄去上清液,加入30mL去離子水,再重復(fù)上述過程,得到的沉淀在室溫下真空干燥。1.3掃描電鏡觀察量點粒徑及分散情況利用紫外分光光度計檢測量子點的紫外吸收度;熒光分光光度計檢測量子點的熒光發(fā)射光譜(條件:Ex=365nm,Em=500~700nm,ScanSpeed:1200nm/min,ExSlit:5nm,EmSlit:5nm,PMTvotage:400V);透射電鏡觀察量子點粒徑及分散情況;利用X線粉末衍射儀確定量子點晶體結(jié)構(gòu)。1.4雙氨基聚乙二醇的制備參照胡海梅等的方法合成端氨基聚乙二醇[diaminopolyethyleneglycol,PEG2000(NH2)2],將已干燥好的PEG200020g溶于20mL無水二氯甲烷和50mL無水吡啶的混合溶劑中,然后在冰水浴條件下逐滴加入含11.4g對甲基苯璜酰氯的無水二氯甲烷溶液80mL中。體系在避光條件下室溫反應(yīng)24h。然后用等體積的3mol/L的HCl溶液萃取。有機相用10gNaHCO3洗滌后過濾,濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),得到對甲基苯磺酸酯修飾的PEG。將上述產(chǎn)物16g溶于200mL氨水中(25%~28%),在高壓反應(yīng)釜中于80℃條件下反應(yīng)24h。待體系冷卻至室溫,然后用等體積的CH2C12萃取。收集有機相,將其與100mLlmol/L的NaOH混合并攪拌2h,然后再用水將有機相洗滌至中性。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到雙氨基聚乙二醇。按Ohguchi等報道的方法制備FA-PEG2000-NH2,0.58gFA溶于30mL無水二甲基亞砜中,攪拌條件下加入二環(huán)己基碳二亞胺0.8g及N-羥琥珀酰亞胺0.23g,攪拌反應(yīng)4h,使FA的羧基活化。然后加入雙氨基聚乙二醇(PEG2000(NH2)2)2.4g,攪拌反應(yīng)8h,使FA活化的羧基與PEG2000端氨基相連接。反應(yīng)結(jié)束后加入雙蒸水120mL,過濾除去不溶物后,產(chǎn)物冷凍干燥。1.5qd-peg-fa的合成和檢測1.5.1nhs-peg200-fa的制備取純化后0.01g/mL的CdTe/CdS量子點1mL,5mg/mL的EDC水溶液30μL,5mg/mL的NHS水溶液60μL,輕度振蕩10min,再加入100μL的PEG2000-FA(5mg/mL),稍振蕩后4℃靜置反應(yīng)6h。用分子質(zhì)量為10ku的過濾管離心10min(4000r/min,r=16cm),取內(nèi)套管液體。1.5.2瓊脂糖凝膠電泳以丙三醇作為沉淀劑(樣品:丙三醇=3∶1),各取15μL樣品(見實驗結(jié)果),分別加入瓊脂糖凝膠中電泳,電泳條件:PB緩沖液,65V,100mA,90min。1.6熒光量子產(chǎn)率的計算室溫下的熒光量子產(chǎn)率以羅丹明6G(熒光量子產(chǎn)率為95%)作參比來測定。即通過測量CdTe量子點和羅丹明6G的稀水溶液在同一激發(fā)波長下的積分熒光強度和對該波長光的吸光度,并按下式計算熒光量子產(chǎn)率:式中,Yu和Ys分別表示待測物和參比物的熒光量子產(chǎn)率,Fu和Fs分別表示待測物和參比物的積分熒光強度,Au和As分別表示待測物和參比物對該激發(fā)波長的入射光的吸光度。測定時,激發(fā)波長為365nm,激發(fā)和發(fā)射狹縫均為3.0nm。1.7葉片懸液的制備將生長狀態(tài)良好的鼻咽癌細(xì)胞HNE-1(FA受體表達(dá)陽性)、CNE-2(FA受體表達(dá)陰性)和人喉癌細(xì)胞Hep-2(FA受體表達(dá)陽性),消化離心后用RPMI-1640全培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度至2×107L-1,接種于24孔板內(nèi),每孔體積500μL。貼壁生長24h后吸棄所有孔內(nèi)的培養(yǎng)基,以PBS液洗滌一次后分別加入以500μL的RPMI-1640稀釋的QD、QD-PEG、QD-PEG-FA(表1)共培養(yǎng)6h。吸棄全部培養(yǎng)液體,PBS液充分洗滌去除未被攝取的各種試劑。甲醇溶液-20℃固定20min,雙蒸水充分洗滌后置熒光倒置顯微鏡下觀察。2結(jié)果2.1cdte/cds的熒光量子產(chǎn)率成功制備出穩(wěn)定的熒光量子產(chǎn)率高達(dá)72.5%的CdTe量子點。水相合成中隨著反應(yīng)時間的延長,所得到的CdTe量子點的粒徑不斷增大,吸收光譜和光致發(fā)光譜不斷紅移。在365nm的紫外光的激發(fā)下,發(fā)射光由綠色逐漸變?yōu)辄S色、橙色、紅色(圖1);而量子點的激發(fā)波長范圍很寬,激子吸收峰非常明顯,當(dāng)加熱反應(yīng)回流時間為5、15、20、30min時,量子點的吸收峰依次為508、540、554、567nm(圖2A);量子點的發(fā)射光譜窄,光致發(fā)光峰對稱、穩(wěn)定,最大熒光發(fā)射波長分別為540、565.2、579和615.2nm(圖2B),經(jīng)計算后對應(yīng)的熒光量子產(chǎn)率分別為72.5%、69.94%、62.0%、29.85%。根據(jù)文獻(xiàn)計算得四種量子點樣品的粒徑分別為2.55、3.12、3.28、3.40nm。加熱回流10min合成的CdTe量子點的X射線粉末衍射圖在2θ值為24.449、40.695、48.799處出現(xiàn)了三個峰(圖3),與立方晶型CdTe的(111),(220),(311)三個晶面形成良好的對應(yīng),由于量子點的粒徑較小,導(dǎo)致峰變寬。在透射電子顯微鏡下可以觀察到CdTe納米微粒呈近似球形,粒徑分布較均勻,平均為3nm左右(圖4)。CdTe/CdS量子點是在已純化干燥的CdTe量子點的基礎(chǔ)上合成的,圖5中顯示了在反應(yīng)10min時合成的CdTe基礎(chǔ)上繼續(xù)合成的CdTe/CdS量子點(反應(yīng)5、10、20、30min)的光致發(fā)光光譜,隨著反應(yīng)時間的延長光致發(fā)光光譜不斷紅移,說明量子點粒徑不斷增大,也說明了CdS殼核結(jié)構(gòu)的形成。我們合成的量子點(CdTe、CdTe/CdS),液體狀態(tài)下密封保存在4℃條件下,半年內(nèi)未出現(xiàn)沉淀、熒光強度減弱等變化,狀態(tài)非常穩(wěn)定。2.2peg和peg-fa在偶聯(lián)反應(yīng)中的問題制備好的QD-PEG-FA超濾離心純化后,采用光致發(fā)光光譜測定(圖6)和瓊脂糖凝膠電泳(圖7)證實,QD-PEG-FA量子點熒光探針偶聯(lián)效果良好。從圖6中可看出CdTe量子點偶聯(lián)生物大分子后,光致發(fā)光光譜紅移,熒光強度下降。圖7顯示葉酸(條帶4)本身無明顯的紫外激發(fā)光,而PEG和PEG-FA有自身發(fā)光(藍(lán)色,條帶2、3);氨基PEG帶正電,電泳過程中向負(fù)極泳動。從條帶2、3、4中我們可以看出,連接FA后,由于FA表面的羧基帶負(fù)電,PEG的極性被改變,PEG-FA向正極泳動,表明PEG與FA連接滿意。由于有部分未連接的PEG沒能從偶聯(lián)反應(yīng)體系中去除(實驗條件所致),故條帶2有微量向負(fù)極泳動而出現(xiàn)藍(lán)光;條帶1、7分別和3、8比較后顯示:QD-PEG偶聯(lián)是成功的,但有少量未反應(yīng)完全的PEG未能從反應(yīng)體系中去除而出現(xiàn)向負(fù)極泳動的藍(lán)光;條帶5呈現(xiàn)桔黃拖尾熒光,分別與條帶6、7、8和2比較表明QD-PEG-FA連接穩(wěn)定,反應(yīng)產(chǎn)物中PEG-FA殘留較少。純化后的葉酸受體靶向的CdTe/CdS量子點熒光探針在4℃水溶液及細(xì)胞培養(yǎng)液(RPMI-1640)中儲存3個月內(nèi)未見沉淀及熒光減弱。2.3細(xì)胞熒光標(biāo)記檢測鼻咽癌細(xì)胞HNE-1、CNE-2和人喉癌細(xì)胞Hep-2與含有QD、QD-PEG、QD-PEG-FA培養(yǎng)液共培養(yǎng)6h后,熒光顯微鏡下觀察可見:(1)葉酸受體陽性鼻咽癌細(xì)胞HNE-1(圖8A、B)和喉癌細(xì)胞Hep-2(圖8C、D)近100%的細(xì)胞膜表面均可見較強的熒光標(biāo)記,不同種類的細(xì)胞熒光強度稍有差別。而葉酸受體表達(dá)陰性的鼻咽癌細(xì)胞CNE-2(圖8E、F)則未見明顯熒光標(biāo)記。(2)鼻咽癌細(xì)胞HNE-1、喉癌細(xì)胞Hep-2、人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2和QD、QD-PEG共培養(yǎng)6h后,細(xì)胞表面未見明顯的熒光標(biāo)記。我們的葉酸受體靶向的量子點熒光探針標(biāo)記細(xì)胞后放置1周,仍可見熒光。3qd-peg-fa的偶聯(lián)和熒光探針的穩(wěn)定性癌癥是嚴(yán)重威脅人類生命的疾病之一,早期發(fā)現(xiàn)與治療是目前降低癌癥死亡率最有效的方法,因此,研究癌癥的早期診斷具有重要的臨床意義。葉酸受體在絕大多數(shù)正常組織中極少表達(dá),而在許多腫瘤包括頭頸部腫瘤組織中高表達(dá)。受體和其配體的結(jié)合具有較強的特異性、選擇性。作為熒光標(biāo)記物,量子點有其獨特的優(yōu)勢,較普通熒光染料的熒光強度高,耐光漂泊,而量子點熒光探針具有良好的熒光性和較強的穩(wěn)定性,可較長時間保存,He等以牛血清白蛋白(BSA)作為中介制備了FA-BSA-QD,Valérie等采用高分子聚合物(polymerspacer)作為偶聯(lián)劑制備了偶聯(lián)FA的量子點,但量子產(chǎn)率均不高。我們采用水相化學(xué)合成法、合成了產(chǎn)率高達(dá)72.5%的量子點,以PEG作為修飾材料,成功制備了葉酸和量子點偶聯(lián)的熒光探針,在4℃水溶液及細(xì)胞培養(yǎng)液(RPMI-1640)中保存了3個月,未見沉淀及熒光減弱。標(biāo)