抗菌制品抑菌效果檢測及方法學(xué)研究

抗菌制品抑菌效果檢測及方法學(xué)研究

隨著社會(huì)的發(fā)展和生活水平的提高，各種能夠抗菌功能的材料（如抗菌塑料、抗菌橡膠、抗菌纖維等）在近年來得到了開發(fā)和上市。由于該類抗菌產(chǎn)品的種類繁多,其外形、構(gòu)造差別很大,加之其添加的有效抗菌成分品種、比例以及在制品中的分布的差異等諸多因素,使得該類制品的抗菌功能的檢測變得十分復(fù)雜。本文通過大量的實(shí)驗(yàn)研究并參照《消毒技術(shù)規(guī)范》提出了適用于非溶出性抗菌產(chǎn)品的抑菌效果檢測方法。1材料和方法1.1酶3-菌株5.2金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、大腸桿菌(25922);生理鹽水;振蕩搖床(200~300r/min);50ml三角燒瓶和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基等。1.2溫度和濃度為0.0.5%的溫度,有6.(1)檢樣制備:①樣品為固體狀態(tài),密度較小且抗菌成分均勻一致分布于待檢樣品中時(shí),將抗菌物品剪切成10mm×10mm樣片,稱取2g分裝待用。②樣品為固體狀態(tài),密度較大或抗菌成分僅分布于樣品表面時(shí)。將抗菌物品剪切成10mm×10mm樣片,按表面積量取100cm2分裝待用。③若待檢樣品為非固體形態(tài),可直接稱取2g或2m1分裝備用。(2)將上述樣片放入一50ml的三角燒瓶中,分別加入19.8ml(固體樣品)或17.8ml(液體樣品)生理鹽水和0.2ml菌懸液,使菌液的工作濃度為1×104~2×104cfu/ml。(3)將三角燒瓶固定于振蕩搖床上,以200r/min振搖2h。(4)分別取0.5ml振搖0h和振搖2h后的樣液,或用鹽水做適當(dāng)稀釋后(1∶10,1∶100,1∶1000或1∶10000等)的樣液,以瓊脂傾注法接種平皿,進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。試驗(yàn)重復(fù)3次。(5)試驗(yàn)同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和空白對(duì)照組。除陰性對(duì)照組加入不含抗菌成分的材質(zhì)、大小相同的樣片代替抗菌樣片,空白對(duì)照組不加任何樣片外,其余操作程序均與試驗(yàn)組相同。(6)活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)法:吸取不同稀釋度的樣液各0.5ml加于無菌平皿內(nèi),一般需做2~3個(gè)稀釋度,每一個(gè)稀釋度做3個(gè)平皿。將冷至40~45℃的熔化營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,傾注于已加入樣液的平皿中,每平皿15~20ml,隨即轉(zhuǎn)動(dòng)平皿,使樣品與培養(yǎng)基充分混合均勻,待瓊脂凝固后,翻轉(zhuǎn)平皿,置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h。計(jì)數(shù)菌落時(shí),以菌落數(shù)在30~300的平板為準(zhǔn),每個(gè)稀釋度3個(gè)平板生長菌落數(shù)全合乎上述標(biāo)準(zhǔn),則以該3個(gè)平板的菌落平均值作為結(jié)果;若有2個(gè)符合上述標(biāo)準(zhǔn),則以該合格的兩個(gè)平板菌落的平均值為結(jié)果;若只有1個(gè)平板合格者,結(jié)果作廢。當(dāng)兩個(gè)稀釋度組均各有2個(gè)以上平板的菌落數(shù)在30~300個(gè)之間,應(yīng)將該兩稀釋度計(jì)算出的菌落數(shù)的平均值作為結(jié)果。如果所有稀釋度均沒有2個(gè)以上平板生長的菌落數(shù)在30~300之間時(shí),則該次試驗(yàn)作廢。最后,將求得的平均菌落值,乘以2,再乘以稀釋倍數(shù),即得每毫升樣液中的菌量。(7)按下式計(jì)算抑菌率。抑菌率=樣本振蕩前平均菌落數(shù)?樣本振蕩后平均菌落數(shù)樣本振蕩前平均菌落數(shù)×100%=樣本振蕩前平均菌落數(shù)-樣本振蕩后平均菌落數(shù)樣本振蕩前平均菌落數(shù)×100%1.3菌落數(shù)差值測定(1)不加樣片組活菌計(jì)數(shù)在1×104~2×104cfu/ml。且樣本振蕩前后平均菌落數(shù)差值在10%以內(nèi),試驗(yàn)有效。(2)試驗(yàn)樣片的抑菌率與對(duì)照樣片的抑菌率的差值>26%,即可認(rèn)定該樣片具有抑菌作用。2結(jié)果與討論2.1抗菌制品的制備對(duì)不同種類抗菌制品共12種進(jìn)行了抑菌效果檢測,結(jié)果表明(表1),雖然抗菌制品的種類不同,且其形態(tài)各不相同,但其對(duì)目標(biāo)菌均有較強(qiáng)的抑制作用,當(dāng)作用時(shí)間為2h時(shí),其抑菌率均可達(dá)到80%以上。表1中可見同樣數(shù)量的樣品含量,由于樣品狀態(tài)的不同,其抑菌率卻有所不同,以液體,半固體狀態(tài)樣品的抑菌率較高,固體次之,其可能原因除不同制品的有效成分含量可能有所不同外,另一個(gè)主要原因可能和制品中的有效成分與制品基質(zhì)之間的構(gòu)造有關(guān)。大多數(shù)無機(jī)抗菌劑是通過將抗菌成分和無機(jī)物載體結(jié)合而制得。所采用的抗菌成分主要有銀、銅、鋅及其化合物。在各種抗菌成分中,以銀及其化合物用得最多,一般認(rèn)為其抗菌機(jī)理分為兩種,一種為Ag+直接破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜或細(xì)胞原生質(zhì)活性酶的活性,表現(xiàn)抗菌作用;另一種為在光照條件下,抗菌劑和水或空氣作用,生成具有很強(qiáng)的氧化還原能力的活性氧O2,后者破壞細(xì)菌含琉基酶系統(tǒng),發(fā)揮抗菌作用?？咕破沸螒B(tài)不同,將會(huì)影響到活性成分Ag+的釋放或活性氧的產(chǎn)生,進(jìn)而影響到抗菌能力。另外,考慮到檢樣的物態(tài)、密度以及抗菌有效成分在樣品中的分布等還會(huì)影響到抗菌成分與目標(biāo)菌的接觸機(jī)會(huì),從而影響抑菌效果,故檢樣制備應(yīng)區(qū)別對(duì)待。2.2h作用280%的抑菌率考慮到抗菌制品與目標(biāo)菌的作用時(shí)間不同可能會(huì)影響到抑菌效果,將上述制品中的部分樣品進(jìn)行了不同反應(yīng)時(shí)間的抑菌效果觀察,可見丙綸纖維等4種抗菌制品在接觸大腸桿菌和金黃色葡萄球菌1小時(shí)后其抑菌率均在60%~80%之間,作用2小時(shí)后則抑菌率可上升到90%~99%,此后抑菌率則不再隨著作用時(shí)間的延長而明顯增加。結(jié)果表明,當(dāng)作用時(shí)間為1h(消毒制品抑菌效果檢測方法)時(shí),抑菌率僅能達(dá)到60%~80%,如延長作用時(shí)間到24h,則雖能有限度地提高抑菌率,但卻大大增加了實(shí)驗(yàn)時(shí)間,同時(shí)也為實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量控制增加了難度。而選擇2小時(shí)作為抗菌制品抑菌效果檢測之反應(yīng)時(shí)間(既作用時(shí)間),相比既能達(dá)到客觀評(píng)價(jià)抗菌制品的抗菌功能的目的,又能節(jié)省大量時(shí)間。Sakaguchi等亦認(rèn)為含銀或銅的抗菌制品在與目標(biāo)菌接觸20min~3h,菌落形成單位(CFU)顯著減少。2.3抑菌率與表面積的關(guān)系可見,隨著樣品表面積的增加,電話機(jī)殼等4種抗菌制品的抑菌率亦相應(yīng)增加,當(dāng)樣品表面積為20cm2時(shí),抑菌率在30%~40%之間,表面積為50cm2時(shí),抑菌率增加到60%~70%,而當(dāng)表面積增加到100cm2時(shí),金黃色葡萄球菌抑菌率達(dá)到了90%以上,大腸桿菌抑菌率在80%以上。當(dāng)非溶出性抗菌制品密度較大