多胺氧化酶（PolyamineoxidasePAO）試劑盒說明書

第第頁多胺氧化酶（Polyamineoxidase，PAO）試劑盒說明書多胺氧化酶（Polyamineoxidase，PAO）試劑盒說明書微量法100管/96樣注意：正式測定前務必取23個預期差別較大的樣本做猜測定測定意義：多胺氧化酶是催化生物體內多胺氧化的關鍵酶，通過調整體內多胺水平和生成物的濃度，參加各蒔植物體對逆境脅迫的反應和生長發(fā)育過程。測定原理：PAO催化多胺氧化產生過氧化氫，在過氧化物酶存在的條件下與底物顯色，在550nm下有特征汲取峰，通過測定吸光值加添速率來反映PAO活性。需自備的儀器和用品：酶標儀、臺式離心機、可調式移液器、96孔板、研缽、冰和蒸餾水。試劑構成和配制：試劑一：液體120mL×1瓶，4℃保管；試劑二：液體3mL×1瓶，4℃保管；試劑三：液體1.5mL×1瓶，4℃保管；試劑四：液體1.5mL×1瓶，4℃保管。粗酶液提?。?.組織：依照組織質量（g）：試劑一體積（mL）為1：5～10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿，然后10000g，4℃離心20min，取上清，置冰上待測。2.細菌、真菌：依照細胞數(shù)量（104個）：試劑一體積（mL）為500～1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波碎裂細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后10000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。3.血清等液體：直接測定。測定步驟：1、酶標儀預熱30min以上，調整波長至550nm。2、樣本測定試劑名稱（L）測定管試劑一140試劑二20試劑三10樣本20試劑四10快速混勻，于550nm下測定初始吸光值A1與30min后吸光值A2.ΔA=A2A1.PAO活性計算：（1）按樣本蛋白濃度計算：單位定義：每mg組織蛋白在每mL反應體系中每分鐘A550變動0.001為一個酶活力單位。PAO（U/mgprot）＝ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.001÷T=333.33×ΔA÷Cpr（2）按樣本鮮重計算：單位定義：每g組織在每mL反應體系中每分鐘A550變動0.001為一個酶活力單位。PAO（U/g鮮重）＝ΔA×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷0.001÷T=333.33×ΔA÷W（3）按細菌或細胞密度計算：單位定義：每1萬個細菌或細胞在每mL反應體系中每分鐘A550變動0.001為一個酶活力單位。PAO（U/104cell）＝ΔA×V反總÷（500×V樣÷V樣總）÷0.001÷T=0.667×ΔA（4）按液體體積計算單位的定義：每mL液體樣本在每mL反應體系中每分鐘A550變動0.001為一個酶活力單位。PAO（U/mL）=ΔA×V反總÷V樣÷0.001÷T=333.33×ΔAV反總：反應體系總體積，0.2mL；V樣：加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，