杯幀法影響抗生素效價測定的因素分析

杯幀法影響抗生素效價測定的因素分析

甲二醇法是目前測定抗生素有效性的國際一般方法。其原理是利用抗生素在特定試驗敏感菌的瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)進行球形立體擴散,形成透明的抑菌圈,比較標準品(S)與供試品(T)抑菌圈的大小,以決定供試品的效價。杯碟法操作較繁瑣,易造成實驗誤差。筆者總結(jié)出以下影響因素,供同行參考。1必須按儀器用量冷卻抗生素的效價測定屬于半無菌操作,要求所用的儀器及用具必須滅菌,并應(yīng)避免沾染抗生素;操作前,實驗室應(yīng)用紫外線照射30min滅菌。2實驗組數(shù)不合理雙碟數(shù)越多,自由度越大,實驗誤差也相應(yīng)減小,實驗結(jié)果接近真值的可能性越大。但實驗組數(shù)不能無限增多,否則將會增加其它實驗誤差。反之,雙碟數(shù)越少,自由度越小,實驗誤差也相應(yīng)增大,實驗結(jié)果接近真值的可能性越小。因此,實驗組數(shù)必須有最低限度。杯碟法的檢定法中二劑量法的雙碟數(shù)不得少于4只,三劑量法的雙碟數(shù)不得少于6只。3標準誤差和可信限率標志實驗精密度值越大,實驗誤差越大。值的大小直接影響標準誤差(SM)和可信限率(FL%)?？赏ㄟ^重復實驗,增加雙碟數(shù)或調(diào)整供試品(T)的估計效價(AT),或調(diào)整劑量,或進一步控制生物變異減小誤差。4藥品的稀釋和標準溶液抗生素的效價測定是利用量反應(yīng)平行線測定原理。因此S和T必須為同一個抗生素,實驗條件必須一致。如溶解和稀釋的時間,稀釋用緩沖液(如pH、質(zhì)量、濃度)。S溶液從冰箱取出后,須放至室溫后,方可稀釋,以保證S和T兩條直線的互相平行,減小實驗誤差。5溶解和稀釋要求抗生素杯碟法測定效價屬于微量分析,因此,S和T的稱量和稀釋要求極為精密,溶解和稀釋用的溶媒須嚴格按S說明書和《中國藥典》2005年版(以下簡稱藥典)規(guī)定的溶媒進行。不得隨意改變?nèi)苊?避免主觀誤差。6藥物的抑菌濃度抗生素的最低抑菌濃度(C1)大,抑菌圈大;C1小,抑菌圈小。藥典對每種抗生素的抑菌濃度范圍,都作了具體規(guī)定。為此,在檢驗工作中,要嚴格按藥典規(guī)定進行S和T的稀釋,否則,將造成實驗失敗。7抑菌圈測定對于同一抑菌濃度的抗生素來說,M大,抑菌圈大;M小,抑菌圈小。為此,每個牛津杯中抗生素的效價單位數(shù)應(yīng)盡量一致,以克服碟間差異,減少誤差。8培養(yǎng)基的制備度都有影響,特別是蛋白胨、肉膏與瓊脂等。調(diào)pH值以一次為好,不要反復用酸或堿回調(diào),以免增加不必要的離子對抑菌圈的影響。制備好的培養(yǎng)基應(yīng)透明,不應(yīng)有沉淀,必要時應(yīng)用脫脂棉濾過除去,使用應(yīng)有一定的期限。對不同的抗生素檢驗,藥典對pH值緩沖液都有明確的規(guī)定,不可隨意改變緩沖液。9抑菌圈的大小及均勻度除選用抗生素效價測定用的標準平皿外,雙碟底層培養(yǎng)基、菌層培養(yǎng)基的厚度及均勻度都直接影響抑菌圈的大小和圓整。為了保證菌層培養(yǎng)基的均勻攤布,可將底層培養(yǎng)基保溫在37℃,在鋪菌層使之均勻凝固后,以等距離安放牛津杯,防止抑菌圈較大時,圈與圈之間彼此影響,造成抑菌圈不圓或相連。10預制菌液的有效價格測定菌種選用,一定要用純種。使用污染雜菌和過于老化的菌株,可能出現(xiàn)抑菌圈不清晰或雙圈現(xiàn)象。11試驗菌的消毒菌層培養(yǎng)基的溫度對不同的試驗菌有不同的規(guī)定,過熱易使試驗菌燙死,造成無圈現(xiàn)象;過冷不易使菌液和培養(yǎng)基混勻,不易在底層培養(yǎng)基上均勻攤布,產(chǎn)生不圓的抑菌圈,誤差增大。12各度和標準對全體性能的影響是否有其影響培養(yǎng)條件(溫度和時間),對抑菌圈的大小和清晰度都有影響。溫度過高或過低都會造成抑菌圈模糊不清,甚至出現(xiàn)無圈現(xiàn)象;時間過短,抗生素在瓊脂培養(yǎng)基的擴散不完全,影響抑菌圈的真實大小及邊緣的清晰度。13抑菌圈的測定測量抑菌圈時應(yīng)避免主觀誤差,注意檢查抑菌圈是否圓整,眼睛視線與所讀數(shù)刻度垂直,讀數(shù)要準確。每測量一個抑菌圈后,必須將卡尺上的游標移動一下,再測量第二個抑菌圈,