降纖酶注射劑的色譜分析

降纖酶注射劑的色譜分析

降纖酶是提取的一種重要的抗凝酶，具有去粘液、抗凝酶、解聚酶和溶菌酶的顯著抗凝效果。近年來，它已被廣泛應(yīng)用于預(yù)防和治療心腦血管疾病。國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)第16冊(cè)中收載了降纖酶和注射用降纖酶,但注射用降纖酶現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)不夠完善,如鑒別采用血漿凝固法和底物水解顯色法,缺乏降纖酶專屬性;標(biāo)準(zhǔn)中沒有設(shè)立純度和有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng),無法考察制劑制備及存貯過程中可能出現(xiàn)的降解產(chǎn)物情況,無法規(guī)定純度標(biāo)準(zhǔn)限度;制劑標(biāo)準(zhǔn)中僅有活性單位測(cè)定,沒有設(shè)立主藥含量測(cè)定等等?？紤]到此類藥物的安全、有效、質(zhì)量可控,有必要提高降纖酶注射劑的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。本文針對(duì)注射用降纖酶國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的關(guān)鍵缺陷項(xiàng)目,探索將高效液相色譜法應(yīng)用于本品種制劑純度和含量測(cè)定的可行性,采用研究建立的反相高效液相色譜法(RP-HPLC)和高效分子排阻色譜法(HPSEC),對(duì)來自不同生產(chǎn)廠家的多批凍干制劑進(jìn)行了分析,并初步進(jìn)行了酶活力與降纖酶液相色譜主峰面積的相關(guān)性評(píng)估。1紫外分光光度法日本島津公司LC-10AD泵,Vydac214TP54C4色譜柱(5μm,250mm×4.6mm),PhenomenexJupiterC18色譜柱(5μm,300?,250mm×4.6mm),TSK-GELG2000SWXL色譜柱(7.8mm×300mm),SIL-10AD全自動(dòng)進(jìn)樣器,SPD-10A型紫外可見分光光度檢測(cè)器(190～800nm),CLASS-VP型色譜工作站。76-1玻璃恒溫水浴(上海昌吉地質(zhì)儀器有限公司),秒表、微量可調(diào)加液器等。乙腈、三氟乙酸為色譜純,三羥基氨基甲烷、氯化鈉、磷酸氫二鈉及磷酸二氫鈉均為分析純,水為超純水。降纖酶標(biāo)準(zhǔn)品(140620-200301,每支含64U,供降纖酶效價(jià)測(cè)定用)、牛纖維蛋白原(140607-200736,每支含98mg可凝蛋白)均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供;注射用降纖酶由國(guó)內(nèi)12個(gè)生產(chǎn)企業(yè)提供,批號(hào)為:20060101(A廠,10U),20070129(B廠,10U),20051202(C廠,5U),200703157(D廠,5U),070116(E廠,5U),10653203(F廠,10U),06022002(G廠,5U),20051101(H廠,5U),050102(I廠,5U),20060101(J廠,5U),0707041(K廠,5U),070201(L廠,5U);降纖酶原料及右旋糖酐40由企業(yè)提供。2方法和結(jié)果2.1酶活性測(cè)定參照國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)第16冊(cè),采用纖維蛋白原凝固法。2.2r-hplc2.2.1流動(dòng)相a3.2色譜柱:Vydac214TP54C4(5μm,250mm×4.6mm);流動(dòng)相:A為0.1%三氟乙酸,B為乙腈-水(90∶10),含0.1%三氟乙酸;流速0.8mL·min-1;柱溫45℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm;進(jìn)樣量為300μL。2.2.2試驗(yàn)溶液的制備取樣品適量,加水配制成5U·mL-1,即得。2.3HPSEC2.3.1色譜柱及色譜線參照國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)中降纖酶的純度檢查方法。采用TSK-GELG2000SWXL(7.8mm×300mm)色譜柱,流動(dòng)相為0.2mol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH6.8)(取磷酸氫二鈉70.16g,磷酸二氫鈉35.98g,溶解于360mL水中,以1mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.8,加水至2000mL),流速1.0mL·min-1,柱溫25℃,檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm,進(jìn)樣量為300μL。2.3.2試驗(yàn)溶液的制備取樣品適量,加流動(dòng)相配制成25U·mL-1,即得。2.4rt-hplc-hpsec圖譜分別對(duì)12個(gè)生產(chǎn)企業(yè)的注射用降纖酶進(jìn)行酶活力測(cè)定,RP-HPLC和HPSEC檢測(cè)分析,酶活力測(cè)定結(jié)果用每支中的酶活力單位數(shù)(U·支-1)表示,RP-HPLC圖譜中記錄主峰保留時(shí)間(RT)、主峰面積及面積百分比,HPSEC圖譜中記錄主峰保留時(shí)間并對(duì)圖譜進(jìn)行描述,結(jié)果見表1。表1中RP-HPLC和HPSEC圖譜數(shù)據(jù)顯示,E廠樣品的RP-HPLC圖譜主峰面積和面積百分比均最大,HPSEC圖譜中雜質(zhì)峰較少,而L廠樣品的RP-HPLC圖譜中無主峰,因此,在此選取E、L和主峰面積介于兩者之間的G廠樣品圖譜(圖1和圖2)為代表進(jìn)行討論。3討論3.1r-hplc分析3.1.1降纖酶及雜質(zhì)峰基線分離和測(cè)定目前尚未見到利用RP-HPLC方法檢測(cè)降纖酶及其制劑的研究報(bào)道,比較不同色譜柱(C18和C4柱)、不同柱溫(室溫和45℃)、不同流速(1.0mL·min-1和0.8mL·min-1)以及不同梯度的分離效果,從研究獲得的結(jié)果來看,本文中建立的RP-HPLC方法可將降纖酶及其雜質(zhì)峰基線分離。此外,用降纖酶原料對(duì)制劑中的主峰進(jìn)行定位(圖1),并根據(jù)生產(chǎn)企業(yè)提供的處方,對(duì)已有的空白輔料右旋糖酐40按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明,在選定的色譜條件下,降纖酶主峰保留時(shí)間為16.1min,且輔料無干擾(圖3)。在對(duì)該方法的專屬性研究中,對(duì)原料進(jìn)行了氧化破壞試驗(yàn),結(jié)果有較明顯的降解物質(zhì)產(chǎn)生,并能與主峰有效分離(R=1.31)(圖3)。3.1.2粒徑差異由12批注射用粉針樣品的RP-HPLC圖譜數(shù)據(jù)可以看出,A～F廠樣品的主峰面積在4萬～9萬之間,G～L廠在3.5萬以下。由于每批樣品的雜質(zhì)峰數(shù)目及面積各不相同,說明不同生產(chǎn)企業(yè)產(chǎn)品的純度差異較大;此外,主峰面積大的樣品其主峰面積歸一化純度不一定高,除E廠外,其余廠家的樣品主峰面積均未超過30%,分析此類雜峰可能為輔料或主成分降解產(chǎn)物,但因處方中聲明輔料在280nm波長(zhǎng)處無吸收,故雜峰疑似為降解產(chǎn)物。將此法用于注射用降纖酶的純度檢查等項(xiàng)目的質(zhì)量控制具有可行性。3.2hpsec圖譜檢測(cè)參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中降纖酶原料的純度測(cè)定方法對(duì)12批注射用粉針樣品進(jìn)行分析,由HPSEC圖譜信息可以看出,12批制劑的主峰保留時(shí)間均在5.1～5.6min之間,主峰之前無其他峰,說明樣品中不存在相對(duì)分子質(zhì)量大于主成分的物質(zhì),即在此條件下未檢出聚合物,由HPSEC圖譜還可看出,每批樣品在主峰之后存在峰形各異數(shù)目不同的峰,提示樣品中存在相對(duì)分子質(zhì)量小于主成分的物質(zhì),即樣品存在不同程度的降解。此外,制劑原國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中未收載HPSEC法控制純度,而原料中規(guī)定純度不低于90.0%,根據(jù)色譜圖的分離效果,可以考慮用HPSEC法控制制劑中聚合物和降解產(chǎn)物的限度。3.3酶活力與hpsec圖譜的關(guān)系由12批注射用粉針樣品的酶活力數(shù)據(jù)可以看出,6批的酶活力(U·支-1)在5.0以上,2批在4.8～5.0之間,另外4批低于2.5。實(shí)驗(yàn)過程中,L廠的樣品在30min內(nèi)沒有使纖維蛋白原凝固,故認(rèn)為其酶活力為0。樣品的酶活力與RP-HPLC圖譜中的主峰面積呈一定的相關(guān)性:當(dāng)樣品(L廠)酶活力為0即無酶活力時(shí),其在反相圖譜中相應(yīng)的保留時(shí)間處也無主峰;當(dāng)樣品(G,H,I,J,K廠)酶活力較低(<5.0)時(shí),其在反相圖譜中的主峰面積也較小(<3.5萬)。樣品的酶活力與HPSEC色譜圖中的主峰呈一定趨勢(shì)分布,酶活力越大,色譜圖中主峰越明顯。由于沒有合適的成品含量測(cè)定方法,目前國(guó)內(nèi)各生產(chǎn)企業(yè)的注射用降纖酶在制劑過程中均采用活性分裝,由于降纖酶原料的比活標(biāo)準(zhǔn)僅規(guī)定下限,不同批次原料比活相差較大時(shí)得到的制劑降纖酶含量可能出現(xiàn)較大的不均一性,難以達(dá)到質(zhì)量可控的要求,使得生產(chǎn)中缺少了一個(gè)控制工藝穩(wěn)定性的關(guān)鍵指標(biāo)。因此,如果通過本研究的后續(xù)工作,建立一個(gè)基本符合要求的RP-HPLC含量測(cè)定方法,