chamerin在慢性膽囊炎中的表達(dá)及其意義

chamerin在慢性膽囊炎中的表達(dá)及其意義

代謝綜合征是由胰島素抵抗引起的一系列臨床、生化和代謝異常，導(dǎo)致各種物質(zhì)的代謝異常，尤其是中部肥胖、高血壓、高血糖和異常血脂。Chemerin是Bozaoglu等采用新的信號(hào)序列捕獲技術(shù)確定的新脂肪細(xì)胞因子,該基因主要表達(dá)于成熟的脂肪細(xì)胞,并作為細(xì)胞因子調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的分化。研究發(fā)現(xiàn)chemerin是肥胖時(shí)脂肪組織表達(dá)增高的脂肪細(xì)胞因子,與肥胖者三酰甘油和血清游離脂肪酸水平增高有關(guān),但其影響糖、脂代謝以及如何參與肥胖誘導(dǎo)的IR的確切機(jī)制目前尚不清楚。本研究旨在通過(guò)檢測(cè)維吾爾族MS患者chemerin在腹部大網(wǎng)膜、皮下脂肪組織mRNA的表達(dá)水平和血漿中的變化,及其與體質(zhì)量指數(shù)(bodymassindex,BMI)、腰圍、臀圍、腰臀圍比、血糖、血脂等之間的關(guān)系,進(jìn)而探討chemerin在MS中的可能作用及其與MS各組分之間的關(guān)系。1對(duì)象和方法1.1chemin的診斷120例研究對(duì)象均來(lái)自2007-06-2009-03新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院慢性膽囊炎和非膽囊炎擇期手術(shù)的維吾爾族患者。其中慢性膽囊炎患者81例,非膽囊炎患者39例,非膽囊炎患者主要為膽囊息肉、食道裂孔疝、腹壁切口疝等患者。在排除了慢性膽囊炎對(duì)臨床生化指標(biāo)和MS可能的影響后,根據(jù)脂肪組織標(biāo)本的留取和MS的診斷標(biāo)準(zhǔn),選擇81例慢性膽囊炎(MS39例,非MS42例)手術(shù)患者作為chemerin研究的對(duì)象。MS診斷根據(jù)2005年國(guó)際糖尿病聯(lián)盟所通過(guò)的MS的全球共識(shí)定義:一個(gè)MS個(gè)體必須具備中心性肥胖(中國(guó)人腰圍切點(diǎn):男性≥90cm,女性≥80cm),以及下列4個(gè)因素中的任意兩項(xiàng):①三酰甘油水平升高(三酰甘油>1.7mmol/L),或已接受針對(duì)此脂質(zhì)異常的特殊治療;②高密度脂蛋白膽固醇(highdensitylipoprotein-cholesterol,HDL-C)水平降低[HDL-C<1.03(男),<1.29mmol/L(女)],或已接受針對(duì)此脂質(zhì)異常的特殊治療;③血壓升高(收縮壓≥130mmHg或舒張壓≥85mmHg),或此前已被診斷為高血壓而接受治療;④空腹血糖升高(空腹血糖≥5.6mmol/L)或已被診斷為2型糖尿病(type2diabetesmellitus,T2DM)。所有研究對(duì)象年齡>30歲,無(wú)血緣關(guān)系及異族通婚史。同時(shí)排除:①動(dòng)脈血管或外周血管疾病;②甲狀腺功能不全,肝腎功能不全;③急性炎性和創(chuàng)傷等應(yīng)急情況;④惡性腫瘤以及飲酒或毒品史的個(gè)體。所有研究均獲得該醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),并獲得研究對(duì)象的知情同意。1.2方法1.2.1血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)研究對(duì)象脫鞋、免冠,僅穿內(nèi)衣褲測(cè)量身高、體質(zhì)量、腰圍(平肋弓下緣與髂前上棘連線中點(diǎn))、臀圍(恥骨聯(lián)合水平測(cè)量臀部最大周徑),并計(jì)算BMI與腰臀圍比。術(shù)前所有患者禁食8h以上,手術(shù)當(dāng)天平臥,分別測(cè)量?jī)纱问湛s壓與舒張壓并取平均值;采集肘靜脈血5mL,分別測(cè)空腹血糖、空腹胰島素(fastingplasmainsulin,FINS)、三酰甘油、總膽固醇、HDL-C、LDL-C等生化指標(biāo);血漿chemerin采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè),chemerin試劑盒由北京愛(ài)迪博生物制品公司提供,批內(nèi)變異<3.5%。IR用最小穩(wěn)態(tài)模型方法判定,公式為:穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估的胰島素抵抗指數(shù)(homeostasismodelassessmentofinsulinresistance,HOMA-IR)=空腹血糖(mmol/L)×空腹胰島素(mU/L)/22.5。1.2.2血管自轉(zhuǎn)體的制備所有受試者術(shù)中取皮下和大網(wǎng)膜脂肪組織各1塊,去除肉眼可見(jiàn)的血管和血塊,用無(wú)菌生理鹽水沖洗并剪成0.5g大小脂肪塊,分裝在無(wú)菌凍存管中,密封后立即置液氮罐冷凍,并轉(zhuǎn)移至-70℃冰箱凍存至總RNA提取。1.2.3rna的純度和濃度用經(jīng)典TRIZOL(Invitrogen公司)法提取脂肪組織總RNA,使用GeneQuant核酸定量分析儀測(cè)定總RNA吸光度,計(jì)算RNA濃度和純度,確保A260/A280>1.8,用1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。1.2.4cheren基因序列和pcr擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)與合成:根據(jù)人chemerin與β-actin的cDNA序列,分別由寶生物工程(大連)有限公司設(shè)計(jì)引物,序列見(jiàn)表1。取1μgRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)根據(jù)購(gòu)于Promega公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說(shuō)明操作。RealtimeRT-PCR反應(yīng)試劑購(gòu)于Bio-Rad公司的SYBRGreenSupermix。以cDNA為模板分別擴(kuò)增chemerin和內(nèi)參照β-actin基因。chemerin反應(yīng)條件:95.0℃預(yù)變性3min,95.0℃變性10s,退火和延伸55℃,30s,35個(gè)循環(huán);β-actin反應(yīng)條件:95.0℃預(yù)變性3min,95.0℃變性10s,57℃退火和延伸共30s,40個(gè)循環(huán)。利用Bio-RadIQ5熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀,分別檢測(cè)目的基因chemerin和內(nèi)參照β-actin基因,利用標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測(cè)的Ct值,分別計(jì)算大網(wǎng)膜和皮下chemerin的起始濃度。1.3差xs表示采用SPSS15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,所有數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)呈正態(tài)分布后用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,非正態(tài)分布變量經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換成近似正態(tài)分布,血漿三酰甘油與HOMA-IR進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換成近似正態(tài)分布。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),變量之間的關(guān)聯(lián)性采用Pearson相關(guān)分析和多元逐步回歸分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1臨床和生化指標(biāo)慢性膽囊炎組的BMI、臀圍和腰臀圍比均顯著高于非膽囊炎患者(P<0.01~P<0.05),而其他臨床和生化指標(biāo)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。2.2各組小鼠腰圍、腰臀圍比、三酰甘油、血糖、homa-ir、收縮壓和homa-ir比較三酰甘油與HOMA-IR經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換成近似正態(tài)分布后,MS組BMI、腰圍、臀圍、腰臀圍比、三酰甘油、空腹血糖、HOMA-IR和收縮壓均顯著高于非MS組(P<0.01~P<0.05),HDL-C顯著低于非MS組(P=0.016),而年齡、LDL-C、舒張壓和FINS等的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。2.3血漿cherenmrna表達(dá)水平血漿chemerin水平在慢性膽囊炎與非膽囊炎兩組的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;且兩組間大網(wǎng)膜和皮下脂肪組織chemerin的表達(dá)水平也均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)。慢性膽囊炎81例中,MS和非MS的結(jié)果顯示,MS組的血漿chemerin水平顯著高于非MS對(duì)照組(P<0.01);大網(wǎng)膜和皮下脂肪組織chemerinmRNA表達(dá)水平MS組均較非MS組有升高趨勢(shì),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)。進(jìn)行性別分組后,女性血漿chemerin水平MS組較非MS組有顯著升高(P=0.001),但男性MS組較非MS組僅有升高趨勢(shì),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;MS組以及非MS組皮下以及大網(wǎng)膜脂肪組織chemerinmRNA表達(dá)水平按性別分組后差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表5)。2.4血漿chgein水平與年齡、三酰甘油、腰家庭暴力的相關(guān)性觀察對(duì)象81例總體皮下脂肪組織chemerinmRNA表達(dá)量與大網(wǎng)膜脂肪組織chemerinmRNA表達(dá)量顯著正相關(guān)(r=0.391,P<0.01),與血漿chemerin水平顯著正相關(guān)(r=0.469,P<0.01,圖1),與年齡、性別、腰圍、臀圍、腰臀圍比、收縮壓、舒張壓、LDL-C、三酰甘油、空腹血糖及FINS之間均無(wú)明顯相關(guān)性;血漿chemerin水平與年齡、三酰甘油、腰臀圍比及HOMA-IR顯著正相關(guān)(r=0.434,P<0.01;r=0.368,P=0.003;r=0.251,P=0.031;r=0.225,P=0.041),與收縮壓、舒張壓、LDL-C、空腹血糖及FINS之間均無(wú)明顯相關(guān)性。進(jìn)一步以血漿chemerin水平為應(yīng)變量,以年齡、性別、腰臀圍比、收縮壓、舒張壓、HDL-C、三酰甘油、空腹血糖、HOMA-IR為自變量進(jìn)行多元逐步回歸分析,進(jìn)入回歸方程的因素為年齡、三酰甘油和腰臀圍比(R2=0.497,表6)。3患者臨床和生化指標(biāo)白色脂肪組織除了具有重要的代謝功能,還是一個(gè)活潑的內(nèi)分泌器官,分泌許多具有各種生物學(xué)功能的脂肪因子,如瘦素、腫瘤壞死因子α(tumornecrosisfactorα,TNF-α)等細(xì)胞因子。脂肪因子在調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化和代謝以及局部炎癥反應(yīng)中具有重要的自分泌和(或)旁分泌作用,同時(shí),脂肪因子通過(guò)內(nèi)分泌或大腦、肝臟以及肌肉的系統(tǒng)行為在調(diào)節(jié)糖、脂代謝中發(fā)揮重要的作用。而許多脂肪因子的分泌和(或)血清水平完全受肥胖程度的影響,因此,肥胖及其引起脂肪因子分泌的失調(diào)成為聯(lián)系肥胖、T2DM及心血管疾病的致病因素。Chemerin是新近發(fā)現(xiàn)的一種具有分泌作用的膜結(jié)合蛋白,由脂肪細(xì)胞分泌。作為免疫調(diào)節(jié)抗原呈遞細(xì)胞特異性亞群的趨化因子,在炎癥或組織損傷部位chemerin具有潛在的控制免疫應(yīng)答的作用,然而chemerin在代謝調(diào)節(jié)中的作用并不清楚。有研究顯示,chemerin可調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的分化,血漿chemerin水平與BMI、血漿三酰甘油和血壓相關(guān),并且在3T3-L1脂肪細(xì)胞,chemerin刺激了脂肪細(xì)胞中胰島素信號(hào)的增加及葡萄糖的攝取,近年來(lái)日益受到人們的關(guān)注。本研究以長(zhǎng)期居住在新疆的維吾爾族群體作為研究對(duì)象,由于該民族特殊的生活、飲食習(xí)慣及遺傳因素的影響,肥胖患病率遠(yuǎn)高于全國(guó)平均水平。而肥胖是一種慢性低度炎癥狀態(tài),尤其是中心性肥胖為MS的基礎(chǔ),是誘發(fā)IR的重要誘因,中心性肥胖患者脂肪因子分泌的失調(diào)可能在MS的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。如致炎細(xì)胞因子TNF-α、激活的核轉(zhuǎn)錄因子κB和誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激,均可導(dǎo)致血脂異常、IR、高血壓、內(nèi)皮功能紊亂和動(dòng)脈粥樣硬化的形成。本研究首先對(duì)慢性膽囊炎與非膽囊炎患者進(jìn)行分組,兩組臨床和生化資料數(shù)據(jù)分析顯示,兩組間BMI、臀圍和腰臀圍比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其他的臨床和生化指標(biāo)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;同時(shí)血漿chemerin水平、大網(wǎng)膜和皮下脂肪組織chemerin的表達(dá)水平在兩組間也均無(wú)顯著性差異。由于MS是以中心性肥胖為必要條件,血糖、三酰甘油和血壓中的兩項(xiàng)異常指標(biāo)合并腹圍為分組標(biāo)準(zhǔn),不是以肥胖為分組標(biāo)準(zhǔn),因此,排除了慢性膽囊炎對(duì)臨床生化指標(biāo)和MS分析造成的混雜因素。為進(jìn)一步排除慢性膽囊炎和非慢性膽囊炎在MS中的差別,我們只選用慢性膽囊炎患者81例進(jìn)行亞組分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)按照MS和非MS分組后,MS組BMI、腰圍、臀圍、腰臀圍比、空腹血糖、HOMA-IR、三酰甘油和收縮壓均高于非MS組,而HDL-C低于非MS組,反映了維吾爾族MS組人群具有明顯的中心性肥胖、糖耐量受損及血脂紊亂等臨床特點(diǎn)。而且維吾爾族MS患者血漿chemerin水平顯著升高(P<0.01),進(jìn)行性別分組后,女性MS患者血漿chemerin水平較非MS組研究對(duì)象有顯著升高,但男性僅有升高趨勢(shì),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這與Bozaoglu和王興洲對(duì)T2DM患者的研究結(jié)果不同,可能是由于不同研究群體在遺傳背景上有較大的差異,以及不同地域、居住環(huán)境及飲食習(xí)慣等環(huán)境因素的影響,因此還有待于進(jìn)一步研究。本組資料中大網(wǎng)膜和皮下脂肪組織chemerinmRNA表達(dá)水平MS患者與非MS對(duì)照相比均有升高趨勢(shì),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;進(jìn)行性別分組后,這種差異依然無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明新疆維吾爾族人群chemerin的表達(dá)水平在不同性別之間可能無(wú)差異,或許chemerin蛋白是一個(gè)對(duì)性激素不敏感或其表達(dá)不受性激素影響的脂肪因子,當(dāng)然進(jìn)行性別分組后,也可能由于樣本量較小而造成差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果,因此尚需擴(kuò)大樣本量作進(jìn)一步研究。本研究數(shù)據(jù)顯示,皮下脂肪組織chemerinmRNA表達(dá)量與大網(wǎng)膜脂肪組織chemerin的表達(dá)量顯著正相關(guān),提示大網(wǎng)膜脂肪細(xì)胞貯存脂肪過(guò)多,張力增加,一方面引起脂肪向其他部位的轉(zhuǎn)移,另一方面導(dǎo)致脂肪因子chemerin分泌的失調(diào);而皮下脂肪組織chemerinmRNA表達(dá)量與血漿chemerin水平顯著正相關(guān),提示皮下脂肪組織chemerinmRNA表達(dá)量的升高可能是血漿chemerin水平升高的主要原因,但是否MS患者脂肪組織表達(dá)的chemerin在炎癥發(fā)生時(shí)可能被蛋白酶水解為生物活性形式并分泌入血,而相應(yīng)對(duì)照組人群的chemerin則保持全長(zhǎng)的無(wú)活性形式,這一轉(zhuǎn)錄后水平,如翻譯和(或)分泌水平的調(diào)節(jié),尚需擴(kuò)大樣本量作進(jìn)一步探討進(jìn)行明確。國(guó)外報(bào)道毛里求斯肥胖、T2DM和BMI>30kg/m2的MS患者血漿chemerin水平顯著升高,糖耐量正常對(duì)照組在調(diào)整了年齡和性別后,血漿chemerin與BMI、空腹血糖、三酰甘油及血壓顯著相關(guān);王興洲報(bào)道江蘇新診斷T2DM患者血漿chemerin與腰臀圍比以及收縮壓正相關(guān)。本組數(shù)據(jù)相關(guān)分析顯示,觀察對(duì)象總體血漿chemerin與皮下脂肪組織chemerinmRNA表達(dá)量顯著正相關(guān),與年齡、三酰甘油、腰臀圍比及HOMA-IR顯著正相關(guān)。多元回歸分析發(fā)現(xiàn),年齡、三酰甘油和中心性肥胖參數(shù)腰臀圍比是影響血漿chemerin水平的主要因素,提示體脂分布可能比體脂含量對(duì)chemerin的表達(dá)影響更明顯。而血漿chemerin水平所表現(xiàn)出的與腰臀圍比、三酰甘油及HOMA-IR顯著的相關(guān)性,表明chemerin可能在MS的關(guān)鍵標(biāo)志,如中心性肥胖、三酰甘油水平升高、IR的發(fā)生發(fā)展中