綿羊皮膚血管瘤中kap8-1基因表達量的測定

綿羊皮膚血管瘤中kap8-1基因表達量的測定

角蛋白相關蛋白質（角蛋白，kap）和角蛋白中間的絲狀角蠶絲是羊毛纖維的主要組成部分。羊毛和山羊的角蛋白組成和含量與纖維的質量密切相關。Yu等(2009)研究發(fā)現不同綿羊品種的KAP的差異表達對羊毛品質具有決定性的作用。Zhou等(2012)指出有超過上百種KAP基因被分為27個KAP家族,在哺乳動物體內相繼被鑒定。KAP分為含硫KAP、超高硫KAP、高甘氨酸/酪氨酸KAP3種類型。Matsunaga等(2013)研究發(fā)現,高甘氨酸/酪氨酸KAP有助于增加毛纖維機械強度和促進毛發(fā)的形成。羊毛性狀在品種間、品種內、不同品系間存在一定的差異,且普遍認為受微效多基因控制的,也可能存在主效基因。趙志東等(2012)指出角蛋白基因的差異表達引起不同區(qū)域和不同品種絨山羊所產羊絨的品質存在著明顯差異。因而本研究候選了編碼毛纖維的結構蛋白KAP8-1基因作為研究對象,從而探索KAP8-1基因對綿羊皮膚毛囊發(fā)育的調控作用,為進一步明確KAP8-1基因與羊毛品質之間的關系提供參考。1基于生物活性的ro-pcr擴增10月齡3個雜交組合羊:杜泊羊(♂)×小尾寒羊(♀)組(簡稱DH組)、南非肉用美利奴羊(♂)×小尾寒羊(♀)組(簡稱NH組)、南非肉用美利奴羊(♂)×東北細毛羊(♀)組(簡稱ND組)各3只由乾安縣志華種羊場提供。取肩部皮膚,迅速放入液氮中保存,用于總RNA的提取。TrizolRNA提取液、反轉錄試劑盒、dNTP均購自寶生物工程(大連)有限公司;TaqDNA聚合酶、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞均購自天根生化科技(北京)有限公司。PCR儀(Eppendorf公司);核酸分析儀(BioRad公司);實時熒光定量PCR儀(ABI公司)。按Trizol法提取總RNA,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質量,用核酸分析儀檢測RNA純度和濃度。反轉錄合成cDNA,合成反應體系20μL:總RNA2μg,OligodTPrimer1μL,dNTPMixture1μL,5×First-strandBuffer4μL,TM-MuLVReverseTranscriptate1μL,RNaseInhibitor1μL,RNaseFreedH2O補齊至20μL?；靹蛑糜赑CR儀器中反轉錄合成cDNA,反應條件:42℃50min,70℃10min。利用PrimerPremier5.0軟件設計引物,引物序列見表1。以cDNA為模板,擴增目的基因片段,PCR反應體系50μL:cDNA2μL,上、下游引物各2μL,2×TaqMasterMix25μL,RNaseFreeH2O19μL。PCR反應條件:94℃預變性2min;94℃變性30s,56℃退火30s,72℃延伸30s,26個循環(huán);72℃延伸2min。反應結束后,對擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。以純化的cDNA為模板,β-actin為內參,采用Real-timePCRSYBRGreenⅠ染料法,對KAP8-1基因mRNA相對表達量進行定量分析。Real-timePCR反應總體系20μL:SYBRGreenReal-timePCRMasterMix10μL,上、下游引物各0.8μL,模板cDNA2μL,RNaseFreedH2O6.4μL。熒光定量PCR反應條件:95℃預變性1min;95℃變性50s,60℃退火15s,72℃延伸45s,40個循環(huán)。根據熒光定量Ct值,采用2-△△Ct法計算KAP8-1基因mRNA的相對表達量。2熒光定量rt-pcr檢測kap8-1和-actin基因的表達用核酸測定儀測得總RNA樣品D260nm/D280nm均為1.8~2.0之間;總RNA經1%瓊脂糖凝膠電泳,結果顯示,28S、18S和5S條帶清晰(圖1),說明總RNA的質量較好。以反轉錄后的cDNA作為模板,對KAP8-1和β-actin基因分別進行PCR擴增,結果見圖2、3。由圖2、3可知,KAP8-1和β-actin基因都擴增出了目的片段,且擴增特異性好,進一步說明提取的RNA質量可以滿足熒光定量RT-PCR試驗的要求。由圖4可知,熒光定量分析結果表明,KAP8-1基因mRNA在3個雜交種綿羊皮膚毛囊中均有表達,而以細毛羊為母本的南非肉用美利奴羊(♂)×東北細毛羊(♀)組綿羊KAP8-1基因mRNA相對表達量高于另外2組,且三者相對表達量比值為7.56∶2.19∶1,說明KAP8-1基因對綿羊皮膚毛囊的發(fā)育、羊毛品質差異具有一定的調控作用。3最明顯的基因在前后抗氧化和結構上的表達劉海英等(2010)采用PCR-SSCP技術對內蒙古絨山羊群體中KAP8-1基因多態(tài)性檢測,關聯(lián)分析結果表明,不同基因型對產絨量、絨長度和毛長度有顯著影響(P<0.05),但對絨細度沒有影響。王志有等(2010)利用PCR-SSCP技術研究了高原型藏綿羊KAP8基因外顯子的多態(tài)性,結果表明,KAP8基因AB基因型的產毛量性狀顯著高于AA和BB基因型(P<0.05),KAP基因不僅在不同品種羊皮膚內存在差異表達,且相同品種的不同毛囊類型內也存在差異表達。汪玲(2010)利用原位雜交技術對遼寧新品系絨山羊興盛期KAP7.1和KAP8.2基因在初、次級毛囊中表達進行定位,實時熒光定量PCR結果顯示,KAP7.1和KAP8.2基因在次級毛囊中表達均高于在初級毛囊中的表達,相對定量分析發(fā)現,KAP7.1在次級毛囊中的表達量是初級毛囊的2.28倍,而KAP8.2在次級毛囊中的表達量更高,是初級毛囊的2.71倍。邢孟欣(2010)通過Real-timePCR研究發(fā)現KAP8.1基因在遼寧新品系絨山羊初、次級毛囊中的表達量差異不明顯。此外,KAP8.1基因在初級毛囊中存在對稱和不對稱表達,在毛球彎曲處有微弱的表達,且在初級毛囊的髓質層中表達。Yu等(2009)采用原位雜交技術研究了KAP基因在毛囊中的表達,結果發(fā)現,KAP6-1基因在毛囊皮層細胞內表達,說明其對毛囊內特定結構的形成具有一定的作用。王利等(2011)利用經體外合成、用地高辛標記的阿爾巴斯白絨山羊高甘氨酸/酪氨酸KAP基因家族成員的cRNA探針,通過原位雜交技術探測其基因家族成員在內蒙古阿爾巴斯白絨山羊皮膚毛囊中強烈的表達信號,說明高甘氨酸/酪氨酸KAP是絨山羊毛和絨皮質蛋白的組成成分,是皮質層中起角質化作用的重要蛋白質,直接參與絨毛和粗毛的合成,對毛發(fā)的理化性質具有重要作用。Gong等(2011)指出KAP基因的多態(tài)性與絨品質顯著相關。艾買提·買買提(2013)研究發(fā)現,KAP8-1與KAP8-2基因可分別作為中國美利奴羊(新疆型)毛細度評分、毛彎曲評分