舟山沿海潮間帶底泥微生物的分離與鑒定

舟山沿海潮間帶底泥微生物的分離與鑒定

海洋微生物是海洋生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在生物、遺傳因素和生態(tài)功能方面具有多樣性。過去10年間,有近5000種新的海洋天然產物被發(fā)現(xiàn),其中大多數(shù)是由海洋微生物產生的。作為海洋生物組成種類最多的一類生物,國外學者認為海洋微生物仍有99.5%～99.9%未被認識,因此有著巨大的開發(fā)潛力。作為海洋微生物開發(fā)應用的前提,海洋微生物資源多樣性的調查就有著不言而喻的重要意義。舟山地處長江、錢塘江、甬江入?？?沿岸流、臺灣暖流和黃海冷水團交匯于此,如此獨特的海洋環(huán)境蘊藏著豐富的微生物資源。本實驗對舟山沿海潮間帶海泥中的微生物的組成和抗菌活性進行了初步研究,為將來的微生物資源開發(fā)和利用提供科學依據(jù)。1材料和方法1.1內部大層壓結t樣品采自舟山沿海7個采樣點:長峙島(CZ)、沈家門漁港(SY)、塘頭(TT)、釣山(DS)、鴨蛋山碼頭(YM)、干欖船廠(GC)、富翅島(FC)的潮間帶海泥(表層以下10～12cm)。采集樣品均保存在無菌瓶中,采樣結束后當天直接用新鮮海泥樣品進行菌種分離實驗。1.2蛋白顆粒、酵母膏、牛肉膏的制備放線菌分離培養(yǎng)基包括:(Ⅰ)蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、(Ⅱ)高氏一號培養(yǎng)基(GAU)、(Ⅲ)AMM培養(yǎng)基;細菌分離培養(yǎng)基包括:(Ⅳ)Zobell2216E培養(yǎng)基、(Ⅴ)MR2A培養(yǎng)基(Difco)、(Ⅵ)分離培養(yǎng)基(葡萄糖5g,蛋白陳4g,酵母膏5g,牛肉膏4g,瓊脂20g,海水1000mL,pH6.0-6.5,115℃滅菌25min);真菌分離培養(yǎng)基包括:(Ⅶ)查氏培養(yǎng)基、(Ⅷ)馬丁氏培養(yǎng)基、(Ⅸ)馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。所有培養(yǎng)基和稀釋液用陳海水配置。稱取10g海泥,加入盛有90mL滅菌陳海水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中,搖床振蕩30min(25℃,8400r/min),取上清液逐級稀釋為10-1～10-5濃度,每個梯度取100μL上清接種在固體培養(yǎng)基平板上,在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)肉眼觀察,將所有單菌落分別轉接劃線在相同培養(yǎng)基平板上,分離純化。挑出單菌落接種在固體培養(yǎng)基上,置于25℃下繼續(xù)培養(yǎng)3～7d。1.3中國微生物菌種拮抗實驗指示菌包括:①革蘭氏陰性菌:大腸桿菌(Escherichiacoli,簡寫為EC,下同),熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens,PF),副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus,VP);②革蘭氏陽性菌:枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis,BS),金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,SA),藤黃微球菌(Micrococcusluteus,ML);③白假絲酵母(Candidaalbicans,CA);④黑曲霉(Aspergillusniger,AN),所有菌種均來自中國微生物菌種保藏中心。采用紙片擴散法,以測量的抑菌圈(直徑Φ)大小來判斷拮抗反應的強弱。2結果與分析2.1培養(yǎng)基的分離效果采用9種培養(yǎng)基進行微生物的分離,結果見表1。在用于分離放線菌的3種培養(yǎng)基中,蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基的分離效果最好;在用于分離真菌的3種培養(yǎng)基中,馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基的分離效果最好;分離細菌的培養(yǎng)基中,ZOBELL培養(yǎng)基和MR2A培養(yǎng)基效果較好,而MR2A培養(yǎng)基略勝一籌。對于潮間帶底泥微生物的分離,高氏一號培養(yǎng)基和馬丁氏培養(yǎng)基的分離效果最不理想。2.2菌株的抗菌活性從7個采樣點分離到488株菌株,按照常規(guī)細菌學和真菌學鑒定方法,確定82株菌株為放線菌(占總菌株的17.6%),331株菌株為真菌(占總菌株的67.8%),71株菌株為細菌(占總菌株的14.6%),采樣點和菌株分布見表2。用8種指示菌進行拮抗實驗,結果表明:在所有待測菌株中,有154株菌株具有抗菌活性(占總分離菌株的31.6%),其中抗大腸桿菌的有41株,占26.6%;抗枯草芽孢桿菌的有42株,占27.3%;抗金黃色葡萄球菌的有34株,占22.1%;抗熒光假單胞菌的有9株,占5.8%;抗副溶血性弧菌的有26株,占16.9%;抗藤黃微球菌的有88株,占57.1%;抗黑曲霉的有18株,占11.7%;抗白假絲酵母的有39株,占25.3%。在154株具有抗菌活性的菌株中,對革蘭氏陽性菌有拮抗作用的有115株,占74.6%,對革蘭氏陰性菌有拮抗作用的有62株,占40.3%,同時對革蘭氏陽性和陰性菌都有拮抗作用的菌株有23株,占14.9%。具較廣抗菌譜和強抗菌活性的菌株見表3。3帶底泥微生物的數(shù)量和分布當前對于海洋微生物的研究大多集中在海洋生物共附生微生物的抗腫瘤、抗菌活性物質的提取和分離,極端微生物產酶條件的優(yōu)化等方面,對潮間帶底泥微生物的數(shù)量和分布進行系統(tǒng)研究的較少。研究表明,由于潮間帶初級生產力程度高,礦物質含量豐富,比外海有更高的沉降率,同時海洋酵母與海洋真菌多喜歡吸附在海泥微顆粒上,因此潮間帶底泥中微生物的數(shù)量比海水中的數(shù)量要明顯增多,但由于臨港工業(yè)發(fā)展和圍海造田等因素,潮間帶的面積在迅速減少,潮間帶微生物的多樣性受到不同程度的破壞,因此對潮間帶微生物的區(qū)系調查還是非常必要的。3.1培養(yǎng)基的篩選結果對于微生物的分離,恐怕沒有一種培養(yǎng)基可以完全適用于不同微生物。我們針對細菌、真菌和放線菌,各選擇了3種常用的分離培養(yǎng)基,通過實驗可知,蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基對于舟山沿海潮間帶海泥放線菌的分離效果明顯要比高氏一號培養(yǎng)基和AMM培養(yǎng)基好,出菌率高,培養(yǎng)效果顯著,同時筆者在實驗中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中加入濃度為50×10-6的重鉻酸鉀并沒有抑制細菌和真菌生長,反而對放線菌的分離有抑制作用,這種現(xiàn)象在其他文獻中也有報道,具體機制可能還有待進一步研究。馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基對舟山沿海潮間帶底泥真菌的分離效果要比查氏培養(yǎng)基和馬丁氏培養(yǎng)基顯著,馬丁氏培養(yǎng)基的分離效果最不理想,出菌率比馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基要少兩個數(shù)量級。ZOBELL培養(yǎng)基和MR2A培養(yǎng)基對舟山沿海潮間帶底泥細菌的分離效果都較好,而用海水制備的R2A培養(yǎng)基雖然價格比較貴,但培養(yǎng)基質量好,分離效果更為顯著。3.2海泥微生物數(shù)量潮間帶富含有機物和營養(yǎng)鹽,微生物資源非常豐富,潮間帶底泥細菌的一般在103～109CFU/g,而98%的鏈霉菌來自小于3m的海泥中,國內對沿海潮間帶的微生物研究較少,紀元等對江蘇射陽地縣灘涂的微生物數(shù)量進行了分析,結果表明表層灘涂土壤(0～30cm)的細菌數(shù)量為1.75×107CFU/g,放線菌數(shù)量為1.7×106CFU/g;王書錦等對遼寧近海的海泥微生物研究結果顯示,海泥平均含細菌總量在(2.2～9.6)×104CFU/g,平均真菌總量在(2.2～8.1)×103CFU/g;本實驗結果表明:舟山沿海潮間帶的海泥細菌總量在7.6×105～1.8×107CFU/g之間,與江蘇沿海地區(qū)灘涂的細菌總量基本在同一數(shù)量級上,比遼寧海區(qū)的數(shù)量要多,這可能是東海海區(qū)豐富的營養(yǎng)鹽沉積導致細菌數(shù)量增加;舟山潮間帶的海泥放線菌總量在2.4×103～7.3×104CFU/g之間,比江蘇射陽的灘涂放線菌數(shù)量明顯要少。在7個采樣點中,鴨蛋山碼頭和沈家門漁港這兩個地點海泥的放線菌數(shù)量要比其他區(qū)域的數(shù)量明顯減少,但多樣性要強,類似情況在國外也有報道,其原因可能與碼頭港口來自城市生活污水帶來的富營養(yǎng)環(huán)境有關;舟山潮間帶的海泥真菌總量在3.1×103～5.8×104CFU/g之間,比舟山海域海底沉積物的真菌含量(2250CFU/g)要高,說明潮間帶的真菌比海底沉積物的數(shù)量要多,同時實驗中我們觀察到各種真菌的顏色明顯,種類眾多,說明潮間帶海泥中真菌的多樣性非常豐富。3.3治療東南角真菌生長的主要菌種雖然陸地放線菌產生的抗生素占已發(fā)現(xiàn)的天然來源抗生素的2/3以上,但本次實驗分離到有抑菌活性的