海洋細菌的分離、篩選及活性菌株的分離

海洋細菌的分離、篩選及活性菌株的分離

1海洋微生物活性物質(zhì)與陸生生物的次生代謝相比，生物多樣性生活環(huán)境復(fù)雜，類別多樣化，因此天然產(chǎn)物具有許多新的結(jié)構(gòu)骨架和獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)，在生物活性方面發(fā)揮著更積極的作用。通過這項研究，許多科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，海生動物中的一些活性物質(zhì)來自一般水生微生物。由于海動物中活性物質(zhì)含量低、生物量有限，因此海洋微生物作為活動物質(zhì)的可持續(xù)資源得到了國內(nèi)外研究人員的認可。微生物在海洋環(huán)境中分布廣泛,或生活于海水中,或存在于沉積物和海泥中,或與海洋生物處于共生、共棲、寄生或附生的關(guān)系.特別是海洋生物附生微生物,由于在空間、營養(yǎng)、光線等方面的競爭關(guān)系,能產(chǎn)生許多具有工業(yè)和藥用價值的天然產(chǎn)物.而且培養(yǎng)這類微生物的條件更接近于自然水體,相對于海洋生物內(nèi)共生微生物要容易得多,從這類微生物中尋找天然產(chǎn)物為開發(fā)海洋活性物質(zhì)開辟了新的空間.本實驗從山東青島、煙臺以及浙江南麂島潮間帶水域分離海洋細菌,研究其抗菌和細胞毒活性,比較了活性細菌與來源的相關(guān)性,為今后海洋微生物活性物質(zhì)的研究進行了前期工作.2材料和方法2.1采集材料及測定條件2002年6月在浙江南麂島潮間帶采集海水、海泥及海洋生物樣品:鏈狀節(jié)莢藻(Lomentariacatenata)、岡村凹頂藻(Laurenciaokamurai)、裂片石莼(Ulvafasciata)、珍珠膜海綿(Hymeniacidonperleve)、真叢柳珊瑚(Euplexauracurvata),2002年8月在山東青島、煙臺沿海潮間帶采集海水、海泥、孔石莼(Ulvapertusa)、鼠尾藻(Sargassumthunbergii)、叉枝藻(Gymnogongrusflabelliformis)、海帶(Laminariajaponica)、海葵(未鑒定)和石鱉(未鑒定).2.2學(xué)習(xí)方法2.2.1u3000酸研磨法1)生物樣品的處理:剪取0.5g樣品,用無菌海水漂洗3遍,除去非附生細菌,加入10ml無菌海水25℃研磨,再用無菌海水稀釋為10-1、10-2兩個稀釋度;2)海泥樣品:稱取0.5g樣品加入10ml無菌海水,振蕩搖勻后靜置,吸取上層海水用無菌海水稀釋為10-1、10-2兩個稀釋度;3)海水樣品:用無菌海水稀釋為10-1、10-2兩個稀釋度.2.2.2培養(yǎng)基的制備細菌分離培養(yǎng)基采用1/10Zobell2216E固體培養(yǎng)基.樣品涂布后25℃培養(yǎng)20d,挑取不同形態(tài)、不同色素的單菌落轉(zhuǎn)入斜面培養(yǎng),經(jīng)2次純化后8℃保存.2.2.3活性物質(zhì)的提取純化菌株活化2d后接種于裝有300mlZobell2216E液體培養(yǎng)基的三角瓶中,25℃培養(yǎng)7d.培養(yǎng)液離心(5000g×30min)除去菌體,用乙酸乙酯(100ml×3)提取上清液,乙酸乙酯相37℃蒸干作為活性檢測的粗提取物.2.2.4菌株篩選as1.4以枯草芽孢桿菌CMCC(B)63003(Bacillussubtilis,BS);金黃色葡萄球菌CMCC(B)26001(Staphylococcusaureus,SA);大腸桿菌CMCC(B)44102(Escherichiacoli,EC);根瘤土壤桿菌AS1.1416(Agrobacteriumtumefaciens,AT);釀酒酵母ACCC2.1882(Saccharomycescerevisia,SC)作為實驗用敏感指示菌,用瓊脂擴散法篩選活性菌株;粗提取物用甲醇溶解,配制成100mg·ml-1的溶液,吸取20μl加在滅菌烘干的濾紙片(直徑為6mm)上,置于上層含有指示菌的雙層營養(yǎng)瓊脂固體平板中,甲醇作為陰性對照,青霉素、氯霉素紙片(上海醫(yī)藥化驗所產(chǎn))作為陽性對照.培養(yǎng)皿放于8℃冰箱中過夜,次日于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h觀察結(jié)果,根據(jù)抑菌圈大小判別抑菌活性.2.2.5mtt法:具有細胞毒活性以腫瘤細胞Hela,BGC(中國科學(xué)院上海細胞研究所)作為目標(biāo)細胞,培養(yǎng)基為含10%BCS的1640培養(yǎng)基,細胞毒活性測定采用MTT法,參照文獻略有改動.細胞用胰酶消化后,調(diào)節(jié)密度為2～3×104個/孔,添加于96孔板中,每孔195μl,置于37℃、0.5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h.粗提取物用甲醇溶解后加入培養(yǎng)板中,每孔樣品濃度為200μg·ml-1,以甲醇作為陰性對照,37℃、0.5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h.取出96孔板,每孔加入20μlMTT(5mg·ml-1),繼續(xù)培養(yǎng)4h.棄培養(yǎng)液,每孔加入150μlDMSO,37℃振蕩6min,492nm處測定各孔的光吸收,計算抑制率IR=(OD陰性對照-OD樣品)/OD陰性對照×100%.IR≥50%判定為具有細胞毒活性.2.2.6細菌的鑒定對具有抗菌和細胞毒的海洋細菌進行菌種鑒定,G+菌采用Shewan海洋異養(yǎng)細菌鑒定系統(tǒng),G-菌采用Oliver海洋細菌鑒定系統(tǒng).3結(jié)果與分析3.1海洋細菌的抑菌能力根據(jù)采樣海域及菌落形態(tài)、大小、色澤等特點,從海水、海泥及生物樣品中共分離到341株海洋細菌.對5株敏感指示菌的抑菌實驗表明,42株細菌具有至少抑制一種指示菌的活性(表1),其中4株對所有指示菌都有抑制作用,分別是真叢柳珊瑚(Euplexauracurvata)中分離到的NJ5-7-1、珍珠膜海綿(Hymeniacidonperleve)中分離到的NJ6-3-1、來源于青島海水的QD1-2、來源于青島石鱉的QD5-2-1.具有抑菌作用的海洋細菌屬于假單胞菌屬(Pseudomonas)、發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)、交替單胞菌屬(Alteromonas)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、屈橈桿菌屬(Flexibacter)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)7個屬,而大部分的活性菌株屬于發(fā)光桿菌屬(12株,28.6%)、假單胞菌屬(10株,23.8%)、梭狀芽孢桿菌屬(6株,14.3%)、黃桿菌屬(6株,14.3%)和交替單胞菌屬(5株,11.9%).具有活性的海洋細菌對于指示菌表現(xiàn)出不同的抑菌譜(圖1),42株海洋細菌中只有9%對EC有抑制作用,17%對SC有抑制作用,對SA有抑制作用的占52%,對BS有抑制作用的為69%,對AT有抑制作用的最多,占總數(shù)的81%.Lemos在實驗中也發(fā)現(xiàn)海洋細菌很難對陸源病原菌EscherichiacoliATCC25922產(chǎn)生抑制作用;Ivanova篩選到的126株抗菌菌株中只有4株對E.coli的生長有抑制作用.造成這一現(xiàn)象的原因可能是革蘭氏陰性菌的細胞外膜上具有狹窄的膜孔道蛋白,阻礙了極小親水性抗生素類化合物進入細胞,而膜上的脂多糖成分也可降低親脂性抗生素的穿膜擴散;Lewis則認為,在細菌中存在“抗藥性泵”(Multidrugresistancepump)可將許多抗生素從胞內(nèi)排出.這也是目前許多細菌抗藥性的原因之一.3.2細胞毒活性測定在分離到的海洋細菌中有7株細菌的培養(yǎng)液粗提取物具有細胞毒活性(表2).QD1-2和NJ6-3-1除有抗菌活性外,對兩種腫瘤細胞都有較高的細胞毒活性,IR值分別為65.0±0.9%和55.2±1.7%、60.2±2.6%和50.3±2.5%;具有抗菌活性菌株QD5-2-1和NJ6-3-2分別對兩種腫瘤細胞中的一種有抑制作用.另外3株沒有抗菌活性的細菌YTBM8-1A、QD7-1-1和NJ5-1-2B對Hela細胞有毒性作用.細菌分類表明這些活性菌株屬于假單胞菌屬、發(fā)光桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬和腸桿菌科(Enterobacteriaceae).3.3海藻附生細菌活性分析從具有抗菌、細胞毒活性的海洋細菌數(shù)量和比例來看(表3),海水和海泥中所分離到的活性菌株分別為3株(5%)和2株(7%),遠低于生物樣品.雖然來源于無脊椎動物和來源于海藻的活性菌株數(shù)量一樣多,但從比例來看,無脊椎動物達到22%,高于海藻的11%.在不同的海域,受到人為保護的南麂島自然保護區(qū)所篩選到的活性細菌數(shù)量和比例(28株,16%)要高于山東的青島和煙臺(17株,10%)(表3,表4),其中南麂島的珍珠膜海綿中篩選到8株活性細菌,是活性細菌來源最豐富的樣品,其次是真叢柳珊瑚(6株)和鏈狀節(jié)莢藻(6株).同前人的報道相似,Lemos在海藻附生細菌抗菌活性篩選工作中,發(fā)現(xiàn)17%的細菌對Staphylococcusaureus有抑制作用,對23株魚類病原菌的75%也具有抗菌活性.Ivanova等從海洋無脊椎動物體表分離到491株海洋細菌,發(fā)現(xiàn)26%對海洋細菌、陸源細菌和真菌的生長有抑制作用.Burgess等對海藻和無脊椎動物這些防御體系較弱生物的體表寄生菌非常感興趣,從這些生物表面篩選出400株細菌,發(fā)現(xiàn)35%的細菌有抗陸源病原菌活性,比從海水或土壤中篩選的高出許多.鄭忠輝、黃耀堅等開展了包括廈門海區(qū)潮間帶海洋動植物共、附生微生物的培養(yǎng)條件及其抗菌活性的研究,發(fā)現(xiàn)這些共、附生微生物具有相當(dāng)高的抑菌比例.Armstrong認為,海洋生物附生微生物與宿主有著緊密的聯(lián)系.它們一方面可以從其動植物宿主獲得必需的各種.維生素、多糖、上中不飽和脂肪酸等營養(yǎng),另一方面可以產(chǎn)生某些物質(zhì)(如抗生素、毒素、抗病毒物質(zhì)等),釋放于水體中,以利于宿主生長代謝或增強宿主的抵抗能力.在本實驗中,來源于無脊椎海洋生物和海藻的附生細菌具有相當(dāng)高的活性細菌比例.這個結(jié)果證明了一些防御能力較差的動、植物能在海洋環(huán)境中存活,除了自身具有的生存機制外,其附生微生物也扮演著一定的保護性角色.4從海洋細菌活性物質(zhì)中篩選出具有藥物價值的化合物,并將其作為海洋藥物的