顆粒污泥和懸浮填料生物膜的環(huán)境掃描電鏡觀察

顆粒污泥和懸浮填料生物膜的環(huán)境掃描電鏡觀察

作為廢水生物處理的主要對(duì)象，生物膜的微生物群落分布、豐度和功能對(duì)處理系統(tǒng)的性能和穩(wěn)定性起著重要作用。掃描電子顯微鏡（sem）是評(píng)價(jià)廢水生物處理中微生物群落結(jié)構(gòu)的重要手段之一。由于其圖像清晰度的優(yōu)點(diǎn)，它經(jīng)常被用來研究污泥和生物膜的起源以及微生物群落結(jié)構(gòu)。由于污泥和生物膜樣品含水量高、導(dǎo)電性低，因此需要進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)處理，如固定、脫水、干燥和電離作用。這不僅需要很長(zhǎng)時(shí)間，而且預(yù)處理過程中會(huì)導(dǎo)致樣品收縮、損壞或損失，這不利于觀察樣品的真實(shí)面目。環(huán)境掃描電鏡(ESEM)是在SEM基礎(chǔ)上改進(jìn)的一種新型電子顯微鏡.其采用多級(jí)壓差光闌技術(shù),形成梯度真空,即鏡筒保持高真空的同時(shí),樣品室可維持高達(dá)2.66×102Pa的氣壓;樣品室的溫度、氣壓和相對(duì)濕度可以調(diào)節(jié).其次,采用氣體二次電子探測(cè)器,通過二次電子對(duì)氣體分子的電離作用,一方面使生物樣品微弱的二次電子信號(hào)放大,另一方面所產(chǎn)生的正離子可消除生物樣品表面的電荷積累,可高倍數(shù)觀察含水量高、導(dǎo)電性差的樣品.因ESEM的可變壓力腔替代了傳統(tǒng)SEM的高真空腔,因此可不必對(duì)樣品進(jìn)行包括脫水、臨界點(diǎn)干燥、鍍金等傳統(tǒng)處理,避免破壞其完整性.ESEM與SEM結(jié)合可為生物樣品提供不同或者互補(bǔ)的形態(tài)結(jié)構(gòu)信息.盡管ESEM是一種簡(jiǎn)單且無破壞性的分析方法,但由于技術(shù)的前沿性和高成本,目前國內(nèi)外關(guān)于ESEM應(yīng)用于水環(huán)境生物樣品的報(bào)道還較少.本研究考察了廢水生物處理中顆粒污泥和懸浮填料生物膜的ESEM觀察條件,并與SEM進(jìn)行比較,討論了ESEM在廢水生物處理系統(tǒng)中應(yīng)用的優(yōu)越性和局限性,為廢水生物處理系統(tǒng)中微生物群落的研究提供支持.1材料和方法1.1溫度調(diào)節(jié)裝置厭氧顆粒污泥、好氧顆粒污泥和懸浮填料生物膜均取自本實(shí)驗(yàn)室廢水生物處理反應(yīng)器.Quanta200FEGESEM(荷蘭FEI公司),帶有冷臺(tái).樣品臺(tái)溫度調(diào)節(jié)范圍為-20~20℃,樣品室氣壓調(diào)節(jié)范圍0.13×102~2.60×103Pa.S-3400NIISEM(日本Hitachi公司).1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1生物膜的制備用無菌離心管收集顆粒污泥和懸浮填料,用磷酸鹽緩沖液充分漂洗;用濾紙吸去表面水分后,將切成小塊的填料生物膜用導(dǎo)電膠粘于樣品臺(tái)上,選擇不同溫度、氣壓、濕度和加速電壓確定適宜觀察條件;顆粒污泥用4%戊二醛溶液固定,4℃放置過夜,用薄刀片切開顆粒污泥使橫截面暴露,繼續(xù)置于4%戊二醛溶液固定,4℃過夜,觀察時(shí)將顆粒污泥粘于樣品臺(tái)上,選擇溫度、氣壓、濕度和加速電壓確定適宜觀察條件.1.2.2樣品預(yù)處理將樣品固定在2.5%戊二醛溶液中,4℃放置過夜.倒掉固定液,用1mol/L磷酸緩沖液(pH7.0)漂洗樣品3次,每次15min.然后用依次用50%、70%、80%、90%和95%的乙醇溶液進(jìn)行脫水處理,每次15~30min,再用100%乙醇溶液處理2次,臨界點(diǎn)干燥.樣品導(dǎo)電膠粘于樣品臺(tái)上,噴金鍍膜后觀察.2結(jié)果與討論2.1生物樣品形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察由圖1a可見,樣品表面水分較多時(shí)凝集的水滴會(huì)阻礙樣品原始形貌的ESEM觀察.觀察時(shí)間>40min時(shí),樣品表面出現(xiàn)干癟、脫水變形(圖1b),甚至出現(xiàn)鹽結(jié)晶體.因此對(duì)于含水量高、結(jié)構(gòu)脆弱的樣品,需要選擇合適的溫度、氣壓、濕度和加速電壓觀察生物樣品的形態(tài)結(jié)構(gòu).參照文獻(xiàn)報(bào)道,采用不同條件對(duì)樣品進(jìn)行觀察,樣品臺(tái)溫度0~5℃,樣品室汽壓5.91×102~7.88×102Pa,相對(duì)濕度75%~100%,加速電壓8.00~15.00kV.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,填料生物膜的適宜樣品室條件為樣品臺(tái)溫度5℃,樣品室汽壓5.91×102Pa相對(duì)濕度75%,加速電壓8.00~15.00kV.顆粒污泥樣品的適宜觀察條件為樣品臺(tái)溫度0℃,樣品室汽壓7.00×102Pa,相對(duì)濕度100%,加速電壓10.00kV將樣品固定于樣品臺(tái)之前,均需用濾紙吸去表面水分以防止樣品表面水滴凝集影響觀察.2.2生物膜微生物群落結(jié)構(gòu)表征由樣品1的ESEM照片(圖2a,圖2b)可見,各種形態(tài)的細(xì)菌附著在生物膜表面的胞外聚合物(EPS)上生長(zhǎng),致密的菌群層以各式各樣的桿狀菌和球狀菌為主,同時(shí)生物膜內(nèi)部供物質(zhì)交流的孔洞和通道也清晰可見.低放大倍數(shù)的SEM照片顯示生物膜上大量EPS的存在(圖2c),高放大倍數(shù)照片隱約顯現(xiàn)生物膜內(nèi)部大量桿狀和球狀菌的附著生長(zhǎng)(圖2d).與樣品1相比,樣品2的ESEM照片直觀顯現(xiàn)了其生物膜以絲狀菌為骨架,大量小球菌依靠EPS交聯(lián)聚集在其周圍(圖3a),且在生物膜內(nèi)部大量短桿狀細(xì)菌以菌膠團(tuán)形式附著在填料內(nèi)壁上生長(zhǎng),正處于分裂期的細(xì)菌也清晰可見(圖3b).SEM照片(圖3c,圖3d)僅顯示生物膜表面分布較多的絲狀菌,少量的桿狀菌附著在填料內(nèi)壁生長(zhǎng),更多的生物膜內(nèi)部形態(tài)特征信息未能體現(xiàn).由此可見,可能由于生物膜樣品經(jīng)過脫水和干燥處理后變形,較難在SEM中觀察到其正常形態(tài)結(jié)構(gòu).由于噴金鍍膜過程中的不均勻性,導(dǎo)使生物膜內(nèi)部致密的菌群層導(dǎo)電性不佳,未能獲得清晰的SEM照片.比較而言,未經(jīng)任何處理的生物膜樣品在合適的ESEM條件下得到的高放大倍數(shù)的清晰照片,能更真實(shí)的表征生物膜的微生物群落結(jié)構(gòu).2.3污泥不同內(nèi)部形態(tài)觀察由圖4a,圖4b可見,ESEM觀察厭氧顆粒污泥表面較光滑,結(jié)構(gòu)致密,表面菌群分布較為均勻,占主導(dǎo)地位的球狀菌和短桿狀菌聚集在顆粒污泥內(nèi)層.由圖4c,圖4d可見,SEM觀察到顆粒污泥呈扁橢圓形、表面以短桿菌為主要菌群,附著有少量球菌和絲狀菌,存在較多空洞,這被認(rèn)為是底物與營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞通道.污泥內(nèi)部形態(tài)的SEM與ESEM觀察結(jié)果類似.但ESEM觀察時(shí)間大于20min時(shí),發(fā)現(xiàn)厭氧顆粒污泥收縮變形影響觀察效果,這可能與顆粒污泥是高密度微生物細(xì)胞活體的聚集體,含水量高,承受能力差,在高速電子束激發(fā)下易變形有很大關(guān)系.2.4sem結(jié)果分析ESEM觀察(圖5a)顯示,好氧顆粒污泥表面較為光滑平整,而SEM照片則顯示(圖5b)其外觀粗糙、結(jié)構(gòu)致密、多處不規(guī)則突起.由此可見,SEM觀察中樣品進(jìn)行脫水、干燥、鍍金等處理導(dǎo)致了樣品脫水變形,影響了真實(shí)形貌的觀察.值得注意的是,ESEM觀察時(shí)間大于5min時(shí),同樣發(fā)現(xiàn)好氧顆粒污泥在高速電子束激發(fā)下嚴(yán)重收縮變形,難以再得到清晰圖片,其原因與厭氧顆粒污泥類似.2.5電子束前后含水量的變化廢水處理中生物樣品主要為顆粒污泥、絮狀污泥及附著各類載體(活性碳、陶粒、膜絲、載網(wǎng)、填料等)生長(zhǎng)的生物膜,如何利用ESEM真實(shí)顯示其原始形貌主要存在2個(gè)問題.第1個(gè)問題是樣品表面存在的水滴凝聚會(huì)影響觀察效果.對(duì)于廢水處理中的樣品,在其表面均有不同程度的水分,需要用濾紙吸去,并且在相對(duì)濕度較低的情況下讓其緩慢蒸發(fā),然后在合適的相對(duì)濕度下觀察,拍攝滿意的圖像.但對(duì)于不同樣品而言,相對(duì)濕度低可能會(huì)引起不同程度的樣品脫水,收縮變形(圖1b),這需要耗費(fèi)一定時(shí)間摸索最佳條件.另一個(gè)問題則是氣壓和入射電子束轟擊可能會(huì)損壞含水量高、結(jié)構(gòu)脆弱的樣品表面形態(tài).樣品在ESEM中的承受能力與含水量及結(jié)構(gòu)成分有密切聯(lián)系.附著各類載體生長(zhǎng)的生物膜吸去表面水分后,含水量不高,并且由于載體的支撐樣品表面不易變形收縮,可以承受較長(zhǎng)時(shí)間的觀察.對(duì)于顆粒污泥這類含水量高、結(jié)構(gòu)脆弱的樣品,其承受能力差,易在氣壓和高速入射電子束的轟擊下收縮變形,不易觀察到真實(shí)形貌,則需要通過鋨酸或者戊二醛等固定劑進(jìn)行化學(xué)固定,使其產(chǎn)生交聯(lián)作用、形成相對(duì)穩(wěn)定的支架,不易受樣品室環(huán)境條件影響,并且降低加速電壓,盡量縮短觀察時(shí)間,減少樣品在高能入射電子束的轟擊下變形、塌陷以至于影響觀察效果,甚至無法得到原始形貌照片.,.ESEM可以觀察不經(jīng)任何處理的生物樣品,更為真實(shí)地顯現(xiàn)其原始形貌,與常規(guī)SEM結(jié)合可為樣品形態(tài)結(jié)構(gòu)分析提供新信息;含水樣品經(jīng)過脫水、干燥以及噴金導(dǎo)電處理往往嚴(yán)重變形,且絮狀污泥體積小難以收集和處理,ESEM可避免由于人為操作造成對(duì)樣品形態(tài)的破壞以及假象的產(chǎn)生;由于樣品未經(jīng)過固定和導(dǎo)電處理,ESEM結(jié)合能譜X射線元素分析(ESEM-EDX)可為樣品的元素成分分析提供更精確的分析結(jié)果.總之,ESEM可觀察未經(jīng)任何處理的生物樣品,這為水環(huán)境領(lǐng)域中生物樣品的形態(tài)結(jié)構(gòu)研究提供了新手段,具有廣闊的應(yīng)用前景.3不同條件對(duì)樣品形貌的影響3.1ESEM觀察懸浮填料生物膜的適宜觀察條件為濾紙吸去樣品表面水分,樣品臺(tái)溫度5℃,樣品室汽壓5.91×102Pa,相對(duì)濕度75%,加速電壓15.00kV;觀察顆粒污泥樣品的適宜條件為樣品臺(tái)溫度0℃,樣品室汽壓7.00×102Pa,相對(duì)濕度100%,加速電壓10.00kV.3.2未經(jīng)任何處理的生物膜樣品在合適的ESEM