神經(jīng)生長(zhǎng)因子聯(lián)合胰島素對(duì)糖尿病大鼠深ii度燒傷創(chuàng)面表皮干細(xì)胞標(biāo)記物

神經(jīng)生長(zhǎng)因子聯(lián)合胰島素對(duì)糖尿病大鼠深ii度燒傷創(chuàng)面表皮干細(xì)胞標(biāo)記物

糖尿病患者皮膚水理酶活性的變化隨著人口老齡化進(jìn)程的加快，糖尿病患者的數(shù)量逐年增加，糖尿病患者中慢性難治性傷口的形成已成為醫(yī)生的研究重點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外大量研究表明,一些生長(zhǎng)因子如:EGF,FGF,VEGF,IGFC,NGF等可促進(jìn)創(chuàng)面愈合,而糖尿病患者皮膚中各類生長(zhǎng)因子的表達(dá)水平較正常人群低。表皮干細(xì)胞(Epidermalstemcells.,ESCs)作為皮膚組織的特異性干細(xì)胞,是皮膚組織發(fā)生、創(chuàng)面修復(fù)及改建的關(guān)鍵,能主動(dòng)參與創(chuàng)面修復(fù),促進(jìn)創(chuàng)面再上皮化。但是NGF聯(lián)合胰島素對(duì)糖尿病創(chuàng)面中ESCs的表達(dá)及創(chuàng)面愈合的影響尚未有報(bào)導(dǎo)。現(xiàn)就以糖尿病大鼠深I(lǐng)I度燙傷創(chuàng)面為研究對(duì)象,局部聯(lián)合應(yīng)用NGF和胰島素進(jìn)行治療,觀察創(chuàng)面愈合中表皮干細(xì)胞表達(dá)水平的變化,探討兩者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)糖尿病患者慢性難愈創(chuàng)面愈合的可能機(jī)制。1材料和方法1.1儀器、試藥和儀器清潔級(jí)雄性Wistar大鼠75只,體重200~220g,由甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。鏈脲佐菌素(streptozotocinSTZ,Sigma公司,美國(guó));胰島素諾和靈30R(40U/mL,諾和諾德公司,丹麥);鼠抗β1整合素和K19抗體(Bioworld公司,美國(guó));SP試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。快速血糖檢測(cè)儀(北京怡成生物電子技術(shù)有限公司);ImageProPlus6.0病理圖像分析軟件(MediaCybernetics公司,美國(guó));LeicaQwin圖像分析儀系統(tǒng)(Leica公司,德國(guó))。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1各組大鼠血糖、胰島素治療組b、f、nf聯(lián)合胰島素治療組b、d將75只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(A)、糖尿病對(duì)照組(B)、胰島素治療組(C)、NGF治療組(D)、NGF聯(lián)合胰島素治療組(E),每組15只。1.2.2糖尿病造模成功將B、C、D、E組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后。給予用檸檬酸緩沖液稀釋的STZ采用兩步給藥法腹腔注射,劑量為第1天10mg/kg,第3天50mg/kg。A組給予相同劑量檸檬酸緩沖液腹腔注射,1周后用快速血糖儀檢測(cè)血糖,隨機(jī)血糖≥16.7mmol/L視為糖尿病造模成功。對(duì)不達(dá)標(biāo)者3天后以10~15mg/kg補(bǔ)充腹腔注射STZ,均成功制備糖尿病大鼠模型。1.2.3乳酸-林格氏液?jiǎn)未巫⑸?.糖尿病大鼠建模成功后1個(gè)月,體重不增甚至個(gè)別有明顯消瘦。10%水和氯醛液,腹腔內(nèi)注射麻醉(30mg/kg),背部脫毛,次日同法麻醉后,用96℃恒溫水蒸氣在大鼠背部造成兩個(gè)直徑約3.5cm圓形深I(lǐng)I度燙傷,1小時(shí)后腹腔注射乳酸-林格氏液進(jìn)行復(fù)蘇。傷后1d病理證實(shí)為深I(lǐng)I度燙傷。1.2.4月內(nèi)溫度調(diào)整將每只大鼠單籠喂養(yǎng),傷后創(chuàng)面換藥2次/日。A、B組用浸潤(rùn)有5ml生理鹽水的紗布外敷;C組用浸潤(rùn)有5mlNovolin30R溶液(1U/ml)的紗布外敷,并于每日下午5~6點(diǎn)鐘腹部皮下注射Novolin30R4~6U/(kg·d);D組用浸潤(rùn)有5mlNGF溶液(25U/ml)的紗布外敷,并每日下午5~6點(diǎn)鐘腹部皮下注射Novolin30R4~6U/(kg·d);E組用浸潤(rùn)有5mlNGF(25U/ml)和5UNovolin30R的紗布外敷,并于每日下午5~6點(diǎn)鐘腹部皮下注射Novolin30R4~6U/(kg·d)。根據(jù)上午8時(shí)血糖,每3d調(diào)整胰島素用量,使血糖控制在正常范圍內(nèi)。各組大鼠各時(shí)相點(diǎn)血糖值見表1。1.3大鼠心肌組織病理學(xué)檢查(1)創(chuàng)面愈合率:于傷后7、11、15、21d將大體觀察攝取的創(chuàng)面照片輸入計(jì)算機(jī),經(jīng)用LeicaOwin圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析,按以下公式計(jì)算創(chuàng)面愈合率:創(chuàng)面愈合率=[(原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積]×100%。(2)病理組織學(xué)檢查:于傷后3、7、11、15、21d取大鼠背部創(chuàng)面組織。標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋切片,HE染色,行組織學(xué)觀察。(3)β1整合素和角蛋白19(K19)的表達(dá):于傷后3、7、11、15、21d取大鼠背部創(chuàng)面組織,采用免疫組化SP法染色,胞膜呈棕黃色者為β1陽(yáng)性細(xì)胞,胞漿呈棕黃色者為K19陽(yáng)性細(xì)胞。每個(gè)標(biāo)本陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的計(jì)數(shù)方法為:任選20個(gè)400倍視野拍照,每個(gè)視野觀察100個(gè)細(xì)胞,記錄陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)并計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率。1.4數(shù)據(jù)應(yīng)表示為平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差采用SPSS13.0軟件分析,組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1引發(fā)循環(huán):創(chuàng)愈合率22.325.5%,比b組增加,c組創(chuàng)傷率2.5%,0.5%,2.5%;b組患兒宮腔粘連率為5.5%,2.5%,2.5%;c組創(chuàng)傷率2.5%,2.5%,2.5%;c組創(chuàng)傷率2.54.54.54.54.54.54.54.5%;c組創(chuàng)4.5%,3.4.5.4.5%,3.4.5.54.54.54.54.54.54.54.54.54.54.54.54.54.54.54.54.54.54.54.54.54.54.4.4.4.4.4.4.4.4.4.44.44.44.44.44.44.44.44.44.44.44.44.44.44.44.44.44.44.44.44.44.455555555555555555555555555555555555555555555.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.E組創(chuàng)面愈合率在傷后7d較其余各組大鼠開始增加,為[(25.33±2.32)%,(P<0.05)];C、D組創(chuàng)面愈合率較B組增加分別為[(16.68±1.95)%,(18.29±1.70))%,(P<0.05)];A、C、D組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。2.2各組真皮層炎性細(xì)胞的變化燙傷后第3天見各組創(chuàng)面膠原纖維腫脹玻璃樣變性融合壞死,部分毛囊及皮脂腺崩解。B組真皮下組織內(nèi)見少數(shù)炎性細(xì)胞,A、C、D組真皮下有較多的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),E組真皮下見大量的炎性細(xì)胞并于真皮層底部見少量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。傷后第7天各組炎性細(xì)胞均較前明顯曾加,A、C、D組見創(chuàng)面真層深層可見少量新生肉芽組織,E組可見較多的肉芽組織及少數(shù)毛囊部位皮島形成。傷后11到15天,除B組真皮層炎性細(xì)胞大量增加外其余各組均有不同程度的減少,并且皮島逐漸增多,表皮開始增厚。以E組尤為明顯;A組毛細(xì)血管較7天前增加并出現(xiàn)大量成纖維細(xì)胞和少許膠原纖維;B組毛細(xì)血管仍較多,出現(xiàn)較多的膠原纖維和中等量的皮島;C、D組見較多的纖維細(xì)胞和皮島;E組成纖維細(xì)胞和膠原纖維多于其他組,排列有序,皮島大量出現(xiàn)。傷后第21天A組上皮組織大部分形成,表皮細(xì)胞層數(shù)少且排列較紊亂,新生膠原排列較紊亂,真皮全層仍可見較多的炎性細(xì)胞;B組有多量的皮島出現(xiàn),上皮組織部分形成,細(xì)胞多為單層,真皮全層仍可見大量炎性細(xì)胞和肉芽組織。C、D組大部分創(chuàng)面見復(fù)層上皮,上皮下見較少炎性細(xì)胞,新生膠原較多。E組創(chuàng)面基本上皮化,表皮細(xì)胞多為復(fù)層分化良好,新生膠原排列整齊。2.3表3顯示了各組大鼠傷口1的完整樣本E組創(chuàng)面表皮干細(xì)胞β1整合素表達(dá)傷后7d開始增加,與其余組大鼠比較差異有意義(P<0.05);其余各組間無(wú)差異性。2.4表4顯示了各組大鼠傷口k19的結(jié)果E組創(chuàng)面表皮干細(xì)胞K19表達(dá)傷后7d開始增加,與其余組大鼠比較差異有意義(P<0.05);其余各組間無(wú)差異性。3皮膚長(zhǎng)期給藥對(duì)預(yù)防宮腔粘連形成和愈合的作用創(chuàng)面愈合是一個(gè)復(fù)雜有序的動(dòng)態(tài)變化過程,創(chuàng)面愈合的基本病理生理過程大致分為創(chuàng)傷后早期炎癥反應(yīng)、肉芽組織增生和瘢痕形成三個(gè)階段。神經(jīng)生長(zhǎng)因子(Nervegrowthfactor,NGF)是生長(zhǎng)因子家族最早發(fā)現(xiàn)的成員之一,由RitaLevi-Montgalcini在1953年首先發(fā)現(xiàn),是一類具有維護(hù)交感神經(jīng)及感覺神經(jīng)的生長(zhǎng)、發(fā)育、功能以及促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)等作用的多功能細(xì)胞因子。特別是NGF可以起到加速創(chuàng)區(qū)愈合的效果,促進(jìn)再上皮化進(jìn)程。然而在臨床及一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明NGF參與了糖尿病神經(jīng)病變的發(fā)病過程,在糖尿病患者皮膚的表達(dá)水平較正常人群低,并初步顯示了糖尿病神經(jīng)病變的預(yù)防和治療作用。同時(shí)研究也發(fā)現(xiàn)NGF在燙傷創(chuàng)面中具有刺激細(xì)胞的有絲分裂而有利于細(xì)胞的增殖,起到加速創(chuàng)面愈合的作用。但是其作用機(jī)制目前尚不十分清楚。胰島素(insulin)是由胰島細(xì)胞分泌的酸性蛋白激素,由A、B兩條鏈組成通過二硫鍵將兩鏈共價(jià)相連,分子量為5808000。作為一種多功能的蛋白質(zhì),激素除調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝作用外,還具有一定的抗炎作用及促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)增殖分化等作用。近年來(lái)胰島素的促生長(zhǎng)作用已引起越來(lái)越多的重視,局部使用胰島素已被證實(shí)能夠促進(jìn)創(chuàng)面愈合。而在糖尿病創(chuàng)面的治療中,不僅要控制血糖,促進(jìn)創(chuàng)面上皮化對(duì)創(chuàng)面的愈合尤為重要。表皮干細(xì)胞(epidermalstemcells,ESCs)作為皮膚組織的特異性干細(xì)胞,是皮膚組織發(fā)生、創(chuàng)面修復(fù)及改建的關(guān)鍵。ESCs不僅是維持著皮膚新陳代謝的功能,而且與創(chuàng)面修復(fù)緊密相關(guān)。皮膚受創(chuàng)傷時(shí),ESCs數(shù)量及分布發(fā)生變化,能主動(dòng)地參與創(chuàng)面的修復(fù),促進(jìn)創(chuàng)面再上皮化。目前常用B1整合素和角蛋白19(keratin19,K19)同時(shí)染色陽(yáng)性來(lái)鑒別ESCs。研究表明糖尿病大鼠皮膚組織中ESCs的數(shù)量少和活性低是導(dǎo)致DM創(chuàng)面愈合延遲的重要原因之一。創(chuàng)面中ESCs數(shù)量的增加對(duì)促進(jìn)創(chuàng)面上皮化有極其重要的作用。在本實(shí)驗(yàn)中觀察到,在糖尿病大鼠深I(lǐng)I度燙傷創(chuàng)面局部單用胰島素或神經(jīng)生長(zhǎng)因子,從第7天開始均可使表皮中的ESCs表達(dá)增加,從而導(dǎo)致創(chuàng)面愈合率較未用藥組升高。而兩者聯(lián)合使用后表皮中的ESCs顯著高表達(dá),創(chuàng)面中皮島出現(xiàn)的早而且數(shù)量多,創(chuàng)面愈合率亦明顯升高。其可能的機(jī)制是:局部應(yīng)用胰島素可以促進(jìn)NGF的分泌,而且創(chuàng)面局部外源性補(bǔ)充NGF后彌補(bǔ)了糖尿病大鼠皮膚中內(nèi)源性NGF不足的缺陷,從而趨化各類免疫細(xì)胞,使受傷組織中免疫細(xì)胞明顯增多,而且能夠?qū)Ρ悔吇母黝惷庖呒?xì)胞致敏。通過細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子的自分泌和旁分泌機(jī)制,使被致敏的各類免疫細(xì)胞合成、分泌、釋放各類生長(zhǎng)因子,起到正性調(diào)節(jié)作用,使創(chuàng)面組織中NGF、EGF、NGF受體、EGF受體等水平升高,而EGF及FGF等生長(zhǎng)因子具有顯著的促創(chuàng)面愈合的作用,同時(shí)他們可能具有誘導(dǎo)ESCs的發(fā)生頻率與數(shù)量增加。在創(chuàng)面殘存的皮脂腺和毛囊中ESCs接到了創(chuàng)傷修復(fù)的指令,啟動(dòng)毛囊隆突內(nèi)的毛囊干細(xì)胞-表皮通路,參與修復(fù)。在本實(shí)驗(yàn)中聯(lián)合用藥組創(chuàng)面迅速縮小并有大量的皮島出現(xiàn),其機(jī)制可能就是創(chuàng)面殘存的皮脂腺和毛囊中ESCs迅速增值分化并從基底層、干細(xì)胞島周圍多平面、多角度同時(shí)展開修復(fù),最終創(chuàng)面上