天然鎖陽與栽培鎖陽對(duì)小鼠老化相關(guān)酶及果蠅壽命的影響

天然鎖陽與栽培鎖陽對(duì)小鼠老化相關(guān)酶及果蠅壽命的影響

鎖陽是鎖定科的根生植物鎖陽科。蒙古語名“鈾高度重視”。它具有“共同的一天”、消食和健身的作用。用于治療頭痛、陽痿、股關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)、早泄和其他疾病。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道鎖陽主要化學(xué)成分有鞣質(zhì)、氨基酸及23種微量元素,具有抗衰老作用。近年來由于過度采挖,使天然鎖陽資源遭到嚴(yán)重破壞。有關(guān)專家為此進(jìn)行了人工栽培鎖陽的試驗(yàn),為研究人工栽培鎖陽的可行性,我們進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)。1材料和機(jī)器1.1材料天然鎖陽:采自內(nèi)蒙古伊克昭盟杭錦旗;栽培鎖陽:采自內(nèi)蒙古伊克昭盟東勝市曼賴鄉(xiāng);人參:市售。1.2動(dòng)物昆明種小鼠(〈京動(dòng)字〉)(第8806M035號(hào))由內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.3a、過氧化氫酶活性及cat測(cè)定SOD測(cè)定試劑盒(批號(hào):20000327)、MDA測(cè)定試劑盒(批號(hào):20000308)、過氧化氫酶(CAT)測(cè)定試劑盒(批號(hào):20000314)(南京建成生物工程研究所生產(chǎn));其它試劑為分析純。1.4tu-1221型的紫外分光光度計(jì)十萬分之一電子天平(METTLERAE240瑞士);百分之一電子動(dòng)物天平(METTLERPE6000瑞士);TU-1221型紫外分光光度計(jì)(北京);SC-15型恒溫水浴箱(上海天平儀器廠);離心機(jī)。2方法和結(jié)果2.1小鼠血清中mda、cat活力測(cè)定2.1.1分組及給藥方法:取小鼠60只(20±2g)雌雄各半,隨機(jī)分為6組:陽性對(duì)照組(0.1g/20g);天然鎖陽高劑量組(0.5g/20g);天然鎖陽低劑量組(0.25g/20g);栽培鎖陽高劑量組(0.5g/20g);栽培鎖陽低劑量組(0.25g/20g);空白對(duì)照組(同體積水)。以上各組連續(xù)給藥5天,于第5天給藥40分鐘后,分別進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。2.1.2小鼠血清中SOD的測(cè)定:小鼠眼眶取血,離心10分鐘(2000轉(zhuǎn)/min)。取血清5μl,加SOD試劑,充分混勻,37℃恒溫水浴40分鐘,加入2ml顯色劑,用紫外分光光度計(jì)在540nm處測(cè)其吸光度,根據(jù)公式:SOD活力(NU/ml)=對(duì)照管吸光度?測(cè)定管吸光度對(duì)照管吸光度÷50％×(ΝU/ml)=對(duì)照管吸光度-測(cè)定管吸光度對(duì)照管吸光度÷50％×稀釋倍數(shù)算出血清SOD活力,并且將結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)。結(jié)果見表1。由實(shí)驗(yàn)可看出給藥組小鼠血清SOD活力與空白組有顯著性差異,天然鎖陽與栽培鎖陽有提高小鼠血清SOD活力,促進(jìn)小鼠清除超氧陰離子自由基(O-2)的作用。而天然鎖陽與栽培鎖陽在此方面的作用無顯著性差異。2.1.3小鼠血清中丙二醛含量的測(cè)定:小鼠眼眶取血,2000轉(zhuǎn)/min離心10分鐘,得到血清。取100μl血清與4mlMDA試劑加入試管,充分混勻,在95℃水浴40分鐘,3500~4000轉(zhuǎn)/min離心10分鐘,在紫外分光光度計(jì)532nm處測(cè)定吸光度,同法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照管、空白對(duì)照管吸光度后,按公式計(jì)算結(jié)果:丙二醛含量(nmol/ml)=測(cè)定管吸光度?測(cè)定空白管吸光度標(biāo)準(zhǔn)管吸光度?標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度×10(nmol/ml)=測(cè)定管吸光度-測(cè)定空白管吸光度標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度×10nmol/ml×樣品測(cè)定前稀釋倍數(shù),將結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn),結(jié)果見表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:給藥組和空白組小鼠血清中MDA含量有顯著性差異。天然和栽培鎖陽能降低小鼠血清中MDA含量,天然和栽培鎖陽對(duì)小鼠血清中MDA的影響無顯著性差異。2.1.4小鼠血紅細(xì)胞中CAT活力測(cè)定:小鼠眼眶取血,加雙蒸水配成1∶50的溶血液。取溶血液20μl,將預(yù)溫至25℃的CAT試劑3ml(底物溶液吸收值在0.5~0.55)加入比色皿中,紫外分光光度計(jì)240nm處測(cè)定吸光度,記下OD1值,1分鐘時(shí)立即再測(cè)1次吸光度,記下OD2值、計(jì)算公式:CAT活力=logOD1[注1]OD2×2.303[注2]60[注3]×A[注4]÷B[注5]=logΟD1[注1]ΟD2×2.303[注2]60[注3]×A[注4]÷B[注5][注1]OD1:240nm處零時(shí)吸光度,OD2:240nm處1分鐘時(shí)吸光度。[注2]2.303從自然對(duì)數(shù)換算成常用對(duì)數(shù)log時(shí)必須乘以2.303。[注3]60秒。[注4]A為血紅蛋白稀釋倍數(shù)。[注5]B為每ml血紅蛋白克數(shù)。*Hb測(cè)定:取Hb稀釋液5ml(配制方法見文獻(xiàn)5)加全血20μl,混勻,在540nm處測(cè)定吸收值,血紅蛋白g/L=吸光度×367.7將結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn),結(jié)果見表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:給藥組對(duì)小鼠血紅蛋白中過氧化氫酶活力無明顯作用,與空白組相比無顯著性差異。天然鎖陽和栽培鎖陽對(duì)小鼠血紅蛋白中過氧化氫酶活力影響無顯著性差異。2.2培養(yǎng)基配方對(duì)果蠅生長(zhǎng)和免疫的影響新孵化的果蠅80只,雌雄各半,分別置培養(yǎng)管中培養(yǎng)。培養(yǎng)方法參照(4)略作修改,培養(yǎng)溫度為25℃,濕度60%~70%,基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方為:玉米粉8.4%,酵母粉0.84%,蔗糖6.2%,瓊脂粉0.625,苯甲酸鈉0.1%,受試藥物按比例加入培養(yǎng)基,每日觀察果蠅生長(zhǎng)情況,定期更換培養(yǎng)基,記錄果蠅死亡日期并進(jìn)行t檢驗(yàn)。試驗(yàn)表明:鎖陽可延長(zhǎng)果蠅生存時(shí)間,且栽培鎖陽與天然鎖陽對(duì)果蠅壽命的作用無差異。3鎖陽清除羥自由基的作用衰老現(xiàn)象是一個(gè)復(fù)雜的生物代謝過程。從分子生物學(xué)水平來看,英國(guó)人Harman提出了自由基學(xué)說。自由基為細(xì)胞代謝過程中連續(xù)不斷產(chǎn)生的具有高度活性的物質(zhì),它對(duì)機(jī)體具有損害作用。自由基及其誘導(dǎo)的氧化反應(yīng)會(huì)引起膜損傷和交聯(lián)鍵的形成,其結(jié)果降低了酶的活性,使核酸代謝發(fā)生誤差,溶酶體內(nèi)衰老色素堆積,致使細(xì)胞老化,從而引起人體衰老。通過實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)天然鎖陽和栽培鎖陽能夠提高SOD活性、清除自由基,降低MDA含量、提高LPO酶活性,起到抗衰老的作用。SOD是體內(nèi)重要的含Zn、Fe、Mn的蛋白質(zhì),SOD的活力增強(qiáng),能夠增強(qiáng)機(jī)體對(duì)自由基的防御能力,延緩了生物的老化。實(shí)驗(yàn)表明,天然鎖陽和栽培鎖陽都能顯著提高小鼠血清中SOD的活力,兩者相比無顯著性差異。MDA是機(jī)體脂質(zhì)過氧化作用重要的代謝產(chǎn)物,它能引起細(xì)胞代謝或功能障礙引起細(xì)胞損傷。MDA的高低間接的反應(yīng)了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的損傷程度。天然鎖陽和栽培鎖陽能夠明顯減少小鼠血清中MDA的含量,即減少了細(xì)胞的損傷程度。CAT是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶,能夠分解氫氧自由基(OH)。通過實(shí)驗(yàn),我們對(duì)小鼠血紅細(xì)胞中過氧化氫酶(CAT)的活力進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn),天然鎖陽和栽培鎖陽對(duì)CAT的活力無明顯影響,但據(jù)文獻(xiàn)報(bào)