GB 4789.12-2016 肉毒梭菌及其毒素檢驗(yàn) 好

1食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗(yàn)NationalfoodsafetystandardFoodmicrobiologicalexamination:ExaminationofClostridiumbotulinumandbotulinustoxin

GB4789.12-2016第六章：致病性芽孢桿菌檢驗(yàn)及原理2016-12-23發(fā)布

2017-06-23實(shí)施第一部分：

概述1菌體形態(tài)學(xué)

專性厭氧性G+周身鞭毛網(wǎng)球拍樣梭狀芽孢大桿菌.2菌體抵抗力

繁殖型菌體：一般，45℃以上都受到抑制，100℃經(jīng)10min即可殺死

芽胞型菌體：超強(qiáng)，煮沸后要6h，120℃經(jīng)4－5min才能殺死。3肉毒梭菌分布很廣－－世界各地、各處都有。

Purecultureofthesporeformingbacterium

Clostridiumbotulinum[1,250x].

34致病性

有食物中毒和感染中毒兩類

潛伏期：2h-12-36h-數(shù)日食物中毒：食物中毒的一般癥狀：頭痛、頭昏、腹痛、惡心、嘔吐等；后出現(xiàn)肉毒梭菌毒素中毒的特征性癥狀－－神經(jīng)麻痹，先眼部、頭頸部－全身骨骼肌麻痹－－似睡狀，不能抬頭、除視覺外，其他感覺正常。呼吸肌麻痹死亡。

感染中毒：外傷、注射吸毒等，感染菌體，在傷口適宜條件下菌體繁殖產(chǎn)毒－－中毒。45肉毒毒素能產(chǎn)生“劇毒神經(jīng)麻痹肉毒梭菌外毒素”（1）毒素分型和媒介按抗原特異性分7（8）個(gè)型－－A、B、C（Cα和Cβ）、

D、E、F和G。各型肉毒毒素所致疾病及其媒介5（2）毒素毒性是目前所知的最強(qiáng)烈的細(xì)菌外毒素，有A-F7個(gè)型

A型毒素毒性最強(qiáng)(人最敏感),是目前已知的化學(xué)毒物及細(xì)菌毒素中毒性最強(qiáng)的一種：其毒性比氰化鉀強(qiáng)１萬倍，比響尾蛇毒素(crotactin)約強(qiáng)10萬倍，對(duì)人的最小致死量為１０－７g（0.1－lPg）；1g此精制毒素可殺死體重20g的小鼠２×１０１０只。戰(zhàn)爭(zhēng)狂人已將其作為細(xì)菌戰(zhàn)劑，必須加強(qiáng)戒備。我國有A型、C型、E型和D型

6（3）中毒機(jī)理

劇毒肉毒毒素肉毒素進(jìn)入血液循環(huán)后，選擇性地作用于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)與交感神經(jīng)的神經(jīng)末梢，抑制神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)乙酰膽堿的釋放，因而引起肌肉運(yùn)動(dòng)障礙，發(fā)生軟癱。醫(yī)學(xué)上利用麻痹肉毒素美容、治肌肉痙攣性收縮病癥。www.cho-obgy.co.kr

7很強(qiáng)：

耐蛋白酶：不被胃液或消化酶所破壞，胰蛋白酶可活化毒素耐酸：在pH3－6范圍內(nèi)毒性不減弱對(duì)堿敏感：在pH8.5（1％NaOH）以上可破壞毒性對(duì)熱：100℃經(jīng)10—20min常被破壞。保存：毒素在干燥密封和陰暗的條件下，可保存多年。類毒素：用0.3%-0.5%甲醛處理后消除毒性并保持抗原性的外毒素即變?yōu)轭惗舅?可用于預(yù)防相應(yīng)外毒素中毒。（4）肉毒梭菌毒素抵抗力8（5）肉毒梭菌產(chǎn)生肉毒毒素的條件食品自然產(chǎn)毒條件：污染的、在厭氧條件下制造或保存的食品，發(fā)酵或腐爛變質(zhì)的食品，具營(yíng)養(yǎng)、溫度25－30℃、pH6－8、厭氧、水分活度≧0.85的條件，即可產(chǎn)生毒素。

9（6）罐頭等包裝食品有效控制肉毒毒素產(chǎn)生的措施能夠抑制A、B、E及F型肉毒梭菌的芽孢出芽和產(chǎn)生毒素的條件：高壓120℃5min以上（高壓滅菌）；pH≦4.6（酸化食品）；水分活度≦0.85（干制品）；鹽分含量≥20%(腌漬食品)；巴氏殺菌＋冷藏（蟹肉及魚糜制品）；干燥＋冷藏；上述多種方式聯(lián)合。106培養(yǎng)

肉毒梭菌為專性厭氧菌最適生長(zhǎng)溫度：28－37℃生長(zhǎng)良好

最適產(chǎn)毒素溫度為25—30℃最適pH為6-8(在8℃以上，pH4以上都可形成毒素)在普通固體培養(yǎng)基上，形成R型菌落，常擴(kuò)展成菌苔。

desk/product/images/1000000000041.jpg117肉毒梭菌的生化特性

分解葡萄糖、麥芽糖及果糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣明膠液化＋緩慢液化凝固血清(37℃，15d)，使牛乳消化，硫化氫＋，硝酸鹽還原－。＋12第二部分國標(biāo)13前言本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T4789.12—2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗(yàn)》。本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T4789.12—2003相比,主要變化如下:——標(biāo)準(zhǔn)名稱修改為“食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗(yàn)”;——增加了PCR鑒定方法;——增加了結(jié)果與報(bào)告;——增加了附錄A;——修改了設(shè)備和材料;——修改了培養(yǎng)基和試劑;——修改了檢驗(yàn)程序;——規(guī)范了樣品制備過程;——修改了操作步驟中增菌和分離培養(yǎng)部分試驗(yàn)方法。141范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)及肉毒毒素(botulinumtoxin)的檢驗(yàn)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中肉毒梭菌及肉毒毒素的檢驗(yàn)。

2設(shè)備和材料2.19PCR反應(yīng)管。2.20無菌注射器:1.0mL。2.21小鼠:15g~20g,每一批次試驗(yàn)應(yīng)使用同一品系的KM或ICR小鼠153培養(yǎng)基和試劑3.1庖肉培養(yǎng)基：:見A.1。

－－增菌用，含牛肉碎塊、葡萄糖和淀粉等的液體或半流動(dòng)培養(yǎng)基－－A、B型肉毒梭菌生長(zhǎng)旺盛，而且表面渾濁，產(chǎn)大量氣體，底有粉狀或顆粒狀沉淀，并能消化肉塊，變黑有臭味。3.2胰蛋白酶胰蛋白胨葡萄糖酵母膏肉湯(TPGYT):見A.2

肉毒毒素培養(yǎng)基3.3卵黃瓊脂培養(yǎng)基：:見A.3

鑒別培養(yǎng)基:含葡萄糖和卵黃:本菌含脂肪酶，分解脂肪，產(chǎn)生甘油，使菌落及其周圍表面覆蓋著特有的彩虹樣(或珍珠層樣)薄層163.4明膠磷酸鹽緩沖液：見A.4

－－處理稀釋樣品用，明膠起穩(wěn)定毒素作用。3.5革蘭氏染色液:見A.5。G+3.610%胰蛋白酶溶液:見A.6：

肉毒毒素耐受3.10肉毒分型抗毒診斷血清：分型3.11無水乙醇和95%乙醇。3.1210mg/mL溶菌酶溶液。3.1310mg/mL蛋白酶K溶液。3.143mol/L乙酸鈉溶液(pH5.2)。3.15TE緩沖液。3.16~3.25：PCR材料174檢驗(yàn)程序肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗(yàn)程序見圖1腹腔注射小鼠增菌培養(yǎng)G+***

肉毒梭菌檢驗(yàn)有芽胞大桿菌毒素基因檢測(cè)*

TPGYT:胰蛋白酶胰蛋白胨葡萄糖酵母膏肉湯*186、說明

1）毒素檢測(cè)：檢測(cè)的目的：就是以檢出肉毒毒素為標(biāo)準(zhǔn)（可進(jìn)一步定型）有特殊需要時(shí)再分離鑒定菌。（1）肉毒毒素檢出試驗(yàn)（有無）：小白鼠腹腔注射法為標(biāo)準(zhǔn)方法。（2）確證試驗(yàn)（定性）（3）毒力測(cè)定（強(qiáng)弱，選做）（4）毒素定型和菌體型試驗(yàn)（選做）19（1）肉毒毒素檢出試驗(yàn)：小白鼠腹腔注射法為標(biāo)準(zhǔn)方法。

0.5mL樣品上清液和胰酶激活處理液/只－各注射小白鼠3只。試驗(yàn)結(jié)果：

0.5h內(nèi)猝死：稀釋重做；

6h內(nèi)死亡：典型癥狀：豎毛、四肢癱軟，呼吸困難，呼吸早呈箱式，腰部凹陷，宛若蜂腰，最終死于呼吸麻痹。初步確定+

24h以后發(fā)病、死亡：樣品濃縮、重做。20

（2）確證試驗(yàn)：取致死樣上清液分成三份

上清液＋等量多型抗毒素血清－混勻－37℃，30min－－0.5mL接種小鼠上清液＋等量明膠磷酸鹽緩沖液－混勻－煮沸10－20min－－0.5mL接種小鼠

上清液+等量明膠磷酸鹽緩沖液-混勻－－0.5mL接種小鼠--死亡

上述結(jié)果：可判定檢樣中存在的毒素是肉毒毒素必要時(shí)要進(jìn)行毒力測(cè)定及定型試驗(yàn)。

存活21

（3）毒力測(cè)定（選做）

稀釋判定的上清液：50倍－－注射小白鼠各兩只/0.5mL/只500倍－－注射小白鼠各兩只/0.5mL/只5000倍－－注射小白鼠各兩只/0.5mL/只例：計(jì)算檢樣所注射5000倍稀釋液的動(dòng)物全部存活，500倍的動(dòng)物全部死亡，則可判定檢樣上清液所含毒素的毒力為1000MLD／mL－10000MLD／mL。

MLD：最小致死量或最小致死濃度(minimumlethaldoseMLC)系指藥物/毒物在最低劑量組的一群實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中引起個(gè)別動(dòng)物死亡的劑量和濃度

觀察4d--死亡存活情況判定毒力22（4）定型試驗(yàn)（選做）

檢樣上清液＋等量A抗血清檢樣上清液＋等量B抗血清檢樣上清液＋等量C抗血清檢樣上清液＋等量D抗血清檢樣上清液＋等量E抗血清檢樣上清液＋等量F抗血清檢樣上清液＋等量G抗血清檢樣上清液+明膠磷酸鹽緩沖液混勻，37℃作用30min，各注射小鼠兩只，0.5mL/只，觀察4d,觀察結(jié)果。能保護(hù)動(dòng)物免于發(fā)病、死亡的診斷血清型即為檢樣所含肉毒毒素的型別。檢樣上清液:用明膠磷酸鹽緩沖液適當(dāng)稀釋檢樣的離心上清液23

注解①未經(jīng)胰酶激活處理的檢樣的毒素檢出試驗(yàn)或確證試驗(yàn)若為陽性結(jié)果，則胰酶激活處理液可省略毒力測(cè)定及定型試驗(yàn)；②為爭(zhēng)取時(shí)間盡快得出結(jié)果，毒素檢測(cè)的4項(xiàng)試驗(yàn)也可同時(shí)進(jìn)行；③根據(jù)具體條件和可能性，定型試驗(yàn)可酌情先省略C、D、F及G型；④進(jìn)行確證及定型等中和試驗(yàn)時(shí)，檢樣的稀釋應(yīng)參照所用肉毒診斷血清的效價(jià)。⑤試驗(yàn)動(dòng)物的觀察可按陽性結(jié)果的出現(xiàn)隨時(shí)結(jié)束，以縮短觀察時(shí)間；唯有出現(xiàn)陰性結(jié)果時(shí)，應(yīng)保留充分的觀察時(shí)間。/topic/mus-musculus242）肉毒梭菌檢出(增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)試驗(yàn))

取庖肉培養(yǎng)基三支，煮沸10min一15min，做如下處理：

a)第一支：急速冷卻，接種檢樣均質(zhì)液1ml一2ml；目的：檢測(cè)繁殖菌體；b)第二支：冷卻至60℃，接種檢樣，繼續(xù)于60℃保溫10min，急速冷卻目的：芽孢發(fā)芽

c)第三支：接種檢樣，繼續(xù)煮沸加熱10min，急速冷卻。目的：抑制其他雜菌25肉毒梭菌在庖肉培養(yǎng)基中生長(zhǎng)：

培養(yǎng)基中含有葡萄糖和碎肉塊等，A、B型肉毒梭菌生長(zhǎng)旺盛而且產(chǎn)大量氣體，表面渾濁，底有粉狀或顆粒狀沉淀，消化肉塊使其變黑有臭味。以上接種物于30℃厭氧培養(yǎng)5d，若無生長(zhǎng)，可再培養(yǎng)10d。培養(yǎng)到期，若有生長(zhǎng)，取培養(yǎng)液離心，以其上清液進(jìn)行毒素檢測(cè)試驗(yàn)，方法同前，陽性結(jié)果證明檢樣中有肉毒梭菌存在。263）分離培養(yǎng)－菌體鑒定，需要時(shí)做卵黃瓊脂平板：取毒素檢測(cè)陽性的前述增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)物接種卵黃瓊脂平板，35℃厭氧培養(yǎng)48h。肉毒梭菌菌落及周圍培養(yǎng)基表面覆蓋著特有的虹彩樣(或珍珠層樣)薄層，是鑒別該菌較好的方法，但G型菌無此現(xiàn)象。是因?yàn)槿舛舅缶久?，分解脂肪，產(chǎn)生甘油，使菌落及其周圍表面覆蓋著特有的彩虹樣(或珍珠層樣)薄層。毒素測(cè)定同前庖肉培養(yǎng)基庖肉培養(yǎng)基(3mL--10mL)各一支，分別在30及37℃下厭氧培養(yǎng)7d，按前述進(jìn)行肉毒毒素檢測(cè)。

www.ahc-net.at/0001/antibiotika_monitor/4_00/4_00_3.htm27復(fù)習(xí)題