GBT 4789.1516 -2016 霉菌和酵母計數(shù)和檢驗

GBT4789.15，16–2016，2016

霉菌和酵母計數(shù)和檢驗

第一部分：產(chǎn)毒真菌概述GBT4789.15–2016

第二部分：霉菌和酵母計數(shù)GBT4789.16–2016

第三部分：常見產(chǎn)毒霉菌的鑒定

第一部分：產(chǎn)毒真菌概述本節(jié)主要內(nèi)容講述可以產(chǎn)生能引起食物中毒毒素的霉菌概況：1、真菌毒素中毒癥的概念2、主要產(chǎn)毒真菌3、主要真菌毒素4、真菌產(chǎn)毒條件5、真菌毒素的分類6、致癌性真菌毒素7、真菌性食物中毒

本節(jié)要點：產(chǎn)毒霉菌大概有多少種？主要歸哪幾個屬？主要是曲霉屬、青霉屬和鐮刀霉屬及少數(shù)不完全菌類的某些種屬內(nèi)和屬間的鑒別要點是什么？

已發(fā)現(xiàn)產(chǎn)毒霉菌毒素100～300多種

1、真菌毒素中毒癥的概念

真菌毒素：真菌產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物稱真菌毒素。

真菌毒素中毒：由真菌毒素引起的食物中毒稱～～。

/Extension/Pathology/CropDiseases/Corn/corn3.html

2、主要產(chǎn)毒真菌真菌種類：幾十萬種

產(chǎn)毒真菌：200種左右主要產(chǎn)毒真菌：

曲霉菌屬：黃～、鍺～、雜色～、寄生～、構(gòu)巢～和煙～等。

青霉菌屬：島～、桔～、黃綠～、展開～。鐮刀菌屬：禾谷～、三線～、串珠～等。

一種真菌可以產(chǎn)生多種毒素一種毒素可以由多種真菌產(chǎn)生

已發(fā)現(xiàn)的真菌毒素有100～300多種主要的有一下幾種：

1）曲霉菌屬毒素：

黃曲霉毒素、雜色曲霉菌毒素、鍺曲霉菌毒素等。

2）青霉菌屬毒素：黃綠青霉素、桔青霉素、島青霉素、展青霉素等。

3）鐮刀菌素：單端孢霉烯族化合物、玉米赤霉烯酮、丁烯酸內(nèi)酯等。3、主要真菌毒素4、真菌生長和產(chǎn)毒條件

1）真菌易生長繁殖和產(chǎn)毒的條件：

營養(yǎng)豐富、含糖、溫暖、潮濕等環(huán)境下真菌易于生長繁殖。

2）各種食品出現(xiàn)的真菌以一定的菌種為主：

如：大米、面粉、玉米、花生和發(fā)酵食品中以曲霉和青霉為主；

玉米和花生曲霉為主；小麥和玉米種鐮刀菌常見；大米中常見青霉菌。5、真菌毒素的分類

按毒素對器官的危害分：肝毒素、腎毒素、神經(jīng)毒、造血組織毒和光過敏性毒等。

肝毒素：肝細胞變性、硬化、壞死、癌變等。

如黃曲霉毒素、雜色曲霉菌屬毒素、鍺曲霉菌屬毒素、島青霉素等。

腎毒素：急性或慢性腎小球性腎炎。

如鍺曲霉毒素A、桔青霉等。

神經(jīng)毒：引起神經(jīng)組織變性－－相應(yīng)組織器官的功能障礙。

如黃綠青霉素、展青霉素和麥芽米曲霉素等。造血組織毒：造血器官病變壞死－－功能障礙。如：某些鐮刀菌毒素、葡萄穗霉毒素等。過敏性皮炎毒：皮膚感光過敏－－炎癥。如孢子素等。

反季節(jié)甘蔗警惕霉變中毒北方某城2002年起早春“禁售甘蔗導(dǎo)致甘蔗霉變的病原菌叫做“節(jié)菱孢霉菌”，這種霉菌可以分泌出耐熱的水溶性物質(zhì)3-硝基丙酸。3-硝基丙酸是一種親神經(jīng)毒性物質(zhì)，可以損害人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)以及泌尿系統(tǒng)。中毒嚴重者，即使能挽回生命，也往往會留下難以逆轉(zhuǎn)的后遺癥。

重度中毒潛伏期極短，多在10分鐘至1小時左右，患者在頻繁惡心、嘔吐、劇烈腹痛后很快出現(xiàn)陣發(fā)痙攣性抽搐，每次發(fā)作在1～2分鐘左右，發(fā)作時頭后仰、牙關(guān)緊閉、兩眼球偏向一側(cè)、四肢屈曲強直、反復(fù)發(fā)作，嚴重者常呈癲癇持續(xù)狀態(tài)。抽搐發(fā)作后多陷入昏迷，兩側(cè)瞳孔散大、眼球震顫、向上凝視。甚則在昏迷后出現(xiàn)狂躁、強迫體位或癱瘓，并出現(xiàn)肺水腫、血尿和黑便，最終多死于呼吸衰竭或癲癇持續(xù)狀態(tài)。及時搶救治愈者，可在一周后開始恢復(fù)，但恢復(fù)過程中常出現(xiàn)意識、運動及語言障礙，甚至遺留種種難以恢復(fù)的后遺癥，如遲發(fā)性肌張力障礙，不自主陣發(fā)扭曲，痙攣或手足徐動，更為嚴重者出現(xiàn)去大腦皮質(zhì)綜合征。18個病例轉(zhuǎn)歸情況：

10例隨訪6年，8例隨訪3～5年，2例分別于病后8個月及1年因身體衰竭和頻發(fā)痙攣性抽搐強直而死亡。余16例進行了智力測驗及致殘鑒定；智力正常4例，臨界水平4例，輕度智力低下5例，中度智力低下3倒．合并腦性癱瘓8例(強直性四肢癱4例．痙攣性雙癱2倒．單癱2例。語言障礙3例．癲痛4例。

張秋燕等6、致癌性真菌毒素目前已有14種真菌毒素被確認有致癌性。經(jīng)口致癌：黃曲霉毒素（B1、B2、G1、M1），雜色曲霉素、黃天精、島青霉毒素環(huán)氯素、皺褶青霉素等。經(jīng)皮下注射引起肉瘤：展青霉素和青霉酸等。與其他化學(xué)物質(zhì)協(xié)同作用引起試驗動物產(chǎn)生腫瘤：灰黃霉素和鍺曲霉毒素A。

黃曲霉毒素B1的致癌性最強。7、真菌性食物中毒

1）黃曲霉毒素中毒：常見的黃曲霉毒素有B1、B2、

G1、G2、M1、M2。黃曲霉毒素有B1毒性最大。毒素抵抗力：耐熱280℃以上，一般烹調(diào)方法不能消除其毒性，加堿能破壞一些毒性。

黃曲霉毒素毒性：比氰化鉀毒10～100倍，比砒霜毒

68倍，屬于特劇毒，尤以B1為最毒、含量最多、分布最廣?？芍略l(fā)性肝病和肝癌：

急性中毒：肝細胞變性、壞死、出血，幾天到10幾天死亡慢性中毒：肝病變、硬化、肝癌為主。

2）黃曲霉毒素污染的食物：

主要是糧油及其制品：花生、玉米、大豆、大米、棉籽等及其制品。

干果類食品：胡桃、杏仁等。

動物性食品：乳、肝、肉、魚蝦等及其制品。

國內(nèi)外都有關(guān)于黃曲霉毒素B1在飼料和食品中的含量標準標準

歐盟（2010）新規(guī)定：

玉米中黃曲霉毒素的最大殘留限量為：B1：≤5μg/kg（新）

(B1+G1+G2)：10μg/kg。我國衛(wèi)生部《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》新標準規(guī)定（2011、05、13）B1：堅果類、籽類、發(fā)酵食品、調(diào)味品、豆類及其發(fā)酵食品≤5μg/kg。嬰幼兒食品：≤0.5μg/kg。第二部分GB4789.15–2016

中華人民共和國國家標準GB4789.15—2016食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗霉菌和酵母計數(shù)NationalfoodsafetystandardFoodmicrobiologicalexamination:Enumerationofmouldsandyeasts2016-10-19發(fā)布2017-04-19實施前言本標準自實施之日起代替GB/T4789.15-2010《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗霉菌和酵母計數(shù)》。本標準與GB/T4789.15-2010相比，主要修改如下：——修改了設(shè)備和材料；——修改了培養(yǎng)基和試劑；——修改了檢驗程序和操作步驟；——修改了結(jié)果和報告；——修改了附錄A?！戒汢修改為第二法。本標準的附錄A為規(guī)范性附錄，附錄B為資料性附錄。本標準所代替標準的歷次版本發(fā)布情況為：——GB4789.15-1984、GB4789.15-1994、GB/T4789.15-2003、GB/T4789.15-2010。1范圍本標準規(guī)定了食品中霉菌和酵母菌（mouldsandyeasts）的計數(shù)方法。本標準適用于各類食品中霉菌和酵母菌的計數(shù)。

2設(shè)備和材料除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：2.1冰箱：2℃～5℃。2.2恒溫培養(yǎng)箱：28℃±1℃。3培養(yǎng)基和試劑3.1馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：見附錄A中A.1。3.2孟加拉紅培養(yǎng)基：見附錄A中A.2。3.1和3.2都含氯霉素抑制細菌－－選擇培養(yǎng)基,可選其一。霉菌在孟加拉紅瓊脂（虎紅瓊脂）上的典型特征/4images/3/4/11212.htmlw/4images/3/4/11212.html4檢驗程序

霉菌和酵母計數(shù)的檢驗程序：2~3×2個平板選10～150個菌落平皿兩個平板菌落數(shù)的平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)CFU/g、CFU/mL標準號標準名稱項目指標GB5420-2003硬質(zhì)干酪衛(wèi)生標準霉菌，CFU/g≤50GB7101-2003固體飲料衛(wèi)生標準霉菌，CFU/g≤50GB14884-2003蜜餞食品衛(wèi)生標準霉菌，CFU/g≤50GB14891.2-2003輻照花粉衛(wèi)生標準霉菌，CFU/g≤100GB14891.4-2003輻照香辛料衛(wèi)生標準霉菌，CFU/g≤100GB14963-2003蜂蜜衛(wèi)生標準霉菌，CFU/g≤200GB2759.2-2003碳酸飲料衛(wèi)生標準霉菌，CFU/g≤10GB10327-2003乳酸菌飲料衛(wèi)生標準霉菌，CFU/g≤30GB17324-2003瓶裝飲用水衛(wèi)生標準霉菌，CFU/g不得檢出GB17325-2003食品工業(yè)用濃縮果蔬汁（漿）衛(wèi)生標準霉菌，CFU/g≤20GB17399-2003膠姆糖衛(wèi)生標準霉菌，CFU/g≤20GB7099-2003糕點、面包衛(wèi)生標準霉菌，CFU/g≤100熱加工出廠≤100熱加工銷售≤150冷加工出廠≤150冷加工銷售幾類食品中霉菌菌落總數(shù)國家標準第二法霉菌直接鏡檢計數(shù)法霉菌直接鏡檢計數(shù)法－－適用于番茄醬罐頭、番茄汁B.1設(shè)備和材料B.1.1折光儀。B.1.2顯微鏡。B.1.3郝氏計測玻片：具有標準計測室的特制玻片。B.1.4蓋玻片。B.1.5測微器：具標準刻度的玻片原理：顯微鏡直接計數(shù)法是將一定稀釋的菌體或孢子懸液注入血球計數(shù)板的計數(shù)室中，于顯微鏡下直接計數(shù)的一種簡便、快速、直觀的方法。缺點是所測得的結(jié)果通常是死菌體和活菌體的總和。如有雜菌或雜質(zhì)，常不易分辨。易出現(xiàn)操作誤差。顯微計數(shù)法適用于各種含單細胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液，菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計數(shù)板。計數(shù)板計數(shù)板是一塊特制的厚型載玻片，載玻片上有4條槽而構(gòu)成3個平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個半邊上面各有一個計數(shù)區(qū)（圖），計數(shù)區(qū)的刻度有兩種：一種是計數(shù)區(qū)分為16個大方格（大方格用三線隔開），而每個大方格又分成25個小方格；另一種是一個計數(shù)區(qū)分成25個大方格（大方格之間用雙線分開），而每個大方格又分成16個小方格。但是不管計數(shù)區(qū)是哪一種構(gòu)造，它們都有一個共同特點，即計數(shù)區(qū)都由400個小方格組成。計數(shù)區(qū)邊長為1mm，則計數(shù)區(qū)的面積為lmm2

，每個小方格的面積為1/400mm2

。蓋上蓋玻片后，計數(shù)區(qū)的高度為0.1mm，所以每個計數(shù)區(qū)的體積為0.1mm3

，每個小方格的體積為1/4000mm3

。使用血球計數(shù)板計數(shù)時，先要測定每個小方格中微生物的數(shù)量，再換算成每毫升菌液（或每克樣品）中微生物細胞的數(shù)量。已知：1cm3體積=10mm×10mm×10mm=1000mm3因此：每ml菌懸液或每克物質(zhì)中含有細胞數(shù)=每個中格中細胞平均數(shù)（N）×16×104×菌液稀釋倍數(shù)（B）2操作步驟2.1檢樣的制備：取定量檢樣，加蒸餾水稀釋至折光指數(shù)為1.3447～1.3460（即濃度為7.9%～8.8%），備用。2.2顯微鏡標準視野的校正：將顯微鏡按放大率90～125倍調(diào)節(jié)標準視野，使其直徑為1.382mm。2.3涂片：洗凈郝氏計測玻片，將制好的標準液，用玻璃棒均勻的攤布于計測室，以備觀察。2.4觀測：將制好之載玻片放于顯微鏡標準視野下進行霉菌觀測，一般每一檢樣觀察50

個視野，同一檢樣應(yīng)由兩人進行觀察。2.5結(jié)果與計算：在標準視野下，發(fā)現(xiàn)有霉菌菌絲其長度超過標準視野（1.382mm)的1/6或三根菌絲總長度超過標準視野的1/6（即測微器的一格）時即為陽性（+），否則為陰性（-），按100個視野計，其中發(fā)現(xiàn)有霉菌菌絲體存在的視野數(shù)，即為霉菌的視野百分數(shù)。第三部分GBT4789.16–2016食品微生物學(xué)檢驗常見產(chǎn)毒霉菌的形態(tài)學(xué)鑒定MicrobiologicalexaminationoffoodhygieneMorphologicalidentificationofcommonmycotoxinproducingfungi4、培養(yǎng)基和試劑

乳酸—苯酚液：－－觀察菌體用，放到載波片上，再加菌體查氏培養(yǎng)基

－－青霉、曲霉及保存菌種用馬鈴薯—葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；

－－分離培養(yǎng)真菌用麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基

－－鑒定霉菌用無糖馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基

－－鑒定假絲酵母及霉菌用。以上述四種都是真菌分離培養(yǎng)和鑒定用培養(yǎng)基。5、檢驗程序

6、各種霉菌的形態(tài)特征各種真菌的鑒別請看附錄A/B/C/D。P128～138

鑒別真菌應(yīng)從那些方面進行？(曲霉的顏色、形態(tài))6.1曲霉菌屬詳見

附錄A.Bp128、130

主要菌種：黃曲霉、鍺曲霉、雜色曲霉、寄生曲霉、構(gòu)巢曲霉和煙曲霉等。鑒別要點：菌落正、反面顏色及其變化，孢子梗頂部形態(tài)、小梗層數(shù)、孢子形態(tài)顏色等。

產(chǎn)生毒素：黃曲霉毒素、雜色曲霉素和棕曲霉素等。/online/feature/deadspot/黃曲霉構(gòu)巢曲霉煙曲霉形態(tài)：分生孢子頭顏色：多樣營養(yǎng)菌絲體：有橫隔分生孢子梗：無隔，光滑或不平頂囊：多種形態(tài)，棍棒狀、橢圓形、半球形、球形小梗：一級或多級（第一層稱?；┓稚咦樱盒∏驙钭慵毎悍稚咦庸５幕?/p>

1）黃曲霉菌形態(tài)：（Aspergillusflavus），菌落色黃－綠－褐；小梗單、雙層

產(chǎn)生黃曲霉毒素，急性中毒死亡，慢性中毒引起肝癌2）寄生曲霉形態(tài)：(Aspergillusparasiticus)

能產(chǎn)生黃曲霉毒素。屬于黃曲霉群，與黃曲霉的區(qū)別是分生孢子梗更細，菌落表面呈深綠色，單層小梗。

3）雜色曲霉形態(tài)：

(Aspergillusversicolor)

菌落色雜，頂囊較小，形狀不一，雙層小梗;殼細胞近球形；產(chǎn)生雜色霉素，損害肝、腎，引起肝癌

4）構(gòu)巢曲霉形態(tài)

(Aspergillusnidulans)菌落呈白色－綠色－黃色，反面紫色；雙層小梗；菌落生長快，圓形、綠色、絨狀，當產(chǎn)生大量閉囊殼時，菌落呈黃褐色，背面紫紅色。產(chǎn)生雜色曲霉素。

/~rcavalie/em/sem_pics.html

殼細胞

SexualascosporesofAspergillusnidulans(S.Champe)殼細胞/old/secure/Anamorphic-f...

有性階段形成球形、暗紫紅色閉囊殼（子囊），直徑135～150μm，外包一層淡黃色、球形、厚壁的殼細胞。子囊孢子雙凸鏡形、紫紅色，5μm×4μm，上有雞冠狀突起。5）赭曲霉形態(tài)

(Aspergillusochraceus)

菌落褐色或淺黃色，背面黃紫褐色；雙層小梗；產(chǎn)赭曲霉素，損害腎、肝。

www.univ-brest.fr/esmisab/sitesc/Myco/fiches/aspeochra.html

6.2青霉菌屬（penicillium）詳見附錄Cp132

*產(chǎn)毒青霉：黃綠青霉、島青霉、桔青霉、展開青霉等。

*產(chǎn)生毒素及其危害：黃綠青霉素、桔青霉素、黃天精、環(huán)氯素和島青霉素等能損害腎、肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)。*霉變食物：引起大米霉變，產(chǎn)生“黃變米”;

還有通常生于柑桔類水果上、蔬菜、糧食、肉類、皮革和食物上也常有分布。

形態(tài)結(jié)構(gòu):

菌絲有橫隔，無足細胞；孢子穗呈掃帚狀；分生孢子、小梗、?；?、副枝、分生孢子梗；菌落呈無色、綠色、黃綠色、藍綠色等。/.../Phytopg/Fruit/ganjuQmb.htm

1）黃綠青霉（penicilliumcitreoviride）www.uoguelph.ca

www.sci.mus.mn.us6.3鐮刀菌屬詳見附錄Dp135

菌種：禾谷鐮刀菌、三線鐮刀菌、串珠鐮刀菌等菌體形態(tài)：菌絲較長，可達1cm