蒲公英水提取物降低糖尿病大鼠餐后血糖水平及其機制研究

蒲公英水提取物降低糖尿病大鼠餐后血糖水平及其機制研究

蒲公英，又名黃田和黃田，是薔薇科植物的一種干燥的草本植物。它具有清熱解毒、腫脹和結果期、益膽利尿、消乳液等功效，以及細菌、抗炎、干姜、腫瘤、血液抑制等。而蒲公英降血糖作用的研究報道較少,故本實驗考察蒲公英水提取物對鏈脲佐菌素(STZ)致糖尿病模型大鼠血糖水平的影響,并初步探討其作用機制。1材料表面1.1藥物、試劑和儀器蒲公英購自河北康派中藥材有限公司,經天津市百興醫(yī)藥批發(fā)有限責任公司呂芳鑒定為菊科植物蒲公英TaraxacummongolicumHand.-Mazz.的全草;阿卡波糖片,拜耳醫(yī)藥保健有限公司,批號117731;鹽酸二甲雙胍片,北京四環(huán)制藥有限公司,批號20110107;胰島素注射液,江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司,批號1106109。麥芽糖,海藍季科技發(fā)展有限公司;STZ(質量分數(shù)≥98%)、α-糖苷酶、4-硝基酚-α-D-吡喃葡糖苷(pNPG,質量分數(shù)≥98%)、3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one(PMP,質量分數(shù)≥98%)、D-(+)-半乳糖、Hepes、根皮苷(質量分數(shù)≥98%),Sigma公司;葡萄糖,天津市大茂化學試劑廠;DMEM培養(yǎng)基,Gibco公司;胎牛血清、非必需氨基酸,HyClone公司;青霉素-鏈霉素溶液,碧云天生物技術研究所;胰蛋白酶(1∶250),Biosharp公司;乙二胺四乙酸,天津博迪化工有限公司。Hanks’平衡鹽溶液(HBSS,本實驗室配制:8g/LNaCl,0.4g/LNaCl,1g/L葡萄糖,60mg/LKH2PO4,47.5mg/LNa2HPO4,調pH7.2)。1.2動物實驗和飼養(yǎng)Wistar大鼠,雄性,體質量180~220g,北京華阜康生物科技股份有限公司,許可證號:SCXK(京)2011-0007。所有動物每日實驗前禁食、自由飲水12h以上。Caco-2細胞,購自中國科學院上海細胞庫,細胞傳代數(shù)為20~30代。1.3反相色譜法分離聚碳酸酯膜測利得超優(yōu)血糖儀,臺灣厚美德生物科技股份有限公司;大鼠胰島素ELISA試劑盒,南京建成生物工程研究所;ThermoScientificMK3型酶標儀,ThermoFisher公司;TranswellPermeableSupports(聚碳酸酯膜,24孔,孔徑0.4μm,直徑6.5mm),CorningIncorporated公司;Millicell-ERS電阻儀,Millipore公司;LC—10P液相泵、LC—10UV檢測器,大連江申分離科學技術公司;DiamonsilC18(2)反相色譜柱(150mm×4.6mm,5μm),DikmaTechnologies公司;Easy3000工作站,中輝科學器材有限公司。2方法2.1制備2.1.1制備蒲公英水提取物稱取干燥的蒲公英藥材,加入30倍質量純凈水,60℃水浴4h,濾過后減壓蒸餾濃縮、冷凍干燥,得蒲公英水提取物,4℃保存?zhèn)溆?。根?jù)蒲公英有效成分的水溶性推測,其水提取物中主要成分可能為黃酮類和酚酸類。2.1.2阿波糖溶液的制備每片阿卡波糖片(含阿卡波糖50mg)加純凈水50mL,4℃靜置過夜,攪拌后濾過,即得1g/L阿卡波糖水溶液。2.2麥芽糖前及給藥后血糖水平檢測50只大鼠以空腹血糖為準均衡分為5組:對照組(生理鹽水),阿卡波糖(40mg/kg)組,蒲公英水提取物400、200、100mg/kg組。各給藥組每天ig給藥1次,連續(xù)給藥7d,末次給藥1h后ig給予麥芽糖2g/kg。分別于給予麥芽糖前及給予麥芽糖后30、60、90、120min,大鼠尾部取外周血,血糖儀測定血糖水平;給藥后1h,采集對照組和蒲公英水提取物組大鼠外周血30μL(因阿卡波糖對胰島素水平無明顯影響,故僅對這4組大鼠胰島素水平進行檢測),按ELISA試劑盒說明書方法測定胰島素水平。2.3實驗動物及分組取80只大鼠,其中10只作為對照組,給予正常飼料,其余70只大鼠喂飼高脂飼料4周后,一次性ip給予STZ50mg/kg,繼續(xù)給予高脂飼料,3d后測空腹血糖,選取空腹血糖高于12mmol/L的50只大鼠用于實驗。以空腹血糖為準將大鼠均衡分為5組:模型組(生理鹽水),阿卡波糖(40mg/kg)組,蒲公英水提取物400、200、100mg/kg組,每天ig給藥1次,連續(xù)給藥7d。末次給藥后1h,各組大鼠ig給予麥芽糖2g/kg,分別于給予麥芽糖前及給予麥芽糖后30、60、90、120min,大鼠尾部取外周血,血糖儀測血糖水平。2.4多次給藥、多次給藥正糖鉗實驗按文獻報道的方法進行。30只健康大鼠隨機分為對照組(生理鹽水)、鹽酸二甲雙胍(200mg/kg)組和蒲公英水提取物(400mg/kg)組,每組10只,每天ig給藥1次,連續(xù)給藥7d。末次給藥后1h開始手術,胰島素灌流速率為10mU/(kg·min),葡萄糖注射液質量濃度為100g/L,每10min測1次頸動脈血樣中的葡萄糖水平,并據(jù)此調節(jié)葡萄糖灌流速率。使血糖水平在1h內均保持在(8±1)mmol/L的某個固定的葡萄糖輸注率(GIR),記為該動物的GIR。2.5-糖苷酶基因型的檢測采用文獻報道方法檢測蒲公英水提取物對α-糖苷酶活性的影響。本實驗所用溶液均以pH6.8、67mmol/L磷酸鹽緩沖液配制。將蒲公英水提取物或陽性對照阿卡波糖溶液(0.054~1.739mg/mL)2mL、0.5U/mLα-糖苷酶0.1mL以及1mg/mL的谷胱甘肽(GSH)0.1mL混合,37℃培養(yǎng)10min,加入16mmol/L的pNPG0.1mL,37℃再培養(yǎng)10min。檢測混合液400nm處的吸光度(A)值,計算α-糖苷酶抑制率(IR),采用Bliss法計算α-糖苷酶半數(shù)抑制濃度(IC50)。2.6影響caco-2細胞的葡萄糖水解和葡萄糖吸收功能2.6.1紫外過濾器采用DiamonsilC18(2)反相色譜柱,流動相為乙腈-0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(20∶80),pH值7.0,體積流量1.0mL/min,進樣量20μL,柱溫30℃,紫外檢測器波長254nm。2.6.2hbss接收Caco-2細胞置于含10%胎牛血清、10mmol/LHepes、1%非必需氨基酸、100U/L青霉素和100mg/L鏈霉素的DMEM(pH7.4)中,于TranswellPermeableSupports上培養(yǎng)21d,最后3d頂面培養(yǎng)液中分別加入陽性藥阿卡波糖(α-糖苷酶抑制劑,終質量濃度250mg/L)、根皮苷(Na+-葡萄糖同向轉運體抑制劑,終質量濃度200mg/L)、蒲公英水提取物(終質量濃度分別為200、100mg/L),跨上皮電阻≥200?·cm2表示形成緊密細胞單層。開始實驗時,棄去各孔頂面及底外側面的HBSS溶液,將含有底物麥芽糖(終濃度為28mmol/L)200μL和各藥物的HBSS加到頂面作為供給池(各藥物終濃度與上述最后3d預培養(yǎng)時的相同),同時底外側面加入無葡萄糖、無底物的HBSS溶液800μL作為接收池。將Transwell培養(yǎng)板置于恒溫水浴振蕩儀中,在振蕩速率50r/min、溫度37℃下作用40min,分別吸出頂面和底外側面的全部溶液,并將頂面溶液用純凈水稀釋4倍后,所有樣品于-20℃保存?zhèn)銱PLC檢測用。2.6.3內標法計算葡萄糖的量葡萄糖檢測采用PMP柱前衍生化HPLC法進行。柱前衍生化主要步驟:配制1mmol/L葡萄糖水溶液作為對照品,與待測樣品平行檢測。將待測樣品或葡萄糖對照品200μL、1mmol/L半乳糖200μL(內標物)、1.5mol/L的NaOH水溶液100μL、0.5mol/L的PMP甲醇溶液500μL混合均勻,70℃下水浴30min,水浴后放置至室溫,加1.5mol/L鹽酸100μL中和,再加1mL氯仿渦旋振蕩20s,取上層水相700μL,再加700μL氯仿渦旋振蕩20s,取上層水相400μL,以10000×g離心15min使微粒沉淀,備HPLC進樣。記錄Easy3000色譜工作站給出的葡萄糖峰和半乳糖峰的峰面積,用內標法計算樣品中葡萄糖的量。用得出的所有樣品中的葡萄糖濃度計算培養(yǎng)板中每個孔的CAG+CBG值、CBG/(CAG+CBG)值(CAG為供給池中葡萄糖濃度,CBG為接收池葡萄糖濃度)。CX為各樣品中葡萄糖濃度,f為校正因子,AX為各樣品中葡萄糖的峰面積,AS為內標物峰面積,CS為內標物濃度,AR為對照品中葡萄糖的峰面積,CR為對照品中葡萄糖的濃度2.7統(tǒng)計處理所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計均用SPSS13.0軟件進行分析,數(shù)據(jù)均以表示,組間比較采用單因素方差分析。3結果3.1蒲公英水提取物對大鼠血清胰島素水平的影響與對照組相比,阿卡波糖、蒲公英水提取物400mg/kg連續(xù)給藥7d,使正常大鼠麥芽糖餐后血糖水平在30、60、90min顯著降低(P<0.05),蒲公英水提取物200mg/kg使餐后血糖在90min、100mg/kg使餐后血糖在60min顯著降低(P<0.05)。結果見圖1。蒲公英水提取物400、200、100mg/kg連續(xù)給藥7d,對正常大鼠血清胰島素水平無顯著影響。結果見圖2。3.2糖尿病大鼠麥芽糖餐后血糖水平變化與對照組相比,模型組大鼠血糖水平顯著升高(P<0.05)。與模型組相比,阿卡波糖、蒲公英水提取物400mg/kg使糖尿病大鼠麥芽糖餐后血糖水平在30、60、90、120min顯著降低(P<0.05),蒲公英水提取物200mg/kg使餐后血糖在30min顯著降低(P<0.05)。結果見圖3。3.3正離子檢測大鼠火炬中cod正糖鉗實驗顯示,與對照組相比,鹽酸二甲雙胍顯著升高正常大鼠的GIR(P<0.05),而蒲公英水提取物400mg/kg對正常大鼠GIR無顯著影響。結果見圖4。3.4回復突變試驗蒲公英水提取物和阿卡波糖對α-糖苷酶活性均顯示抑制作用,并與質量濃度有良好的相關性。以IR為縱坐標(Y),藥物質量濃度為橫坐標(X),得蒲公英水提取物對α-糖苷酶的抑制曲線方程為Y=22.715lnX+81.047,r2=0.9844,IC50為0.477mg/mL,95%可信限為0.412~0.559mg/mL;阿卡波糖對α-糖苷酶的抑制曲線方程則為Y=24.337lnX+69.308,r2=0.9790,IC50為0.251mg/mL,95%可信限為0.211~0.296mg/mL。結果見圖5。3.5各組cag+cbg值的比較PMP柱前衍生化HPLC檢測葡萄糖濃度結果顯示,待測物葡萄糖與內標物半乳糖實現(xiàn)基線分離,經與不含葡萄糖和半乳糖的頂面HBSS圖譜對比,二峰所在保留時間均無其他雜質峰干擾。與對照組相比,阿卡波糖250mg/L組和蒲公英水提取物200mg/L組CAG+CBG值顯著降低(P<0.05);根皮苷200mg/L組與蒲公英水提取物100mg/L組則無顯著改變。結果見圖6。與對照組相比,根皮苷200mg/L組和蒲公英水提取物200mg/L組的CBG/(CAG+CBG)值顯著降低(P<0.05);阿卡波糖250mg/L組與蒲公英水提取物100mg/L組則無顯著改變。結果見圖7。4蒲公英水提取物降血糖作用的體外實驗結果王東亮等用蒲公英水煎液給小鼠ig15d,未觀察到其能降低小鼠空腹血糖水平;而宋曉勇等的實驗證實蒲公英多糖在體外可抑制α-糖苷酶活性。α-糖苷酶是食物中淀粉、寡糖和雙糖水解為單糖的必需酶,而只有單糖才可從腸道吸收入血。α-糖苷酶活性被抑制,可以減少葡萄糖在腸道的生成從而降低餐后血糖。因此推測蒲公英水提取物可能具有與阿卡波糖阻礙糖類在腸道吸收相類似的作用。本實驗旨在驗證這種推測。實驗結果表明,蒲公英水提取物連續(xù)給藥7d,可降低大鼠餐后血糖水平。正糖鉗實驗中測定的GIR是某個組織對胰島素敏感性的定量評價指標。本實驗結果顯示,蒲公英水提取物對大鼠血清胰島素和GIR均無影響,表明其在不升高胰島素、不增加組織對胰島素敏感性的前提下降低大鼠餐后血糖,因此推測蒲公英水提取物降血糖作用可能是減少了腸道吸收葡萄糖入血的緣故。藥物減少葡萄糖經腸道入血,可能是阻礙了糖類的水解或葡萄糖在小腸上皮細胞的轉運。體外實驗證實蒲公英水提取物對α-糖苷酶活性有抑制作用。采用Caco-2細胞進行糖類在小腸消化吸收的研究較多,但較少見采用可滲透支持膜進行Caco-2細胞培養(yǎng),并在考察糖類水解的同時研究葡萄糖轉