乳酸桿菌發(fā)酵產(chǎn)乳酸的研究

乳酸桿菌發(fā)酵產(chǎn)乳酸的研究

0乳酸桿菌發(fā)酵糖溶酶系統(tǒng)蘑菇（硫酸細(xì)菌的縮寫，下一種）是可以使用可轉(zhuǎn)化的糖產(chǎn)生大量谷氨酸的細(xì)菌的總稱。乳酸菌具有復(fù)雜的營養(yǎng)要求,它的生長需要碳水化合物、氨基酸、肽類、脂肪酸酯類、鹽類、核酸衍生物和維生素類;乳酸菌包括球狀菌和桿狀菌。絕大部分乳酸球菌在pH值低于4.5就停止生長,而正常黃酒發(fā)酵醪pH值是在4.2以下發(fā)酵的。下面著重討論乳酸桿菌:乳酸桿菌發(fā)酵糖產(chǎn)生乳酸,或除乳酸以外,還有乙酸、甲酸、丙酸等其他有機(jī)酸,發(fā)酵主要產(chǎn)物為乳酸。乳酸桿菌在pH值3.3～3.5能生長、發(fā)酵,最低可達(dá)pH值2.0能存活;而且能耐酒精20%(V/V)以上,最高可達(dá)27%(V/V)以上。乳酸桿菌對氧的需求分為微需氧、兼性厭氧、極端厭氧三類。有些乳酸桿菌能分解淀粉、糊精,有些能利用月示、胨、多肽,或兩者都有之。黃酒發(fā)酵過程是邊糖化邊發(fā)酵,發(fā)酵者都有之。黃酒發(fā)酵過程是邊糖化過發(fā)酵,發(fā)酵醪營養(yǎng)豐富,整個(gè)發(fā)酵期間氨基酸含量在0.4mg/L以上,維生素及其他各種微量成分相當(dāng)充足(如各種微生物的自溶物),非常適宜于乳酸桿菌生長、繁殖、發(fā)酵的需求。對黃酒發(fā)酵醪中各種微生物的檢測和分離發(fā)現(xiàn):黃酒發(fā)酵過程是曲中各種酶系對原料的緩慢液化、糖化,酵母發(fā)酵糖產(chǎn)酒精和少量有機(jī)酸,同時(shí),乳酸桿菌發(fā)酵糖產(chǎn)大量乳酸、少量乙酸和其他有機(jī)酸。乳酸桿菌大量存在于黃酒發(fā)酵醪中。而且,在后發(fā)酵后期,當(dāng)醪液中各種酶系(曲帶入的),因長時(shí)間(數(shù)十天)作用,各種酶活力大大降低,極其微弱,而有的乳酸桿菌分解淀粉、糊精為糖,分解月示、胨、多肽為氨基酸,供給酵母發(fā)酵產(chǎn)酒精,繼續(xù)推動(dòng)發(fā)酵作用的進(jìn)行。乳酸桿菌發(fā)酵糖產(chǎn)乳酸,提高黃酒酸度,降低pH值;乳酸桿菌自溶分解為多肽、少量氨基酸和其他成分,促進(jìn)黃酒的呈香呈味,增強(qiáng)黃酒口味的豐滿性和濃厚感。但是,黃酒發(fā)酵過程酸敗也是由于個(gè)別乳酸桿菌的大量繁殖,累積特殊乳桿菌素(Lactocin),又不同的酵母對不同的乳酸桿菌的凝集性反應(yīng)不同,抑制酵母的生長、繁殖、發(fā)酵,促使酵母大量快速自溶,使醪液pH值迅速提高,又提供給其他細(xì)菌繁殖的大量營養(yǎng)和條件,加快其他細(xì)菌的繁殖速度,產(chǎn)生大量有機(jī)酸,從而使黃酒酸敗。即老技工常說:“在黃酒醪即將要酸敗前,其口味最鮮”,是酵母、細(xì)菌快速自溶分解產(chǎn)生大量氨基酸所致。本文以加飯酒為例(下同),闡述乳酸桿菌在黃酒發(fā)酵過程中的功與過,與大家共同探討。1乳酸桿菌發(fā)酵糖酯黃酒發(fā)酵過程是酵母與乳酸桿菌共同發(fā)酵的結(jié)果。酵母發(fā)酵糖產(chǎn)酒精和少量有機(jī)酸,并同化氨基酸、有機(jī)酸產(chǎn)高級醇和酯等風(fēng)味物質(zhì);乳酸桿菌發(fā)酵糖產(chǎn)大量乳酸和少量其他有機(jī)酸,部分提供給酵母產(chǎn)酯。黃酒中大部分有機(jī)酸(乳酸)是在發(fā)酵過程主要由乳酸桿菌產(chǎn)生。分述如下:1.1機(jī)械化生產(chǎn)過程中酵母產(chǎn)酸量的變化黃酒的釀造按生產(chǎn)方式不同可分為傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)黃酒和機(jī)械化生產(chǎn)黃酒,以下簡稱傳統(tǒng)工藝和機(jī)械化生產(chǎn)。在傳統(tǒng)工藝中,黃酒發(fā)酵起始酸度為1.80g/L(以乳酸計(jì),下同)左右,發(fā)酵結(jié)束酸度為6.56g/L左右;發(fā)酵過程產(chǎn)酸量為4.76g/L。對發(fā)酵醪的酵母進(jìn)行分離測定可知:筆者共分離出80余株酵母,并在米曲、飯?zhí)腔频玫奶且褐羞M(jìn)行測定,所有酵母的產(chǎn)酸量在0.90～2.00g/L之間,糖液中產(chǎn)酒精:7.0%(V/V)左右。而產(chǎn)酸(產(chǎn)乳酸)酵母如耐熱克魯維酵母(Klugvromycesthermotolerans)沒有檢測到。在機(jī)械化生產(chǎn)中,發(fā)酵起始酸度為1.80g/L左右,發(fā)酵結(jié)束酸度為6.56g/L左右。機(jī)械化生產(chǎn)中采用純種酵母進(jìn)行發(fā)酵,因純種酵母繁殖能力和產(chǎn)酒精能力特別強(qiáng);純種酵母的大量繁殖抑制其他酵母的生長繁殖。因此,機(jī)械化生產(chǎn)的發(fā)酵過程幾乎是由純凈的純種酵母和細(xì)菌(乳酸桿菌)發(fā)酵而成。筆者對公司所用的幾種純種酵母在米曲、飯?zhí)腔频玫奶且褐羞M(jìn)行測定,純種酵母的產(chǎn)酸量相當(dāng)少,而且相當(dāng)穩(wěn)定,在1.00～1.90g/L之間,糖液中產(chǎn)酒精8.0%(V/V)以上。而且,在黃酒發(fā)酵過程,當(dāng)酒精度大于7.0%(V/V)以后,酵母產(chǎn)酸極其微量。傳統(tǒng)工藝中,三耙后,醪液酒精度在7.0%(V/V)以上,此時(shí),總酸度為4.57g/L以下。機(jī)械化生產(chǎn)中,經(jīng)24h發(fā)酵后,醪液酒精度在7.5%(V/V)以上,甚至高達(dá)12.5%(V/V),此時(shí),總酸度在3.81g/L以下。當(dāng)醪液酒精度大于7%(V/V)以后升高的酸度,幾乎是由細(xì)菌(乳酸桿菌)產(chǎn)生的。醪液酒精度小于7%(V/V)以前生成的酸度,部分也是由細(xì)菌(乳酸桿菌)產(chǎn)生的。黃酒發(fā)酵過程是開放式、加曲發(fā)酵、曲、空氣中有許多霉菌主要是:根霉、毛霉、曲霉、犁頭霉,及少量青霉等霉菌加入發(fā)酵醪內(nèi)。上述霉菌在pH值4.2以下和微氧狀態(tài)下,就受到嚴(yán)重抑制,生長相當(dāng)緩慢;當(dāng)酒精度達(dá)5.0%(V/V)時(shí),上述霉菌就停止生長;當(dāng)酒精度達(dá)10%(V/V)時(shí),上述霉菌就死亡。霉菌在黃酒發(fā)酵醪內(nèi)存活、生長時(shí)間很短,而且,霉菌的產(chǎn)酸量本身很小。因此,霉菌在黃酒發(fā)酵過程中產(chǎn)酸微量;上述霉菌中,只有根霉和毛霉能產(chǎn)一定數(shù)量的乳酸,在這么短時(shí)間內(nèi),根霉和毛霉產(chǎn)乳酸量很小。在起始酸度的抑制下,各種酵母所產(chǎn)總酸量大為減少。傳統(tǒng)工藝中,酵母總產(chǎn)酸量在2.00g/L以下,細(xì)菌(乳酸桿菌)產(chǎn)酸量在2.76g/L以上;機(jī)械化生產(chǎn)中,酵母總產(chǎn)酸量在1.90g/L以下,細(xì)菌(乳酸桿菌)產(chǎn)酸量在2.86g/L以上。1.2不同菌種對發(fā)酵過程的乳酸量黃酒中有機(jī)酸分析測定數(shù)據(jù)如表1、表2。從表1、2可知:黃酒中有機(jī)酸以乳酸為主,干型、半干型黃酒乳酸含量在4000mg/L以上,甜型黃酒的乳酸含量在3000mg/L以上,占總有機(jī)酸含量的57%以上。而且,黃酒中部分乳酸乙酯是由乳酸在酵母酯化作用下生成乳酸乙酯:CH3CHOHCOOH+C2H5OH→C2H3CHOHCOOC2H5+H2OCΗ3CΗΟΗCΟΟΗ+C2Η5ΟΗ→C2Η3CΗΟΗCΟΟC2Η5+Η2Ο即每100mg乳酸乙酯折合乳酸76.18mg。黃酒中乳酸乙酯含量為70～200mg/L,折合乳酸為53～152mg/L。因此,有一定數(shù)量的乳酸在酵母酯化作用下生成乳酸乙酯;并且,黃酒經(jīng)陳釀后乳酸、乳酸乙酯的含量有所增加?？傊?成品黃酒中總?cè)樗崃吭?400mg/L以上。而發(fā)酵起始酸度1.80g/L左右,由加入的漿水、酒母、曲、原料中有機(jī)酸組成,其中乳酸占60%左右,發(fā)酵起始乳酸量即為1080mg/L左右。在發(fā)酵全過程及成品黃酒制作過程沒有外加乳酸及其他酸類,因此,黃酒發(fā)酵過程產(chǎn)乳酸量在3300mg/L以上。而酵母在發(fā)酵過程中產(chǎn)乳酸的數(shù)量是很少的。各種酵母產(chǎn)乳酸的量如表3。(日本)原等對酵母菌在發(fā)酵過程中生產(chǎn)乳酸能力進(jìn)行試驗(yàn):曲汁8Nx+葡萄糖10%(pH4.3),接入各種酵母菌量:106個(gè)/ml,25℃培養(yǎng)5天后,培養(yǎng)液中乳酸含量如表3;結(jié)果所有供試菌株都產(chǎn)乳酸,一般生成量在50～300mg/L。所有葡萄酒酵母發(fā)酵作用生成乳酸量較少,在130～400mg/L之間,釀酒酵母產(chǎn)乳酸量也相當(dāng)少,在500mg/L以下,產(chǎn)酸量也相當(dāng)少。在傳統(tǒng)工藝中對酵母菌的分離鑒定可知:60%左右為釀酒酵母,35%為葡萄酒、果酒酵母,5%左右為其他酵母如異常漢遜氏、假絲酵母等。機(jī)械化生產(chǎn)中所用的純種酵母為釀酒酵母。而在起始乳酸的抑制下,各種酵母所產(chǎn)的乳酸數(shù)量大為減少。傳統(tǒng)工藝中,酵母發(fā)酵產(chǎn)乳酸總量在500mg/L以下,因此,發(fā)酵過程產(chǎn)乳酸量3300mg/L以上的絕大部分乳酸2800mg/L以上,是由乳酸菌(乳酸桿菌)所產(chǎn)生的。機(jī)械化生產(chǎn)中,尤其明顯,因酵母種類少,發(fā)酵時(shí)間短,酒精上升快,酵母產(chǎn)乳酸量更加少。1.3不同酒精度對酵母菌生長的影響對傳統(tǒng)工藝的發(fā)酵過程,微生物的分離檢測,并根據(jù)菌落特征、性能進(jìn)行檢定,黃酒發(fā)酵醪中乳酸桿菌數(shù)量不少,直接參與黃酒的發(fā)酵作用。在傳統(tǒng)工藝的發(fā)酵過程中,酵母與乳酸桿菌的數(shù)量列于表4。從表4可知:黃酒發(fā)酵醪中乳酸桿菌數(shù)量相當(dāng)巨大,種類也相當(dāng)多,筆者已檢測到十余種。在檢測過程中也發(fā)現(xiàn)有酒明串珠菌(Leuconostocoenos)存在,耐酸,在pH3.5以下能生長,耐酒精度高,高達(dá)26%(V/V)以上。而正常的加飯酒發(fā)酵過程,酵母與乳酸桿菌在pH值3.8以下(甚至更低pH3.3～3.5)進(jìn)行發(fā)酵為佳,隨著酵母產(chǎn)酒精,使醪液酒精度不斷提高,酵母、細(xì)菌自溶增加,氨基酸、多肽等堿性物質(zhì)大量增加,使得pH值逐步提高到4.0左右。而且,發(fā)酵期pH值越低,則醪液內(nèi)乳酸桿菌數(shù)越少,發(fā)酵結(jié)束酸度越低。但由于乳酸桿菌在黃酒醪低pH值(pH3.8以下)能生長,并產(chǎn)生乳桿菌素(Lactocin),如植物乳桿菌(Lactobacillasplantarum)等,對酒明串珠菌有很大的抑制作用,使其不能生長,因此,酒明串珠菌在醪液中數(shù)量極少,對黃酒發(fā)酵幾乎無作用,但不能造成其死亡;對醋酸桿菌,芽孢桿菌和其他細(xì)菌也有很大的抑制作用。而且,醋酸桿菌的生長受到酒精度的抑制非常明顯,一般的醋酸桿菌在酒精度達(dá)到6%(V/V)時(shí),基本不能生長;當(dāng)酒精度在15%(V/V)以上,可致其死亡;而且,醋酸桿菌為好氧菌,在黃酒醪微氧狀態(tài)下,生長也受到嚴(yán)重抑制。芽孢桿菌等其他細(xì)菌在pH4.5以下,不能生長。因此,在黃酒發(fā)酵醪中,醋酸桿菌、芽孢桿菌等其他細(xì)菌沒有檢測到。但黃酒醪內(nèi)酒明串珠菌、芽孢桿菌(如巨大芽孢桿菌)的芽孢始終存在,只是數(shù)量極其稀少,芽孢不能萌發(fā),不起作用。機(jī)械化生產(chǎn)中,因發(fā)酵罐罐體高大,無法攪勻,而沒有檢測。1.4不同品種酒中酵母粉產(chǎn)酸量的比較日本清酒中有機(jī)酸含量如表5。日本清酒醪發(fā)酵結(jié)束酸度為2.745g/L以下,其中17%是從曲及酒母中帶來的,從酒母來的有機(jī)酸以乳酸為主,其余總酸量2.278g/L的大部分是酵母在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的。與筆者在米曲、飯?zhí)腔频玫奶且褐兴鶞y定的酵母產(chǎn)總酸量相吻合,酵母產(chǎn)酸量非常少,乳酸的生成量更少,在500mg/L以下。而黃酒發(fā)酵過程產(chǎn)酸量為4.76g/L左右,是日本清酒發(fā)酵過程產(chǎn)酸量的2.09倍。把表1、表2與表5比較可知,黃酒中乳酸含量是日本清酒的7.0倍以上;黃酒發(fā)酵過程產(chǎn)乳酸的量是日本清酒的5.0倍以上,相差非常之巨大。因此,黃酒的開放式發(fā)酵與日本清酒發(fā)酵的根本區(qū)別在于:黃酒是以酵母、乳酸桿菌共同參與發(fā)酵,而日本清酒是以單一酵母發(fā)酵的。1.5其他細(xì)菌投料時(shí)加入乳酸桿菌1.5.1漿水在浸米過程中,隨著浸米時(shí)間增加,漿水中乳酸球菌逐漸減少,乳酸桿菌不斷增加,到浸米末期,漿水中以乳酸桿菌為主,而乳酸球菌等其他細(xì)菌數(shù)量很少。投料時(shí)加入漿水,同時(shí)接入了大量的乳酸桿菌。1.5.2曲曲中存在不少乳酸桿菌,投料加入曲,同時(shí)接入乳酸桿菌。1.5.3酒母淋飯酒母中乳酸桿菌的數(shù)量為(1.0～1.5)×106個(gè)/mL,酵母數(shù):5.0～10.0億個(gè)/mL,投料時(shí)加入酒母,同時(shí)接入乳酸桿菌。1.5.4發(fā)酵器具和空氣中,存在一定數(shù)量的乳酸桿菌,在操作中也帶入一定數(shù)量的乳酸桿菌。1.6最佳發(fā)酵原料是乳酸桿菌乳酸桿菌的種在自然界中分布廣泛,很少有致病菌,在其發(fā)酵食品及產(chǎn)物中不形成任何毒素或毒性產(chǎn)物,而且乳酸桿菌是人、動(dòng)物胃和小腸中主要的正常菌和優(yōu)勢菌群。是世界公認(rèn)的安全菌?？傊?乳酸桿菌不只是引起黃酒酸敗的有害菌,而是直接參與黃酒發(fā)酵的全過程,產(chǎn)生大量乳酸,即黃酒中的大部分有機(jī)酸(乳酸)是在發(fā)酵過程主要由乳酸桿菌產(chǎn)生。而且,黃酒必須有一定量的有機(jī)酸(乳酸),即“無酸不成味”;若黃酒達(dá)不到一定量的有機(jī)酸(乳酸),陳釀三年或五年后,則酯香不足,口味欠缺;也就是黃酒發(fā)酵過程必須有乳酸桿菌參與。2影響酒精發(fā)酵的因素乳酸桿菌共同參與黃酒發(fā)酵,它的作用非常大。2.1乳酸桿菌能耐低pH值(pH3.3～3.5)生長、繁殖,發(fā)酵糖產(chǎn)大量乳酸,在黃酒發(fā)酵過程中,降低和維持低pH值,使黃酒發(fā)酵順利進(jìn)行,并形成黃酒的有效成份—乳酸。2.2黃酒為開放式發(fā)酵,而乳酸桿菌的大量生長,產(chǎn)生并累積乳桿菌素,以及低pH值,抑制其他細(xì)菌的生長、繁殖,而對酵母無抑制作用。同時(shí),促使酵母的耐酒精力和耐酸能力的提高;或者是酵母為了適應(yīng)發(fā)酵醪液的環(huán)境,酵母菌自身進(jìn)行一定的特定的染色體適度重排,有利于酵母菌適應(yīng)環(huán)境;或者是酵母菌種本身能夠適應(yīng)在低pH值或有乳桿菌素等黃酒發(fā)酵醪液的環(huán)境。確保黃酒發(fā)酵過程在粗放條件下也不酸敗。2.3有些乳酸桿菌(如:Lactobacillus)自溶產(chǎn)生活性成分:酸性多糖磷壁(酸)質(zhì)(Teichoicacid),能促進(jìn)飯的溶解、液化,提高原料利用率。2.4乳酸桿菌發(fā)酵糖主要產(chǎn)乳酸以外,還產(chǎn)少量的乙酸、甲酸、丙酸、二氧化碳及其他微量醇、醛、酸等,乳酸桿菌自溶分解出多肽、氨基酸及其他大分子物質(zhì),促進(jìn)黃酒的呈香、呈味,大大提高黃酒口味的豐滿性和濃厚感,豐富黃酒成分的多樣性,促進(jìn)黃酒香氣物質(zhì)的增加,也是形成黃酒風(fēng)味的豐富性與復(fù)雜性原因之一。2.5不同的乳酸桿菌在不同條件下,產(chǎn)生乳酸與乙酸的比例不同,而且產(chǎn)生D-乳酸、L-乳酸、DL-乳酸的數(shù)量也不同,豐富黃酒中的乳酸品種。2.6有的乳酸桿菌能分解淀粉、糊精為糖,或能分解月示、胨、多肽為氨基酸,或兩者皆有之,在一定程度上推動(dòng)著黃酒發(fā)酵進(jìn)程。2.7黃酒主發(fā)酵期,主要是高溫乳酸桿菌生長、繁殖、發(fā)酵,而后發(fā)酵期,主要是低溫乳酸桿菌的生長、繁殖、發(fā)酵。發(fā)酵溫度的降低過程,部分高溫乳酸桿菌死亡、自溶,給酵母和低溫乳酸桿菌發(fā)酵提供極豐富的營養(yǎng)。即乳酸桿菌與酵母協(xié)同作用,互相促進(jìn),互相制約,共同推動(dòng)黃酒發(fā)酵,是產(chǎn)生很高酒精度的原因之一。3飲料發(fā)酵期各時(shí)間生長規(guī)律黃酒的酸敗主要也是由乳酸桿菌引起的,乳酸桿菌引起黃酒酸敗,主要有以下兩個(gè)方面。3.1由漿水、曲、酒母帶入的乳酸桿菌數(shù)量太多,或發(fā)酵工藝條件沒有符合要求,使得個(gè)別對酵母有拮抗作用的乳酸菌大量繁殖,產(chǎn)生并累積特殊乳桿菌素,抑制酵母生長、繁殖,促使酵母快速自溶,使醪液pH值升高,又提供其他細(xì)菌繁殖、生長條件,致使乳酸桿菌與其他細(xì)菌大量繁殖產(chǎn)酸,而酸敗。3.2后發(fā)酵末期,醪液酒精度已很高,18%(V/V)以上,酵母的活動(dòng)能力受到嚴(yán)重抑制,而乳酸桿菌耐酒精度比酵母要高得多。此時(shí),若不及時(shí)榨酒,則醪液酒精度上升緩慢,而酸度上升較快。同樣道理,后發(fā)酵后期,若品溫升高,則醪液酸度上升也較快。4中國白酒中乳酸桿菌的接種目前,我們要正確認(rèn)識乳酸桿菌