小鼠睪丸內gaa-4免疫反應產物的分布與分布

小鼠睪丸內gaa-4免疫反應產物的分布與分布

戈塔-4是gata家族的第四個成員。編碼的gata-4含有一個dna組合區(qū)域和兩個編碼激活區(qū)域。1993年Arceci等通過篩查小鼠胚胎cDNA文庫首次克隆出小鼠GATA-4cDNA,1995年Huang等通過篩查人類心臟cDNA文庫首次克隆出人GATA-4cDNA,以后相繼在人類肺、肝臟、小腸及睪丸和卵巢等器官中檢測到GATA-4mRNA和蛋白的表達。在脊椎動物中已發(fā)現(xiàn)6個GATA轉錄因子,即GATA-1、-2、-3、-4、-5、-6,共同組成了GATA家族。近年來,愈來愈多的研究結果表明GATA家族在動物生殖細胞的分化和生殖過程中多種激素的調節(jié)上都有著必不可少的作用。本課題組對小鼠睪丸內GATA-4免疫反應產物的分布與特征進行研究,為探討GATA-4在睪丸性別決定和分化以及激素調控方面提供了形態(tài)學依據(jù)。1材料和方法1.1主試劑一抗:羊抗小鼠GATA-4多克隆抗體,由美國SantaCruz公司提供;二抗:生物素化兔抗羊IgG,由日本Nagoya公司提供。1.2小鼠飼料健康雄性B6SJLF1/J小鼠24只,由日本Isahaya公司提供,從剛出生、2、4、6周小鼠進行取材,用不含任何藥物的飼料常規(guī)喂養(yǎng)。1.3實驗方法1.3.1小鼠睪丸的石蠟染色實驗用小鼠從出生開始,將同一批次隨機分4組,每組6只,分別于0d、2、4、6周進行取材,先用乙醚將實驗小鼠麻醉約4～5min,將小鼠稱重后,快速取出睪丸,放入事先準備好的含4%多聚甲醛固定液的試管中待用。組織切成0.5cm×0.5cm×0.5cm左右方塊后,4%多聚甲醛充分固定24h,用0.01mol/LPBS(pH7.4)洗3次,進行脫水、包埋、5μm厚石蠟切片、染色。分別用HE和GATA-4免疫組化染色進行觀察比較。1.3.2小鼠血清gata-4和igg的制備石蠟切片經二甲苯及梯度酒精脫蠟到水;以0.3%H2O2-80%甲醇孵育20min,消除內源性過氧化物酶;PBS洗3次,每次5min;5%正常山羊血清封閉,室溫下60min;滴加稀釋的一抗羊抗小鼠GATA-4(1∶100),孵育24h,PBS沖洗3次,每次15min。然后滴加二抗辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗羊IgG(1∶100),37℃下60min,PBS沖洗3次,每次10min;DAB顯色15min,顯微鏡控制顯色時間;自來水沖洗,甲基綠復染。對照實驗用PBS代替一抗,其余步驟同上,確定免疫反應的特異性。1.4統(tǒng)計分析采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行完全隨機設計資料單因素方差分析,以P<0.05為有顯著性差異。2小鼠睪丸中gata-4表達情況PBS代替一抗,結果為陰性。GATA-4的免疫反應陽性結果為黃褐色,說明本實驗顯示陽性結果具有特異性。每組6只小鼠之間的陽性細胞數(shù)比較沒有差異。GATA-4的免疫反應細胞在出生到6周的睪丸中均有分布,剛出生的小鼠睪丸中,主要表達于Sertoli細胞及少量的Leydig細胞(圖1A),且Sertoli細胞中的GATA-4陽性細胞的百分率均高于4周和6周,而Leydig細胞中GATA-4陽性細胞的百分率均低于4周和6周(表1);在2周的小鼠睪丸中,陽性細胞也主要集中在Sertoli細胞,還有少量的Leydig細胞中(圖1B),且Sertoli細胞中的GATA-4陽性細胞的百分率均高于4周和6周,而Leydig細胞中GATA-4陽性細胞的百分率均低于4周和6周(表1);但在4周的小鼠,陽性細胞除有Sertoli細胞和Leydig細胞外,還有生精細胞(圖1C);6周的小鼠,除Sertoli細胞和Leydig細胞外,可見于更多的生精細胞(圖1D);6周小鼠GATA-4陽性的生精細胞百分率明顯高于4周小鼠(表1)。陰性對照和HE染色結果見圖2及圖3。3gata-4對小鼠睪丸中sertoli細胞和leydig細胞的表達近年來,對GATA轉錄因子的研究越來越多,在我國主要集中在心臟、肝臟、肺等的研究上,在卵泡的研究也有報道,但對睪丸的研究則很少有人報道。GATA-4轉錄因子國外報道在睪丸中有表達,但具體在睪丸的哪些細胞有表達,在各個周齡段的表達情況如何,則報道很少。睪丸是男性生殖腺,在胚胎時期Sertoli細胞分泌抗苗勒管激素(anti-Müllerianhormone,AMH)使中腎旁管退化,中腎管發(fā)育,從而胚胎發(fā)育為男性;而GATA-4在性別決定和分化中扮演著重要的角色,GATA-4轉錄因子能與SF-1轉錄因子協(xié)同調節(jié),從而激活AMH啟動報告基因的活性,導致中腎旁管的單向退化和雄激素增強中腎管系統(tǒng)的發(fā)育,進而影響性別分化。GATA-4轉錄因子在初始的Sertoli細胞中能介導AMH啟動熒光素酶的活性,而且在克隆過程中過量表達GATAs1、4、5、6能夠激活AMH啟動子報告基因的活性。這和本實驗結果Sertoli細胞在0d,2、4、6周小鼠睪丸中均有表達相一致。Ketola等還發(fā)現(xiàn)GATA-4mRNA還存在于胎兒期及青春期前的人生精細胞內。與本實驗GATA-4在生精細胞表達相一致(圖1D)。但是青春期前及青春期小鼠GATA-4在Leydig細胞高表達,其免疫細胞陽性率高于剛出生和2周小鼠(表1),這可能源于GATA-4對類固醇激素的調控。GATA-4對GnRH的特異性表達起著重要的調節(jié)作用,GATA因子的大量結合將會誘導GnRH的大量分泌,這將直接影響FSH和LH等激素的分泌。精子的成熟離不開GATA-4對Sertoli細胞和Leydig細胞的調控。筆者研究發(fā)現(xiàn)GATA-4在0d、2周小鼠睪丸Leydig細胞中的陽性細胞相對較少,但在4周、6周的小鼠Leydig細胞中的陽性細胞多,說明GATA-4在青春期Leydig細胞有高表達(表1)。Ketola等認為GATA-4在人類青春期前的生精細胞有表達,而在青春期后沒有表達,而本次實驗發(fā)現(xiàn)GATA-4在0d、2周小鼠睪丸中未發(fā)現(xiàn)陽性生精細胞;而在4、6周小鼠睪丸則發(fā)現(xiàn)陽性生精細胞,小鼠性成熟期一般在6周齡,但在4周小鼠接近青春期前的小鼠生精細胞中有表達,在性成熟期的睪丸中生精細胞也有表達,這與Ketola等的報道有所不同,有待于進一步探索。所以筆者認為GATA-4可能通過對GnRH的特異性表達起著重要的調節(jié),影響到FSH和LH等激素的分泌,從而導致睪丸中雄激素的分泌與調節(jié),維持睪丸內環(huán)境的穩(wěn)定;同時可能參與了精子的發(fā)生與形成,因為青春期前后的睪丸內細胞GATA-4為高表達。GATA家族在哺乳動物生殖系統(tǒng)中扮演著重要的角色,在卵巢和睪丸的多種細胞中表達,參與動物的性別決定和生殖功能的調控。GATA-4與生殖系統(tǒng)的關系更加密切,參與了性別分化、類固醇激素的合成與調節(jié)及生殖激素的調節(jié),促性腺激素可以上調