宮頸鱗狀上皮病變發(fā)生發(fā)展過程中em與轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的相關(guān)性研究

宮頸鱗狀上皮病變發(fā)生發(fā)展過程中em與轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的相關(guān)性研究

宮頸是婦科最常見的腫瘤之一。隨著近年外科技術(shù)的成熟與相關(guān)抗宮頸癌藥物的臨床應(yīng)用,宮頸癌的綜合治療療效顯著提高。然而,由于迄今對(duì)宮頸癌惡性行為尚缺乏有效監(jiān)控及治療措施,仍有許多宮頸癌患者死于癌癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此,早期發(fā)現(xiàn)和治療仍是降低宮頸癌發(fā)病率及死亡率的重要手段之一。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)是腫瘤形成及侵襲轉(zhuǎn)移非常重要的過程,與惡性腫瘤發(fā)生關(guān)系密切。轉(zhuǎn)錄因子Twist及Snail被認(rèn)為在多數(shù)腫瘤發(fā)生發(fā)展中,具有下調(diào)上皮細(xì)胞鈣粘蛋白(E-cadherin)、上調(diào)彈性蛋白(vimentin)表達(dá)、誘導(dǎo)EMT及促進(jìn)腫瘤形成與發(fā)展的作用。本研究通過探討對(duì)慢性宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervicalintra-epithelialneoplasia,CIN)及宮頸鱗癌中轉(zhuǎn)錄因子E-cadherin,Vimentin及Twist,Snail表達(dá)的檢測及相關(guān)性分析,旨在為宮頸鱗狀上皮腫瘤發(fā)生過程中,可能存在的生物學(xué)機(jī)制研究及宮頸癌的早期發(fā)現(xiàn)、治療和預(yù)后監(jiān)測等,提供科學(xué)有效的理論基礎(chǔ)和依據(jù)?，F(xiàn)將研究結(jié)果,報(bào)道如下。1對(duì)象和方法1.1納入及被模型學(xué)檢測的患者年齡分布選擇荊州市婦幼保健院2005年1月至2009年12月宮頸組織活檢及手術(shù)切除中,確診為宮頸鱗狀上皮病變的170例存檔石蠟塊標(biāo)本為研究對(duì)象(均經(jīng)10%中性甲醛溶液固定、石蠟包埋、HE染色,切片厚度為4μm,組織病理學(xué)結(jié)果經(jīng)2位病理科醫(yī)師診斷并復(fù)核)。其中,慢性宮頸炎標(biāo)本為20例,納入慢性宮頸炎標(biāo)本組;CINⅠ,CINⅡ,CINⅢ及宮頸鱗癌標(biāo)本各為32例,27例,35例及56例,分別納入CINⅠ組,CINⅡ組,CINⅢ組及宮頸鱗癌組。慢性宮頸炎組及CINⅠ～Ⅲ組患者年齡為27～70歲,中位年齡為42.5歲。宮頸癌組患者年齡為32～65歲,中位年齡為48歲;高分化為28例,中分化為23例,低分化為5例;按國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(InternationalFederationofGynecologyandObstetrics,FIGO)對(duì)宮頸癌的臨床分期(2000)為Ⅰ～ⅡA期。本組170例患者術(shù)前均未接受其他特殊治療(包括放、化療)(本研究遵循的程序符合荊州市婦幼保健院人體試驗(yàn)委員會(huì)所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn),得到該委員會(huì)批準(zhǔn),并與患者簽署臨床研究知情同意書)。1.2轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)及轉(zhuǎn)導(dǎo)法檢測陰道循環(huán)治療細(xì)胞培養(yǎng)采用原位雜交(insituhybridization,ISH)技術(shù)及細(xì)胞免疫組化SABC法,檢測170例宮頸鱗狀上皮病變組織標(biāo)本中轉(zhuǎn)錄因子Twist,Snail及E-cadherin與Vimentin表達(dá)。1.2.1免疫組化試劑E-cadherin兔多克隆抗體,Vimentin小鼠單克隆抗體,即用型SABC免疫組化試劑盒,Twist,Snail的ISH試劑盒等,均購自武漢博士德生物工程有限公司。1.2.2免疫組化染色按照抗體說明書進(jìn)行抗原修復(fù),SABC法進(jìn)行免疫組化染色。2種一抗的工作濃度均為1∶100,并均以0.1mmol/LPBS代替一抗作為陰性對(duì)照。1.2.3t,snail寡核苷酸探針t,snael寡核苷酸探針I(yè)SH探針為地高辛標(biāo)記的Twist,Snail寡核苷酸探針,操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。ISH采用PBS代替雜交液作為陰性對(duì)照。1.2.4n表達(dá)強(qiáng)度及判定標(biāo)準(zhǔn)以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒判定為Twist,Snail及E-cadherin與Vimentin呈陽性表達(dá)。表達(dá)強(qiáng)度判定標(biāo)準(zhǔn):每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野,計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)并計(jì)算百分率。E-cadherin,Vimentin表達(dá)結(jié)果判定:若陽性細(xì)胞<10%為(-),≥10%則為(+)。Twist,Snail表達(dá)結(jié)果判定:陽性細(xì)胞<5%為(-),≥5%則為(+)。1.3統(tǒng)計(jì)分析方法本研究數(shù)據(jù)采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組數(shù)據(jù)陽性率(%)比較,采用秩和檢驗(yàn),相關(guān)性研究采用Spearman相關(guān)分析。以P<0.05示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1不同時(shí)間點(diǎn).e-cadhenin在慢性宮頸炎中的表達(dá)情況E-cadherin陽性信號(hào)定位于細(xì)胞膜。在慢性宮頸炎組中,E-cadherin于正常宮頸組織上皮細(xì)胞膜著色,細(xì)胞相鄰處呈連續(xù)線性、極性分布,并主要集中于基底層及大部分棘層細(xì)胞,呈較強(qiáng)的細(xì)胞膜表達(dá);在宮頸鱗癌組中,癌細(xì)胞膜著色淺淡,呈點(diǎn)狀、小灶性分布,部分癌組織甚至完全不著色。E-cadherin在慢性宮頸炎組、CINⅠ～Ⅲ組及宮頸鱗癌組中的陽性表達(dá)率分別為80.0%(16/20),68.8%(22/32),55.6%(15/27),51.4%(18/35)及39.3%(22/56),在慢性宮頸炎→CINⅠ～Ⅲ→宮頸鱗癌的發(fā)展中,E-cadherin陽性表達(dá)率呈遞減趨勢(shì),而且宮頸鱗癌組、CINⅢ組、CINⅡ組與慢性宮頸炎組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Vimentin陽性信號(hào)定位于細(xì)胞質(zhì)。Vimentin在慢性宮頸炎組中,正常宮頸組織鱗狀上皮層表達(dá)呈陰性或僅見單個(gè)細(xì)胞表達(dá),而在CINⅢ組及宮頸鱗癌組中,細(xì)胞質(zhì)Vimentin表達(dá)增強(qiáng)。Vimentin在慢性宮頸炎、CINⅠ～Ⅲ組及宮頸鱗癌組中的陽性表達(dá)率分別為0(0/20),6.3%(2/32),7.4%(2/27),31.4%(11/35)及32.1%(18/56),而且宮頸鱗癌組及CINⅢ組中的Vimentin的陽性表達(dá)率與慢性宮頸炎組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2.2snair陽性表達(dá)率Twist及Snail陽性信號(hào)定位于細(xì)胞質(zhì),部分定位于細(xì)胞核(圖1、圖2)。在慢性宮頸炎組、CINⅠ～Ⅲ組及宮頸鱗癌組,Twist陽性表達(dá)率分別為10.0%(2/20),28.1%(9/32),29.6%(8/27),42.9%(15/35)及64.3%(36/56);Snail陽性表達(dá)率分別為0(0/20),9.4%(3/32),22.2%(6/27),37.1%(13/35)及58.9%(33/56)。隨著宮頸病變加重,Twist及Snail的陽性表達(dá)率逐漸增強(qiáng),而且Twist及Snail在宮頸鱗癌組中的表達(dá)最強(qiáng),與慢性宮頸炎組及CINⅠ～Ⅲ組的陽性表達(dá)率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Twist在CINⅢ組的陽性表達(dá)率及Snail在CINⅡ組與Ⅲ組的陽性表達(dá)率,均顯著高于慢性宮頸炎組,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2.3snair表達(dá)陽性標(biāo)本中e-cadhenin表達(dá)的相關(guān)性CINⅠ～Ⅲ組及宮頸鱗癌組68例Twist呈陽性標(biāo)本中,47例E-cadherin表達(dá)呈陰性,Twist與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.373,P<0.05);55例Snail表達(dá)呈陽性標(biāo)本中,34例E-cadherin表達(dá)呈陰性,Snail與E-cadherin表達(dá)也呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.200,P<0.05),而E-cadherin與Vimentin之間的相關(guān)性不明顯(r=-0.125,P>0.05)。在CINⅢ組及宮頸鱗癌組標(biāo)本中,Twist與Vimentin的陽性表達(dá)呈明顯正相關(guān)(r=0.226,P<0.05),而Snail與Vimentin相關(guān)性不明顯(r=0.098,P>0.05)。3snail與cin表達(dá)的相關(guān)性腫瘤細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移和侵襲能力,是腫瘤由良性發(fā)展成為惡性的重要階段。EMT是指上皮細(xì)胞在特定生理和病理情況下,向間充質(zhì)細(xì)胞分化的現(xiàn)象,即在EMT發(fā)生過程中,表現(xiàn)為上皮細(xì)胞失去極性,黏附能力下降,遷移和運(yùn)動(dòng)能力增加,同時(shí)細(xì)胞表型發(fā)生改變。其中,最為常見的就是上皮標(biāo)志物E-cadherin基因蛋白下調(diào),間葉表型標(biāo)記物Vimentin表達(dá)上調(diào)及誘導(dǎo)EMT的一些轉(zhuǎn)錄因子,如Twist與Snail等亦表達(dá)上調(diào)。E-cadherin是一種鈣依賴性細(xì)胞黏附分子,普遍存在于各類上皮細(xì)胞中,在維持正常上皮細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞極性及組織結(jié)構(gòu)完整性中起重要作用。對(duì)身體多數(shù)部位發(fā)生的惡性上皮性腫瘤的研究表明,E-cadherin表達(dá)下調(diào)和功能喪失與腫瘤去分化、浸潤性生長及轉(zhuǎn)移等預(yù)后不良明顯相關(guān)。Vimentin是細(xì)胞骨架蛋白之一,特異性分布于間質(zhì)細(xì)胞中。若其在上皮源性腫瘤組織中過表達(dá),則可能與細(xì)胞生長分化狀態(tài)改變及細(xì)胞游走遷移有關(guān),是EMT的表現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示,隨著宮頸病變的進(jìn)展,E-cadherin陽性表達(dá)率呈遞減趨勢(shì),特別是在高級(jí)別CIN及宮頸鱗癌組織中的陽性率明顯低于正常結(jié)構(gòu)的宮頸組織,而且宮頸鱗癌組、CINⅢ組、CINⅡ組與慢性宮頸炎組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而E-cadherin與Vimentin之間相關(guān)性不明顯(r=-0.125,P>0.05)。宮頸癌組和CINⅢ組的Vimentin表達(dá)明顯增強(qiáng),而且宮頸鱗癌組及CINⅢ組中的Vimentin的陽性表達(dá)率與慢性宮頸炎組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此,在宮頸鱗狀上皮性病變發(fā)展過程中,E-cadherin表達(dá)下調(diào),Vimentin表達(dá)增強(qiáng),細(xì)胞間黏附力減弱,腫瘤細(xì)胞彼此離散,向間質(zhì)及周圍移動(dòng),可能是良性宮頸鱗狀上皮病變進(jìn)一步癌變的促進(jìn)因素。Snail屬于鋅指蛋白家族成員,是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子,本質(zhì)是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子,可通過結(jié)合E-cadherin啟動(dòng)子的E-box連接基序,而直接抑制E-cadherin表達(dá),進(jìn)而誘導(dǎo)EMT,促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展。免疫組化檢測人類多數(shù)腫瘤標(biāo)本中Snail蛋白發(fā)現(xiàn),Snail異常表達(dá)于卵巢癌、甲狀腺癌及惡性黑色素瘤等。體外實(shí)驗(yàn)構(gòu)建正義全長Snail真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入宮頸癌細(xì)胞系Hela及SiHa,可明顯抑制E-cadherin表達(dá),而Vimentin與Snail表達(dá)明顯上調(diào)。張儒英等采用免疫組化檢測發(fā)現(xiàn),Snail高表達(dá)于宮頸癌組織,其陽性率明顯高于CIN組織,并且隨著CIN級(jí)別升高,Snail表達(dá)越明顯。這與本研究通過基因定位的結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示,宮頸鱗癌中Snail陽性率顯著高于宮頸鱗狀上皮良性病變,并與E-caherin表達(dá)下調(diào)相關(guān),但Snail與Vimentin的相關(guān)性并不明顯(r=0.098,P>0.05),這可能與腫瘤發(fā)生發(fā)展階段、分化程度及其他不確定因素等有關(guān),認(rèn)識(shí)二者在促進(jìn)腫瘤形成中相互作用時(shí),應(yīng)結(jié)合其他臨床指標(biāo)綜合考慮。本研究結(jié)果顯示,Snail與E-cadherin表達(dá)也呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.200,P<0.05)。轉(zhuǎn)錄因子Twist是堿性螺旋-環(huán)-螺旋家族成員之一,廣泛表達(dá)于中胚層起源組織細(xì)胞,參與中胚層發(fā)育及形態(tài)形成。隨著對(duì)EMT生物學(xué)機(jī)制認(rèn)識(shí)的不斷深入,發(fā)現(xiàn)Twist也可通過抑制E-cadherin表達(dá)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞EMT。本研究結(jié)果顯示,Twist在宮頸癌中高表達(dá),同時(shí)伴隨E-cadherin表達(dá)下調(diào)及Vimentin表達(dá)上調(diào),Twist與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.373,P<0.05),而與Vimentin的陽性表