豬腸道擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬熒光定量檢測方法的建立

豬腸道擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬熒光定量檢測方法的建立

-擬桿菌屬的假列沃菌屬是假桿菌科的兩個屬。新梢菌屬以多個假桿菌為中心，不產(chǎn)生氨基酸，但產(chǎn)生氨基酸的口腔式假菌菌被歸類為purovoliplant菌屬。Ley等的研究發(fā)現(xiàn)肥胖鼠盲腸內(nèi)容物或肥胖人的糞便的擬桿菌門數(shù)量低于瘦鼠或瘦人,Backhed等對無菌鼠接種單一多形擬桿菌時,卻發(fā)現(xiàn)無菌鼠的體脂肪顯著增加,造成差異原因可能是擬桿菌門或單一的擬桿菌對肥胖反應的情況不一樣。脂肪型豬和瘦肉型豬的情況又如何,能否通過這些研究對豬脂肪沉積的調控提供一些線索,都有必要進行研究。豬后腸道中擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬在擬桿菌門中所占比例為66%,其中擬桿菌屬占17%,普雷沃氏菌屬占49%?？紤]到引物可將特異性的種屬擴增出來,并可將其定量,因此可選用主要的種屬作為擬桿菌門的代表來分析擬桿菌門的差異。本文以擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬作為豬腸道擬桿菌群的代表分析其在長白豬和太湖豬上的差異。本文建立了TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬群的方法,并對5月齡長白和太湖豬回腸內(nèi)容物的擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬群進行了定量檢測。1材料和方法1.1試驗材料1.1.1pcr擴增及測序熒光定量PCR擴增儀(Bio-Rad,iCycleriQ),核酸蛋白檢測儀(BeckmanCoulter,DU800),常規(guī)PCR擴增儀(Bio-Rad,Tetrad2),凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad,VersaDocModel2000),硅膠模型TMPCR產(chǎn)物純化試劑盒(北京賽百盛基因技術有限公司),DL2000DNAMarker(北京天為時代技術有限公司),熒光定量PCR試劑盒(TaKaRaEXTaqR-PCRVersion2.1)。1.1.2中間普雷沃菌tki多形擬桿菌(Bacteroidesthetaiotaomicron,CDC1404-A)和中間普雷沃菌(Prevotellaintermedia,ATCC25261)購自四川大學華西口腔醫(yī)院,以BHI瓊脂培養(yǎng)基(OXOID,英國)培養(yǎng);大腸桿菌、兩雙歧桿菌及乳酸桿菌參考菌株來自四川農(nóng)業(yè)大學臨床教研室,采用通瓊脂培養(yǎng)基(含葡萄糖)。1.1.3豬回腸干草種制備挑選剛出生的體重相近的長白和太湖豬各30頭,在相同環(huán)境條件下以相同日糧配方(無抗生素)飼喂,在年齡達到5月齡時,兩品種豬各屠宰4頭,采集回腸內(nèi)容物并測定體脂。1.2方法1.2.1從腸道內(nèi)容物和細菌中提取物質取菌液1mL,回腸內(nèi)容物0.1g,采用酚-氯仿法抽提DNA模板,所有樣品模板最終定容于30μL的TE中,-70℃保存?zhèn)溆谩?.2.2常規(guī)pcr檢測參照Lisa等報道,依據(jù)擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬內(nèi)種的16SrDNA基因序列設計擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬特異引物,上游引物為5′-GATTAGATACCCTGGTAGTCC-3′和下游引物為5′-CATGCAGCACCTTCACAA-3′,擴增片段大小268bp,以回腸內(nèi)容物的DNA為模板做常規(guī)PCR,并對產(chǎn)物測序。1.2.3熒光定量pcr根據(jù)1.2.2測定的片段序列結果,應用軟件PrimerExpress2.0設計擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬的熒光定量PCR引物與特異探針,通過電泳檢測PCR產(chǎn)物的正確性。參照TaKaRaEXTaqR-PCRVersion2.1熒光定量PCR說明書,采用25μL體系,其中加5×RealTimePCRBuffer(Mg2+)5μL,dNTPMixture(各10mol/L)0.75μL,上下游引物混合物(10mol/L)0.5μL,TaKaRaExTaqHS(5U/μL)0.25μL,模板1μL,加水至25μL;采用2步法,反應條件為95℃預變性3min;94℃變性30s,60℃退火、延伸、采集熒光30s,設置50個循環(huán)。分別對反應體系中Mg2+工作濃度和探針工作濃度進行優(yōu)化。1.2.4od620值的檢測以多形擬桿菌菌株(CDC1404-A)DNA為模板,用常規(guī)PCR引物擴增,將PCR產(chǎn)物經(jīng)割膠回收純化后的DNA作為標準品,用核酸蛋白檢測儀檢測OD260值,其拷貝數(shù)=50(μg/mL)×10-3×OD×N(阿佛加德羅常數(shù):6.02×1023分子/摩爾)/660(堿基對平均分子量)×268(擴增堿基數(shù))。以標準品為模板,以10倍梯度稀釋,取不少于5個稀釋梯度作為模板,按上述體系進行熒光定量PCR反應,構建絕對定量標準曲線。1.2.5實時熒光定量pcr敏感性檢測取1μL抽提的多形擬桿菌菌液基因組,10倍梯度稀釋作為模板并設陰性對照分析敏感性,按上述反應體系和條件進行熒光定量PCR反應,檢測實時熒光定量PCR敏感性。以乳酸桿菌、大腸桿菌和雙歧桿菌的基因組DNA模板作陰性細菌對照,以多形擬桿菌和和中間普雷沃菌的基因組為模板作為陽性對照,以去離子水作無模板對照,驗證擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬探針特異性。1.2.6實時熒光定量pcr反應將待測樣品DNA抽提液按與標準曲線制備時相同的反應體系和反應條件進行實時熒光定量PCR反應,每次實驗都設陰性對照和標準品校正,每個樣品都做3個平行復孔,以保證實驗數(shù)據(jù)的有效性。1.2.7豬背157段的脂肪率測定背膘厚度的測定:測量5月齡豬的左半胴體6~7肋骨處、肩部最后處、胸腰結合處和腰薦接合處的背膘厚度,4點平均值為豬的背膘厚度。脂肪率的測定:將左半胴體進行分割,分為骨骼、皮膚、瘦肉和脂肪組織。脂肪率=脂肪重/(瘦肉重+脂肪重+骨骼重+皮膚重)×100%。2結果2.1srrna的基因片段用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測常規(guī)PCR產(chǎn)物,結果擴增出長度為268bp特異性條帶見圖1。該PCR產(chǎn)物純化后(見圖1),測定的序列(上?；瞪锛夹g有限公司)結果如下:GATTAGATACCCTGGTAGTCCGCGCGGTAAACGATGGATGCTCGCTGTCAGCGATATACCGTTGGTGGCCAAGCGAAAGCGTTAAGCATCCCACCTGGGGAGTACGCCGGCAACGGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGAGGAACATGTGGTTTAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCCGGGCTTGAATTGCA此序列長為212bp,與GenBank中發(fā)表的多形擬桿菌(基因序列號為M58763)和中間普雷沃菌(基因序列號為AY323522)16SrDNA基因序列相比,該片段為多形擬桿菌的792—1003和中間普雷沃菌(基因序列號為AF414822)的763—974位堿基的片段,同源性分別為92%和94%。2.2反應片段大小根據(jù)2.1測序結果,設計熒光定量的上下游引物分別為5′-GGTGGCCAAGCGAAAGC-3′和5′-AGGAACATGTGGTTTAATTCGATG-3′,探針FAM-TACGCCGGCAACGGTGAAACTCA-TAMRA,擴增片段大小115bp。當Mg2+終濃度為5.0μmol/L、探針終濃度為0.24μmol/L時熒光信號最強,曲線斜率最大,PCR擴增效率最高。2.3考核出設備中copoes/l的發(fā)作濃度268bpPCR產(chǎn)物純化后經(jīng)電泳檢測呈清晰條帶,不含非特異性擴增帶(圖1),這保證了絕對定量的準確性。純化的PCR產(chǎn)物的OD260值為0.0673,計算出拷貝數(shù)濃度為1.19×1010copies/μL。采用1.19×102~1.19×106copies/μL這5個稀釋梯度進行定量PCR反應,由軟件IQTM5Opticalsystemversion1.0構建標準曲線(圖2),此標準曲線方程為Y=-3.200X+42.262(Y代表Ct,X代表logcop),相關系數(shù)為0.999,PCR循環(huán)效率為105.4%。2.4熒光定量pcr的靈敏度檢測多形擬桿菌菌液個數(shù)1.12×109個/mL,基因組定容于30μL的TE中,即3.73×107個/μL基因組,取1μL10倍梯度稀釋(3.73×10-1~3.73×106個/μL)作模板,檢測熒光定量PCR的靈敏性,如圖3示,從曲線可知道3.73個細菌仍有特征性曲線生長,說明該實時熒光定量具有較高的敏感性。2.5實時熒光定量pcr的檢測特異性TaqMan探針除了能夠特異性檢測擬桿菌和普雷沃氏菌外,對乳酸桿菌、大腸桿菌、雙歧桿菌及無模板對照組無熒光信號放出(圖4)。2.6實時熒光定量pcr檢測結果以每克內(nèi)容物為檢測單位,被檢測單位所提取的基因組最終定溶于30μL的TE中。FQ-PCR的標準曲線方程Y=-3.200X+42.262(Y代表Ct,X代表logcop),根據(jù)其線性范圍1.19×102~1.19×106copy/μL,確定1μL模板檢測的logcop范圍2.08~6.08,則30μL定容模板的logcopy檢測結果在3.55~6.35范圍內(nèi)。每份樣品所含拷貝數(shù)都可通過Ct值與標準曲線比較得到,實時熒光定量PCR儀直接給出定量結果(表1)。結果每克回腸內(nèi)容物擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬數(shù)量的拷貝數(shù)對數(shù)值,長白豬為4.05±0.24,太湖豬為5.61±0.66,太湖豬比長白豬高38.5%(P<0.10)。由表1可知,5月齡太湖豬的背膘厚度和脂肪率與長白豬的差異達到了顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)水平。2.7普雷沃氏菌群與脂肪率的關系對各頭豬的擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬群數(shù)量與相應的背膘厚度、脂肪率進行線性相關統(tǒng)計分析,發(fā)現(xiàn)擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬群數(shù)量與背膘厚度之間(r=0.83,P<0.05)及與脂肪率之間(r=0.71,P=0.11)有正相關關系。3討論3.1ssr熒光定量檢測由于16SrD-NA屬內(nèi)及屬間高度的同源性,加大了擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬特異性引物的設計難度。本文在GenBank中下載豬擬桿菌屬內(nèi)12種細菌和普雷沃氏菌屬內(nèi)18種細菌的16SrDNA序列,應用CLUSTALX同源性比較軟件進行同源性比較,其同源段再與豬腸道其他3種優(yōu)勢菌(大腸桿菌、乳酸桿菌及雙歧桿菌)屬間序列比較,篩選出擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬特異序列,根據(jù)此片段設計了一對常規(guī)引物,對該引物擴增片段測定序列后,根據(jù)測定的序列設計了熒光定量特異引物。探針的特異性檢測表明,該探針只能與本菌屬的代表菌株特異性結合并釋放出熒光,而與腸道中其他優(yōu)勢菌屬的代表菌株呈陰性反應,表明所設計的探針具有良好特異性;在探針的敏感性方面,TaqMan探針敏感性為3.73個/μL。3.2標準品的驗證本實驗是以多形擬桿菌(CDC1404-A)的DNA作為模板,用常規(guī)引物做PCR,將此PCR產(chǎn)物回收純化后作為DNA標準品。2.3的結果表明,制備的標準品正確,回收產(chǎn)物均達到了1010copies/μL的拷貝濃度,表明具有良好的回收效率。由定量標準曲線可見,擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬標準曲線其初始模板濃度與Ct值之間呈較好的線性關系,其相關系數(shù)均為0.999,PCR擴增效率為105.4%,連續(xù)濃度梯度之間Ct值之差在3.30左右,符合10倍梯度稀釋的熒光曲線規(guī)律。3.3肥度和肉中擬桿菌數(shù)量本實驗利用實時熒光定量PCR技術對長白和太湖豬回腸內(nèi)容物中的擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬進行定量分析,發(fā)現(xiàn)檢測結果均成陽性,說明此技術對豬腸道內(nèi)擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬進行定量分析是可行的。本研究發(fā)現(xiàn)太湖豬回腸內(nèi)容物擬桿菌屬數(shù)量高于長白豬,隨著背膘厚度和脂肪率的增加,擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬群細菌數(shù)量呈增加趨勢,這一結果與劉祥等在人的研究結果一致,他發(fā)現(xiàn)肥胖人的糞便中擬桿菌屬數(shù)量(傳統(tǒng)培養(yǎng)計數(shù)方法測定)顯著高于瘦人。但與Ley等的結果不一致。分析其原因,其一,擬桿菌門、屬或單一的擬桿菌種與肥度相關性可能不一致;其二,不同腸段(回腸和盲腸)擬桿菌數(shù)量與胴體肥度的相關性可能不相同;其三,豬腸道擬桿菌組成不同于人和鼠,豬后腸擬桿菌主要由