天蠶素抗菌肽對海蘭褐蛋用仔雞血液免疫指標(biāo)和腸道菌群的影響

天蠶素抗菌肽對海蘭褐蛋用仔雞血液免疫指標(biāo)和腸道菌群的影響

現(xiàn)在，隨著傳統(tǒng)抗生素抗劑性的增多，抗劑性疾病的日益嚴(yán)重，導(dǎo)致動物體的免疫水平降低，并在動物和環(huán)境中殘留大量殘留，危害水產(chǎn)養(yǎng)殖的健康發(fā)展，影響人類食品安全、抗生素資源的利用和生物環(huán)境的開發(fā)。因此，綠色安全、高效、無殘留的抗生素產(chǎn)品的開發(fā)已成為必然趨勢。天蠶素抗菌肽是最早發(fā)現(xiàn)于惜古比天蠶蛹血淋巴細(xì)胞中的動物源抗菌肽,目前發(fā)現(xiàn)的大約有89種,它廣泛存在于生物體內(nèi),具有分子質(zhì)量小、水溶性好、熱穩(wěn)定性強(qiáng)等特點(diǎn),而且呈堿性,具有很強(qiáng)的陽離子特征,且對較低或較高的pH和較強(qiáng)的離子強(qiáng)度都有一定抗性作用。抗菌肽的作用靶點(diǎn)是細(xì)胞膜,通過在細(xì)菌細(xì)胞膜上穿孔形成孔道,造成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞引起細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏導(dǎo)致電化學(xué)勢的喪失,從而使靶細(xì)胞死亡而達(dá)到抗菌的效果。因其作用于結(jié)構(gòu)而非功能上,因此不易產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性,其作為一種新型的抗生素替代品具有廣闊的應(yīng)用前景。前人對天蠶素抗菌肽的研究主要集中在分離純化與鑒定以及抗微生物活性等方面,在動物生產(chǎn)方面的應(yīng)用較少。尤其是在蛋用仔公雞上的應(yīng)用,目前鮮有報道。在動物飼糧中分別添加適量抗生素和不同水平抗菌肽,研究兩者對蛋用仔公雞各試驗指標(biāo)的不同影響,進(jìn)一步比較抗生素與抗菌肽之間的優(yōu)劣性,以及其在畜禽飼糧中添加效果及適宜添加量的確定有待于進(jìn)一步研究。本文旨在通過在海蘭褐蛋用仔公雞飼糧中添加不同水平天蠶素抗菌肽,研究其對蛋用仔公雞血液免疫指標(biāo)和腸道菌群的影響,為進(jìn)一步指導(dǎo)生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1試驗材料試驗所用天蠶素抗菌肽由國家飼料工程技術(shù)研究中心研制,北京中農(nóng)穎泰生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。試驗所用抗生素為金霉素。1.2雞群的飼養(yǎng)及護(hù)理選用336只1日齡健康的海蘭褐蛋用仔公雞(購自北京農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院種雞場),平均體重為(39.14±0.17)g,3層籠養(yǎng),試驗雞只自由采食飲水,其他免疫和消毒措施遵照雞場正常程序進(jìn)行,每天觀察雞群健康狀況,并記錄試驗數(shù)據(jù)。飼養(yǎng)試驗在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院南口中試基地雞舍進(jìn)行。1.3各組初始體重比較見表1將336只1日齡海蘭褐蛋用仔公雞隨機(jī)分為7組,分別為基礎(chǔ)飼糧組(對照組)、基礎(chǔ)飼糧+150mg/kg金霉素組(抗生素組)、基礎(chǔ)飼糧+150mg/kg抗菌肽組(抗菌肽Ⅰ組)、基礎(chǔ)飼糧+200mg/kg抗菌肽組(抗菌肽Ⅱ組)、基礎(chǔ)飼糧+250mg/kg抗菌肽組(抗菌肽Ⅲ組)、基礎(chǔ)飼糧+300mg/kg抗菌肽組(抗菌肽Ⅳ組)、基礎(chǔ)飼糧+350mg/kg抗菌肽組(抗菌肽Ⅴ組),每組4個重復(fù),每個重復(fù)12只雞,各處理初始體重差異不顯著(P>0.05)。飼養(yǎng)試驗期為42d。1.4試驗飼料以玉米-豆粕型飼糧為基礎(chǔ)飼糧,按NY/T33—2004雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。1.5指標(biāo)測定1.5.1血漿溶菌酶活性測定于試驗第42天,每個重復(fù)隨機(jī)選取2羽雞,心臟采血5mL/只,3000r/min離心10min,分離血漿,用移液槍吸出分裝于Eppendorf管后置于-20℃冰柜中保存,用于測定血漿溶菌酶、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、補(bǔ)體3(C3)、補(bǔ)體4(C4)含量。IgA、IgG、IgM含量采用放射免疫分析法進(jìn)行測定,采用雞專用試劑盒。C3、C4含量采用酶聯(lián)免疫試劑盒雙抗體夾心法測定,用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(OD)值,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中C3、C4含量。溶菌酶含量采用免疫比濁法,試劑盒購于北京康源瑞得生物技術(shù)有限公司。1.5.2稀釋液的稀釋和雙歧桿菌的培養(yǎng)于試驗第42天,每個重復(fù)中隨機(jī)選取2羽雞進(jìn)行屠宰,在回腸和盲腸接口處用細(xì)線緊緊結(jié)扎(保持盲腸內(nèi)容物與外界隔絕,以防污染),然后將扎口的盲腸取下,液氮保存,放置于-80℃冰箱中保存,用于測定內(nèi)容物中大腸桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)量。試驗時,將盲腸段置于常溫下自然解凍,無菌操作臺內(nèi)稱取0.5g食糜于離心管中,加入已滅菌生理鹽水4.5mL,置于渦旋振蕩器上充分振蕩混合均勻,依次10倍遞比稀釋至1×10-7,預(yù)試驗選擇3個合適的稀釋度。選擇稀釋度為1×10-1~1×10-3盲腸內(nèi)容物稀釋液,取20μL稀釋液接種到麥康凱培養(yǎng)基中進(jìn)行大腸桿菌培養(yǎng)。選擇1×10-2~1×10-4的稀釋度,取20μL稀釋液接種到MRS培養(yǎng)基中,在厭氧管中通入氮?dú)膺M(jìn)行乳酸桿菌培養(yǎng)。選擇1×10-3~1×10-5的稀釋度,取20μL稀釋液接種到改良MRS培養(yǎng)基中,進(jìn)行雙歧桿菌培養(yǎng)。培養(yǎng)皿用封口膜密封,大腸桿菌37℃恒溫培養(yǎng)24h,乳酸桿菌、雙歧桿菌37℃恒溫培養(yǎng)36h,取出計數(shù)。采用活菌計數(shù)法測定,所有步驟按微生物操作規(guī)程進(jìn)行。1.6分析并進(jìn)行多重比選,顯著推動anoa顯著性分析并進(jìn)行多重比較,表面活性劑的選擇利用,進(jìn)行多重比較,選擇合適的重利用Excel軟件對各重復(fù)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,采用SPSS17.0軟件ANOVA進(jìn)行顯著性分析,并采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。測定結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。2結(jié)果2.1抗菌酶對蛋用雞的血液免疫指標(biāo)的影響2.1.1抗菌肽對iga和igg含量的影響由表2可知,在IgA含量上,抗菌肽Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組與對照組和抗生組差異不顯著(P>0.05),抗菌肽Ⅳ、Ⅴ組顯著高于對照組和抗生素組(P<0.05),且與抗菌肽Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組差異顯著(P<0.05)?？咕蘑踅MIgA含量最高,較對照組和抗生素組分別提高了21.22%和17.12%。在IgG含量上,抗生素組及抗菌肽組均顯著高于對照組(P<0.05),抗菌肽Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組顯著高于抗生素組(P<0.05),抗菌肽Ⅰ組與抗生素組差異不顯著(P>0.05)?？咕蘑踅M顯著高于抗菌肽Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組(P<0.05),抗菌肽Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組顯著高于抗菌肽Ⅰ組(P<0.05)?？咕蘑踅MIgG含量較對照組和抗生素組分別提高了67.20%和34.48%。在IgM含量上,各組之間差異不顯著(P>0.05)。2.2.2各組患者ct、溶菌酶含量比較由表3可知,在C3含量上,各抗菌肽組均顯著高于對照組和抗生素組(P<0.05),且抗菌肽Ⅳ、Ⅴ組顯著高于抗菌肽Ⅰ、Ⅱ組(P<0.05)?？咕蘑?、Ⅴ組C3含量較高,較對照組分別提高了77.36%和81.01%,較抗生素組分別提高了57.18%和60.41%。在溶菌酶含量上,抗生素組及抗菌肽Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組顯著高于對照組(P<0.05),分別比對照組提高了28.89%、28.91%、44.46%、48.90%?？咕蘑瘛ⅱ蚪M與對照組之間差異不顯著(P>0.05)?？咕蘑?、Ⅳ、Ⅴ組溶菌酶含量與抗生素組相比均有提高,但差異不顯著(P>0.05)。2.3各組盲腸雙歧桿菌數(shù)量的比較由表4可知,對大腸桿菌數(shù)量的影響,各抗菌肽組與對照組相比顯著降低(P<0.05),且抗生素組顯著低于對照組(P<0.05),抗菌肽Ⅰ、Ⅱ組與抗生素組差異不顯著性(P>0.05),抗菌肽Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組顯著低于抗生素組(P<0.05),抗菌肽Ⅳ、Ⅴ組顯著低于抗菌肽Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組(P<0.05)。抗菌肽Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組盲腸大腸桿菌數(shù)量分別比對照組降低了6.42%、8.51%和8.83%,比抗生素組降低了3.48%、5.63%和5.96%。對雙歧桿菌數(shù)量的影響,抗菌肽Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組和抗生素組顯著高于對照組(P<0.05),抗菌肽Ⅳ、Ⅴ組顯著高于抗生素組和抗菌肽Ⅰ、Ⅱ組(P<0.05),但與抗菌肽Ⅲ組差異不顯著(P>0.05)?？咕蘑?、Ⅴ組盲腸雙歧桿菌數(shù)量與對照組相比分別提高了4.72%、4.87%,與抗生素組相比分別提高了2.16%、2.30%。對乳酸桿菌數(shù)量的影響,抗菌肽Ⅳ、Ⅴ組顯著高于對照組(P<0.05),各抗菌肽組與抗生素組差異不顯著(P>0.05),但隨著飼糧中抗菌肽添加量的不斷增加,乳酸桿菌數(shù)量呈一定的增長趨勢,抗菌肽Ⅳ、Ⅴ組顯著高于抗菌肽Ⅰ、Ⅱ組(P<0.05)。抗菌肽Ⅳ、Ⅴ組盲腸乳酸桿菌數(shù)量與對照組相比分別提高了2.30%、2.68%,與抗生素組相比分別提高了1.14%、1.52%。3討論3.1各組日金融平均日攝食量、料重比以及料重比的比較劉莉如等研究了飼糧添加不同水平抗菌肽對蛋用仔公雞生長性能的影響,結(jié)果表明,抗菌肽Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組與對照組相比,平均日采食量顯著降低,各抗菌肽組之間平均日采食量差異不顯著。各組平均日增重差異不顯著。抗菌肽Ⅳ、Ⅴ組與對照組相比,料重比顯著降低,但各抗菌肽添加組與抗生素組之間料重比差異不顯著。這說明飼糧中添加不同水平天蠶素抗菌肽可在不同程度上提高蛋用仔公雞的生長性能。3.2抗菌肽對免疫調(diào)節(jié)的影響體液免疫是動物特異免疫的一個重要方面,抗體對病原體及毒素的中和作用、免疫調(diào)理、吞噬作用以及抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用都與免疫球蛋白水平有密切關(guān)系,免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM等)是介導(dǎo)體液免疫的主要抗體,也是衡量機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)。IgA主要由漿細(xì)胞產(chǎn)生,分為血清型和分泌型。血清型IgA具有多種抗體活性,包括抗菌、抗毒素、抗病毒等作用。IgG是血清中含量最高的免疫球蛋白,約占其總量的75%。IgG是抗感染的主要抗體,可通過經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體,對細(xì)胞性抗原可產(chǎn)生抗體依賴性的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒(AD-CC)作用及調(diào)理作用。IgM主要由淋巴組織和脾臟中的B細(xì)胞產(chǎn)生,為B細(xì)胞表面表達(dá)最早的抗體,在機(jī)體感染早期起主要作用。C3和C4是補(bǔ)體系統(tǒng)的主要成分,在抵抗微生物感染方面起重要作用,激活后具有免疫調(diào)節(jié)、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、中和毒素、免疫復(fù)合物溶解和清除等重要的生物學(xué)效應(yīng)。溶菌酶是巨噬細(xì)胞活化時釋放的一種水解酶,通過降解細(xì)菌多糖細(xì)胞壁殺滅細(xì)菌,檢測血漿溶菌酶含量可以評價動物機(jī)體的免疫狀態(tài)。Robert等研究報道,抗菌肽可以防止感染擴(kuò)散,提高體內(nèi)IgG含量。王阿榮研究表明,飼糧中添加適量的天蠶素抗菌肽對血清總蛋白、白蛋白、球蛋白含量無顯著影響,但能夠降低斷奶仔豬血清尿素氮的含量,提高血清IgG含量,最適添加量為320g/t。鄭云峰等在斷奶仔豬基礎(chǔ)飼糧中添加飼料肽產(chǎn)品,結(jié)果表明,2%添加量組IgG含量顯著高于其他各組。王靜的研究結(jié)果表明,飼糧中添加不同水平抗菌肽粗提品能顯著提高肉雞21日齡血清C3、C4含量和35日齡C3與溶菌酶含量。本試驗中,飼糧中添加不同水平的抗菌肽可提高蛋用仔公雞血液中IgA、IgG、溶菌酶和C3含量,并且隨著添加量的增加,各血液指標(biāo)表達(dá)水平有逐漸上升趨勢。這與上述研究報道等一致,說明在蛋用仔公雞飼糧中添加天蠶素抗菌肽可在一定程度上提高機(jī)體的體液免疫功能,增強(qiáng)機(jī)體免疫力。本試驗中,各組IgM、C4含量差異不顯著,這同王靜的研究結(jié)果不一致,可能是由于雞的品種、日齡、飼養(yǎng)環(huán)境、試驗時間、動物機(jī)體狀態(tài)不同等原因?qū)е碌摹?.3抗菌肽對雞腸道微生物微生態(tài)的影響腸道微生物能對營養(yǎng)、免疫、疾病防治以及生理功能的發(fā)揮產(chǎn)生重要影響,進(jìn)而影響雞的生長和健康。倪學(xué)勤等采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)相結(jié)合的方法對腸道內(nèi)容物菌群16SrDNAV3區(qū)所繪的PCR-DGGE指紋圖譜進(jìn)行分析,結(jié)果表明,蛋雞消化道不同部位細(xì)菌的組成都不一樣,盲腸內(nèi)細(xì)菌種類在不同周齡蛋雞中均表現(xiàn)最豐富,其次是回腸,而空腸、嗉囊和十二指腸細(xì)菌種類相對比較少。在畜禽小腸中微生物數(shù)量最高的部位在盲腸,盲腸內(nèi)容物pH為5.1~7.0,且具有較高的營養(yǎng)價值,在代謝過程中意義重大。盲腸是雞消化道微生物活動最大的器官,雖然目前對雞盲腸微生物微生態(tài)學(xué)的研究遠(yuǎn)沒有反芻動物瘤胃和豬后腸微生物微生態(tài)學(xué)的研究深入,但是研究盲腸內(nèi)容物中微生物的正常腸道菌群,對防治腸道感染疾病具有很高的實用價值。張熠等報道在飼糧中添加外源性抗菌肽能抑制病原菌,而對腸道正常菌群和機(jī)體細(xì)胞則無殺傷作用。陳曉生等試驗結(jié)果表明,不同抗菌肽添加水平對肉鴨雛鴨期腸道內(nèi)大腸桿菌、乳酸桿菌均有顯著抑制作用,與金霉素相比,抗菌肽對大腸桿菌的抑殺效果更好。王靜在肉雞飼糧中添加不同水平抗菌肽,結(jié)果表明,抗菌肽能夠降低21、35日齡肉雞腸道大腸桿菌數(shù)量,300mg/kg添加水平能提高肉雞35日齡腸道乳酸桿菌群數(shù)量,效果優(yōu)于抗生素組。李麗在飼糧中分別添加不同水平抗菌肽,結(jié)果表明,抗菌肽能夠降低腸道食糜中有害的大腸菌群的數(shù)量,而對有益的乳酸菌菌群數(shù)量有提高趨勢。本試驗在飼糧中添加不同水平抗菌肽均能有效降低腸道致病菌大腸桿菌數(shù)量,尤其是高劑量抗菌肽組能顯著增加腸道益生菌雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量,與上述報道結(jié)果基本一致,這說明抗菌肽可有效調(diào)控腸道菌群平衡,可以調(diào)節(jié)腸道不同菌群的數(shù)量,改善腸道的微生態(tài)環(huán)境,有利于蛋雛雞腸道微生態(tài)平衡的迅速建立和維持,對維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)意義重大。陳曉生等的研究發(fā)現(xiàn),將蠶抗菌肽AD-酵母液體制劑直接