豬源乳酸桿菌對豬源乳酸桿菌的體外細胞粘附特性研究

豬源乳酸桿菌對豬源乳酸桿菌的體外細胞粘附特性研究

乳酸桿菌是人類和動物腸道的重要生理細菌。在與腸道粘膜上的上皮細胞結合后，它被固定并形成了一個穩(wěn)定的菌群。它具有抗病原體、營養(yǎng)和免疫等作用，在維持腸道菌群的結構和功能方面發(fā)揮著重要作用。目前對其生物屏障功能的認識較為深入,據(jù)此研制的益生菌制劑(Probiotics)在腸道感染性疾病的生態(tài)防治上取得了很好的效果,并已應用于臨床治療?，F(xiàn)在認為,粘附是細菌與宿主之間存在的一種普遍現(xiàn)象,它是細菌定殖于宿主細胞并發(fā)揮生理作用的首要條件。有關乳酸菌粘附的特點和機制正成為益生菌研究的熱點,很多研究報道了乳酸桿菌、雙歧桿菌對人體細胞的粘附作用,以及應用乳酸桿菌改善腸道生物屏障,減少細菌性感染的發(fā)生。但國內外均未見采用豬腸道上皮細胞研究豬源乳酸桿菌粘附作用的報道。鼠傷寒沙門氏菌是引起豬發(fā)病和食物源性污染的重要微生物,每年的感染數(shù)量大約占全世界沙門氏菌感染量的17%,其耐藥性的增加,給該病的防治帶來更大的難度,日益受到養(yǎng)殖業(yè)和食品業(yè)的重視。為了系統(tǒng)地探討乳酸桿菌粘附后的生物保護作用,本研究采用豬腸道上皮細胞IPEC-J2為實驗模型,探討乳酸桿菌粘附特點,以及是否具有抑制鼠傷寒沙門氏菌DT104粘附和侵襲的作用,為乳酸桿菌對腸粘膜屏障的生物保護作用提供實驗依據(jù),并為養(yǎng)豬生產中有效控制沙門氏菌病提供新的思路。1材料方法1.1鼠傷寒沙門氏菌來源豬源乳酸桿菌9株,分離自健康仔豬糞樣,體外培養(yǎng)時對致病性大腸桿菌和沙門氏菌有抑制作用,16SrRNA測序鑒定為乳酸桿菌屬(另文報道)。鼠傷寒沙門氏菌DT104加拿大農業(yè)部食品研究所保存。IPEC-J2是出生后24h內仔豬的空腸上皮細胞,堪薩斯州立大學Bruce博士贈送,試驗中使用44～60代細胞。1.2細胞培養(yǎng)液的制備在75cm2細胞培養(yǎng)瓶(CorningInc.,CorningNY,USA)中,采用含10%小牛血清(Gibco-BRL)和1%抗生素的DMEM:F12(Gibco)培養(yǎng)液培養(yǎng)IPEC-J2,隔1天換1次培養(yǎng)液,80%融合時用0.1%胰酶-EDTA(Gibco)消化傳代到12孔細胞培養(yǎng)板(CorningInc.,Corning,NY,USA),每孔加2×105～4×105個細胞,培養(yǎng)液中除不含抗生素外,其它成分同傳代細胞培養(yǎng)液,37℃、5%CO2、95%濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h備用。1.3菌液的制備乳酸桿菌活化2代后接種MRS培養(yǎng)液(Difco)厭氧培養(yǎng)18h,用PBS(pH7.4)緩沖液(Gibco)洗一次,然后用不含抗生素的DMEM:F12培養(yǎng)液10倍系列稀釋成109CFU/mL、108CFU/mL和107CFU/mL的菌液待用?；罨氖髠抽T氏菌接種于含40mmol/LNaHCO3(Sigma)的BHI培養(yǎng)液(Difco)37℃培養(yǎng)16h～18h備用。1.4菌落粘連活性檢測培養(yǎng)24h的細胞用PBS(pH7.4)緩沖液洗1次每孔加入稀釋的乳酸桿菌培養(yǎng)液0.5mL,37℃培養(yǎng)1h,用PBS緩沖液洗5次,去除未粘附的細菌,然后每孔加入0.5mL含0.05%TritonX-100(Sigma)的PBS(pH7.4)緩沖液,室溫下作用5min,用吸管反復吹打,分散細菌。10倍系列稀釋后用MRS平板計數(shù)乳酸桿菌活菌數(shù)。同時將另一部分細胞用70%甲醇固定10min,然后用4%姬姆薩氏染液染色,倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和細菌粘附狀態(tài)。每個菌株做3個重復,并在3個不同代的細胞中重復3次試驗。以下試驗均同樣做3次重復。1.5鼠傷寒沙門氏菌培養(yǎng)每孔細胞中同時加入0.5mL含不同濃度乳酸桿菌的細胞培養(yǎng)液和107CFU鼠傷寒沙門氏菌,同時設只加鼠傷寒沙門氏菌的對照組,37℃培養(yǎng)1h后,采用1.4方法,用TSB(Difco)平板計數(shù)鼠傷寒沙門氏菌活菌數(shù)。乳酸桿菌對鼠傷寒沙門氏菌粘附的抑制率：(對照組鼠傷寒沙門氏菌數(shù)–乳酸桿菌組鼠傷寒沙門氏菌數(shù))/對照組鼠傷寒沙門氏菌數(shù)×100。1.6鼠傷寒沙門氏菌活菌數(shù)測定每孔細胞中加入0.5mL含不同濃度乳酸桿菌的細胞培養(yǎng)液,同時設不加乳酸桿菌對照組,37℃培養(yǎng)1h,用PBS緩沖液洗3次,去除沒有粘附的乳酸桿菌,然后每孔加入含107CFU鼠傷寒沙門氏菌的細胞培養(yǎng)液,再培養(yǎng)1h,采用1.5方法,計數(shù)鼠傷寒沙門氏菌活菌數(shù)。計算乳酸桿菌對鼠傷寒沙門氏菌粘附的排斥率。1.7鼠傷寒沙門氏菌培養(yǎng)時間每孔細胞中加入0.5mL細胞培養(yǎng)液和107CFU鼠傷寒沙門氏菌,37℃培養(yǎng)1h,用PBS緩沖液洗3次,去掉沒有吸附的鼠傷寒沙門氏菌,然后每孔加入0.5mL含不同濃度乳酸桿菌的細胞培養(yǎng)液,同時設不加乳酸桿菌對照組,再培養(yǎng)1h,采用1.5方法,計數(shù)鼠傷寒沙門氏菌活菌數(shù)。計算乳酸桿菌對鼠傷寒沙門氏菌粘附的置換率。1.8細菌分離培養(yǎng)細胞采用1.6方法先后加入0.5mL含108CFU乳酸桿菌或107CFU沙門氏菌的細胞培養(yǎng)液,培養(yǎng)結束,去除表面未粘附的細菌,每孔細胞中加入0.5mL含50μg/mL慶大霉素(Sigma)的細胞培養(yǎng)液,再培養(yǎng)1h,殺滅細胞表面粘附的細菌。洗滌去除抗生素后采用1.5方法,計數(shù)細胞內鼠傷寒沙門氏菌活菌數(shù)。計算乳酸桿菌對鼠傷寒沙門氏菌侵入作用的抑制率。1.9處理數(shù)據(jù)所得數(shù)據(jù)用Excel和SPSS10.0進行計算和分析。兩組間比較采用t檢驗,結果用x±s表示。2結果2.1乳酸桿菌nac對ipec-j2細胞上的粘連菌數(shù)表1所有9株乳酸桿菌對IPEC-J2細胞的粘附特性都不完全相同,顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)S66、S20和S8菌株對IPEC-J2細胞有一定的破壞作用,其余菌株對細胞的完整性沒有任何影響。但是,各菌株的粘附菌數(shù)均依賴于加入的乳酸桿菌濃度,隨著添加濃度的提高,粘附細菌數(shù)量增加(圖1),粘附率在0.1%～10%之間。其中S65的粘附效果最好,即使只加入107CFU/孔,粘附細菌數(shù)量也可達到106CFU以上。2.2鼠傷寒沙門氏菌的篩選結果9株乳酸桿菌對鼠傷寒沙門氏菌的競爭粘附作用都具有濃度效應,高濃度109CFU/孔添加量的競爭效果最好,尤其是K30、K67、K16三個菌株,對鼠傷寒沙門氏菌粘附作用的抑制率在80%以上(圖2)。S33、S65菌株在中、低濃度添加時也具有較好的競爭效果,抑制率在30%以上。所以后續(xù)試驗選擇這5株菌進行。2.3濃度依賴關系除K16外,其余4株乳酸桿菌對鼠傷寒沙門氏菌細胞粘附的排斥效應均有濃度依賴性(圖3)。高濃度S33菌株的排除率達到70%,其余4株菌排除率在40%左右。隨著濃度降低,乳酸桿菌S33、K30和K67的排斥作用顯著下降。不同濃度的乳酸桿菌S65和K16的排斥作用差異不顯著。2.4低濃度添加時沙門氏菌的粘連率5株乳酸桿菌對鼠傷寒沙門氏菌的置換作用具有濃度效應(圖4)。高濃度S33和K30對沙門氏菌的粘附具有較好的置換作用,置換率分別為84%和45%,但是,低濃度添加時,對沙門氏菌不僅沒有置換作用,反而增加了沙門氏菌的粘附率。高、中、低3個濃度的K67和K16均對沙門氏菌有一定的置換作用,置換率在7%～65%之間,而不同濃度的S65菌株對沙門氏菌的置換率均低于15%,標準差很大。2.5受試乳酸桿菌對沙門氏菌侵入細胞的抑制作用按乳酸桿菌與沙門氏菌10:1比例將乳酸桿菌與沙門氏菌先后添加到IPEC-J2細胞上孵育,受試乳酸桿菌對沙門氏菌侵入細胞的能力均有一定的抑制作用,抑制率在23%～33%之間(圖5)。而單獨加入沙門氏菌107CFU/孔,侵入細胞內的細菌數(shù)量是粘附于細胞上的細菌數(shù)量的10%。3乳酸桿菌競爭抑制沙門氏菌粘連的作用機理因為直接研究細菌在體內的粘附過程比較困難,所以,腸道細胞的體外培養(yǎng)模型通常用于評價細菌的粘附特性。很多研究報道了乳酸桿菌對人體細胞的粘附作用,如Caco-2、Lovo、T84、HCT-8、Intestine-407等細胞。但是,因為種屬的不同,采用人體細胞系研究豬源有益微生物和病原菌粘附作用,與其在豬體內的狀態(tài)可能存在一定差異。2006年Schierack等采用豬腸道上皮細胞IPEC-J2作為實驗模型,系統(tǒng)地研究了病原菌的感染過程,證明IPEC-J2細胞能夠很好地反映豬消化道的感染和反應過程,是目前模擬豬體內試驗的最佳體外模型。本研究率先采用該細胞考察豬源乳酸桿菌對腸上皮細胞的粘附作用,可以更加準確地反映乳酸桿菌在豬體內的粘附過程。乳酸桿菌對腸上皮細胞的粘附作用具有種屬和菌株特異性。在本試驗中發(fā)現(xiàn),9株豬源乳酸桿菌均能粘附于腸上皮細胞IPEC-J2表面,但各菌株的粘附力存在差異,這與Gueimonde等的研究結果相似。該結果表明,在選擇乳酸桿菌菌株時,有必要建立適當?shù)姆椒?篩選具有高粘附力的菌株?，F(xiàn)在已知,正常菌群定植在上皮細胞表面,主要是通過與細胞膜上纖維狀多糖體或脂蛋白的作用實現(xiàn)的。本研究中9株乳酸桿菌的粘附機制尚需要進一步研究。同時,粘附也是感染性細菌致病的第一步,對病原菌粘附的抑制可干擾細菌對細胞的侵襲。乳酸桿菌與鼠傷寒沙門氏菌同時加入細胞孵育時,9株乳酸桿菌對病原細菌的粘附均具有很好的競爭抑制作用,高濃度乳酸桿菌抑制率在61%～88%之間,抑制效果與乳酸桿菌菌株有關。Gueinonde等將3株乳酸桿菌分別與艱難梭菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、單核李氏桿菌等同時加入Caco-2細胞培養(yǎng)液中孵育,也發(fā)現(xiàn)抑制作用與乳酸桿菌和病原菌菌株相關。Bernet等用同位素標記腸道病原菌,分別和不同濃度的雙歧桿菌競爭粘附CaCo-2細胞,發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌能抑制ETEC、EPEC、彌散性粘附的大腸桿菌(DAEC)、假結核耶菌及傷寒桿菌對CaCo-2細胞的粘附,這種抑制作用具有濃度效應,他們還發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌能抑制EPEC、假結核耶氏菌及傷寒桿菌對CaCo-2細胞的破壞和入侵。Blomberg等發(fā)現(xiàn)乳桿菌耗盡上清中含有一種蛋白質樣物質,能抑制EPECK88株對豬回腸粘液的粘附。另有研究表明,乳桿菌或其細胞壁成分粘附于人類泌尿道上皮細胞后,能競爭性地抑制大腸桿菌、肺炎桿菌及綠膿桿菌的粘附,由于這些細菌的粘附素受體不同,乳桿菌可能是通過妨礙受體的空間結構而發(fā)揮抑制作用。本研究中乳酸桿菌競爭抑制沙門氏菌粘附的作用機理尚需要深入研究。有益細菌對病原菌粘附的抑制作用還具有時間效應。Lee和Sherman等分別報道了乳酸桿菌對病原細菌粘附的排斥和置換作用。我們也進一步研究了IPEC-J2粘附體系加入乳酸桿菌孵育1h后再加入沙門氏菌共同孵育,以及按相反順序加入兩種細菌,觀察粘附抑制效果。發(fā)現(xiàn)先加入高濃度乳酸桿菌,后加入沙門氏菌,其粘附數(shù)降低31%～71%相反順序加入時下降12%～84%,證明高濃度的乳酸桿菌無論先后加入均能抑制沙門氏菌對IPEC-J2細胞的粘附。有趣的是低濃度乳酸桿菌S33和K30對沙門氏菌不僅沒有置換作用,反而增加了沙門氏菌的粘附率。Tuomola和Collado等也分別報道過乳酸桿菌和雙歧桿菌對病原菌粘附的促進作用。具體原因尚不清楚。鼠傷寒沙門氏菌DT104是先粘附于細胞表面然后再侵入細胞造成損害。本試驗中乳酸桿菌不僅能降低沙門氏菌對IPEC-J2細胞的粘附作用,而且還能抑制其對細胞的侵入,先加入乳酸桿菌對沙門氏菌的侵入抑制率為23%～33%。Boudeau等在研究非致病性大腸桿菌Nissle1917對具有粘附和侵入功能的致病性大腸桿菌的抑制作用時,發(fā)現(xiàn)先加大腸桿菌Nissle1917,侵入抑制率為97.2%～99.9%同時加入時抑制率78%～99.9%。但是,在本試驗中同時加入沙門氏菌和乳酸桿菌時,沙門氏菌侵入率反而增加(數(shù)據(jù)未列出),具體原因尚不清楚。該結果提示我們,在乳酸桿菌制劑使用過程中應盡早并大劑量使用,才能取得更好的防治效果。Skjolaas等新近報道,鼠傷寒沙門氏菌DT104能夠刺