不同飲食方式對sz糖尿病模型大鼠學習記憶能力的影響

不同飲食方式對sz糖尿病模型大鼠學習記憶能力的影響

隨著糖尿?。╩elarismelius，m）發(fā)病率的增加，基于簡單、穩(wěn)定、可靠和經(jīng)濟的糖尿病動物模型越來越受到重視。鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)是一種氨基葡萄糖-亞硝基脲類化合物,能夠選擇性地破壞哺乳動物胰島β細胞,從而誘發(fā)糖尿病,常用于糖尿病動物模型的制備。然而STZ的劑量選擇、動物的飲食等因素制約著模型的穩(wěn)定性。此外,有報道,糖尿病模型大鼠存在空間學習記憶能力下降,本文通過比較不同時間、劑量STZ尾靜脈注射配合不同飲食條件建立糖尿病大鼠模型,動態(tài)監(jiān)測模型動物血糖變化,探討應用STZ制備穩(wěn)定可靠DM模型的方法,并通過Morris水迷宮實驗檢測模型大鼠空間學習記憶能力,為糖尿病學習記憶能力改變提供基礎性的研究。1材料和方法1.1材料表面1.1.1高脂飼料的制作SPF級雄性SD大鼠70只,體重(150±10)g,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2006-0009】。高脂飼料,由基礎鼠飼料加蔗糖、煉豬油和蛋黃按比例搭配制作(豬油18%,蔗糖20%,蛋黃%,基礎飼料59%),購自北京華阜康生物科技股份有限公司【SCXK(京)2009-0008】。實驗在中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎理論研究所實驗動物屏障環(huán)境中進行【SYXK(京)2010-0032】,并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。1.1.2儀器、試劑與儀器鏈脲佐菌素購自Sigma公司(批號:040M1357),檸檬酸(北京北化精細化學品有限責任公司,批號:20091028),檸檬酸二鈉(北京北化精細化學品有限責任公司,批號:20070828)。TG(批號:110501)、CHO(批號:100731),HDL-C(批號:100401),LDL-C(批號:100351)測定試劑盒購至北京中生北控生物科技股份有限公司。HEA-215型血糖儀及配套試紙(歐姆龍,中國)。Ethovision小動物行為軌跡跟蹤分析系統(tǒng)(Noldus公司,荷蘭)。1.2方法1.2.1不同種類stz、常規(guī)膳食組見表1動物購進后適應性喂養(yǎng)4d,進行隨機分組,根據(jù)飲食、STZ注射時間、劑量的不同分為7組,每組10只動物,共70只,分別為:Ⅰ組:空白對照組;Ⅱ組:高糖高脂膳食組;Ⅲ組:0周STZ(30mg/kg)+高糖高脂膳食組;Ⅳ組:0周STZ(30mg/kg)+常規(guī)膳食組;Ⅴ組:6周STZ(20mg/kg)+高糖高脂膳食組;Ⅵ組:6周STZ(25mg/kg)+高糖高脂膳食組;Ⅶ組:6周STZ(30mg/kg)+高糖高脂膳食組。1.2.2檸檬酸緩沖液的制備檸檬酸緩沖液的配置:取檸檬酸(FW:210.14)2.1g加入超純水100mL中配成A液,取檸檬酸二鈉(FW:294.10)2.94g加入超純水100mL中配成B液,將A、B液按1∶1比例混合,用pH計測定pH值,調(diào)到pH值4.2~4.5之間,即為所需的檸檬酸緩沖液。STZ的配置:注射前用檸檬酸緩沖液以1%的濃度溶解STZ,溶解后30min內(nèi)注射完畢,現(xiàn)用現(xiàn)配,置于冰浴中。1.2.3尾靜脈stz注射動物購進后,常規(guī)飲食、水,適應4d,于注射STZ前禁食12h(20:00至次日8:00),根據(jù)分組情況,III組、IV組大鼠尾靜脈注射30mg/kgSTZ。高糖高脂膳食組尾靜脈注射同等劑量的檸檬酸緩沖液。注射后根據(jù)分組情況分別給予常規(guī)與高脂飲食。實驗第6周,V組大鼠尾靜脈注射STZ(20mg/kg);Ⅵ組注射STZ(25mg/kg);VII組注射STZ(30mg/kg)。1.2.4血液測試于尾靜脈注射STZ72h后,剪尾法取血,歐姆龍血糖儀測定大鼠隨機血糖值。以后每周監(jiān)測血糖1次。1.2.5血脂檢測總膽固醇采用CHO-PAP法,甘油三酯采用GPO-PAP法,高密度脂蛋白與低密度脂蛋白采用清除法。1.2.6血清胰島素和高血糖素的檢測放免法測定血清胰島素及胰高血糖素水平,由北京康源瑞得生物技術(shù)有限公司完成。1.2.7空間記憶檢測能力測試參考文獻,歷時5d,平臺固定在SE象限,位于水面下1.5cm,水溫穩(wěn)定在(25±0.5)℃。實驗室中的物品和人員的位置在實驗過程中固定不變,作為動物的空間參照物。每天測試2次,每次從不同象限中點將動物面向池壁放入水中(入水點采用半隨機的方法,同一次測試中所有動物的入水點相同),檢測時間為120s,在平臺上停留超過2s則判定為尋臺成功,動物入水至尋臺成功時間為逃避潛伏期,若120s內(nèi)未找到平臺則潛伏期記為120s。每次測試前先將動物置于平臺上停留15s,測試結(jié)束后適應10s。計算每天潛伏期平均值,以評價動物空間記憶的獲得能力。(2)空間搜索實驗定位航行結(jié)束次日,撤去平臺,選擇NW象限作為入水象限,動物在120s內(nèi)穿過原平臺位置的次數(shù)評價動物的空間記憶能力。1.3統(tǒng)計分析應用GraphPadPrism4.0統(tǒng)計軟件進行分析,計量資料以表示,組間比較采用單因素方差分析,P<0.05為統(tǒng)計學差異。2結(jié)果2.1脂大鼠體重變化隨著時間延長,各組大鼠體重均增加,Ⅲ組(0周STZ30mg/kg+高糖高脂)大鼠體重明顯低于各實驗組,與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義;高脂喂養(yǎng)6周后,Ⅴ組、Ⅵ組、Ⅶ組大鼠體重高于對照組(P<0.05),實驗第7周時Ⅵ組、Ⅶ組體重較前降低,Ⅶ組降低明顯,實驗結(jié)束時各組體重均低于對照組(圖1,彩插3)。2.2大鼠造模前后血糖指標STZ尾靜脈注射72h后觀察大鼠出現(xiàn)多飲、多食、多尿癥狀,動物萎靡不振,活動少;造模后連續(xù)10周動態(tài)監(jiān)測血糖結(jié)果顯示,Ⅲ組大鼠尾靜脈注射STZ72h后,與對照組相比,血糖升高明顯(P<0.01),于第2周,升高最為顯著,以后逐漸下降,但仍維持較高水平(P<0.01),STZ注射4周血糖值相對穩(wěn)定,至觀察第10周,血糖維持在15mmol/L,與對照組比較,差異有顯著性。Ⅳ組大鼠造模后隨機血糖值較對照組升高,造模第2周升高顯著,以后逐漸降低,于第9、10周恢復正常水平。Ⅴ組、Ⅵ組、Ⅶ組第6周造模后72h檢測,血糖升高明顯,以后逐漸降低,Ⅶ組降低緩慢,仍維持較高水平。Ⅱ組血糖與對照組比較,無明顯區(qū)別。以上結(jié)果提示,STZ的劑量,高脂飼料喂養(yǎng)是制備糖尿病模型的重要影響因素(圖2,彩插3)。2.3組療效比較高糖高脂飼料喂養(yǎng)10周后,各組大鼠CHO,TG,LDL-C均增加,其中Ⅲ、Ⅶ組與對照組比較差異有顯著性(P<0.01);Ⅲ、Ⅶ組大鼠HDL-C低于各實驗組,但差異無顯著性。以上結(jié)果顯示,高糖高脂飼養(yǎng)與STZ損傷對血脂異常具有相互促進作用。2.4大鼠血清in水平放免法檢測各實驗組大鼠血清胰島素及胰高血糖素水平,結(jié)果顯示,Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組大鼠血清INS水平較對照組增高,但差異無顯著性。除Ⅳ組外,各組大鼠血清GLU水平均較對照組增高,其中Ⅱ、Ⅶ組與對照組比較,差異有顯著性(P<0.05)。2.5糖尿病模型成功組的學習記憶能力檢測定位航行實驗結(jié)果顯示,隨著時間延長,各組大鼠發(fā)現(xiàn)平臺的潛伏期逐漸縮短,與對照組相比,Ⅱ、Ⅲ組潛伏期較對照組減少,Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ組潛伏期明顯延長,d4結(jié)果顯示,Ⅶ組與對照組比較,差異有顯著性;空間搜索實驗,各組之間差異無顯著性,提示造模后高脂喂養(yǎng),與高脂喂養(yǎng)6周后再造模,制備糖尿病模型不同,在一定范圍內(nèi),血糖升高對大鼠學習記憶能力具有促進作用。結(jié)合前面血脂結(jié)果,高脂加高糖有降低實驗動物學習、記憶能力的趨勢。3糖尿病模型的建立和運行糖尿病是由遺傳與環(huán)境因素共同作用而導致的慢性全身性代謝性疾病。糖尿病動物模型的制備是研究其發(fā)病、治療的基礎,同時也是研究的熱點、難點。目前制備糖尿病大鼠模型的方法主要有自發(fā)性動物模型、轉(zhuǎn)基因動物模型和實驗性動物模型。但前兩者由于培育和飼養(yǎng)條件要求較嚴格,動物價格昂貴,限制其在科學研究中的廣泛應用,而實驗性動物模型因其制備周期短,飼養(yǎng)條件無特殊要求,成本低,已普遍用于糖尿病的基礎研究。實驗性糖尿病大鼠模型的建立主要應用鏈脲佐菌素、四氧嘧啶等化學物質(zhì)損傷胰島β細胞。其中STZ是一種氨基葡萄糖-亞硝基脲化合物,能夠特異性損傷胰島β細胞,近年來,常用于糖尿病模型的制備,然而注射劑量,飲食情況對模型的存活率,成功率及穩(wěn)定性有很大的影響。本文比較不同時間、劑量STZ尾靜脈注射配合不同飲食制備糖尿病模型,結(jié)果顯示,STZ尾靜脈注射72h后觀察大鼠出現(xiàn)多飲、多食、多尿癥狀,動物萎靡不振,活動少,體重降低等糖尿病典型癥狀;高脂喂養(yǎng)與STZ(劑量大于25mg/kg)注射能夠成功復制糖尿病模型,單純注射STZ或高脂高糖飲食不能復制理想的糖尿病模型。已有報道糖尿病模型多采用腹腔注射方法制備,李楠等研究采用一次性大劑量腹腔注射STZ與高脂高糖飼養(yǎng)配合小劑量STZ兩種方法均建立了DM模型,王春艷研究采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)5周,配合STZ(25mg/kg)腹腔注射2次,制備2型糖尿病模型,盡管實驗結(jié)果與本實驗結(jié)果大體相當,然而血糖是動態(tài)變化的過程,現(xiàn)有報道多數(shù)實驗未對血糖做長期觀察,而本實驗通過STZ注射后動態(tài)監(jiān)測血糖的變化,為模型的穩(wěn)定性、進一步應用模型進行藥理實驗確定最佳給藥時間提供了參考。此外,有研究顯示糖尿病大鼠可出現(xiàn)明顯的學習記憶等認知功能的減退,本實驗結(jié)果顯示,各高糖高脂飼養(yǎng)組潛伏期較對照組延長、穿臺次數(shù)及平臺象限停留時間較對照組縮短,但差異無顯著性,可能與血糖高低及檢測時間相關(guān),有待于進一步驗證與深入研究。綜上,本研究通過動態(tài)觀察不同劑量STZ配合不同飲食制備糖尿病模型發(fā)現(xiàn),STZ(30mg/kg)配合高糖高脂膳食能夠快速、穩(wěn)定的建立糖尿病大鼠模型,高糖高脂膳食6周后STZ(30mg/kg)制備模型,血糖升高顯著,血清胰島素水平降低,傾向于1型糖尿病模型,通過對DM模型制備方法的探討能夠為糖尿病發(fā)病機制研究及藥物開發(fā)提供可借鑒的