葛仙米多糖的提取分離研究

葛仙米多糖的提取分離研究

葛仙米是科可見(jiàn)的一種低水平的單調(diào)藻類(lèi)。原名為不朽之海，俗稱(chēng)為水上木蘭。它與地木耳(Nostoccommunevanch.),發(fā)菜(N.flagelliforme)為同屬植物,其出現(xiàn)早于螺旋藻(Spinclina)。據(jù)《本草綱目》等記載,葛仙米有治療夜盲癥,脫肛,燙傷和兼具美容之功效。據(jù)研究,葛仙米不僅蛋白質(zhì)含量高,蛋白質(zhì)中的氨基酸品種齊全,結(jié)構(gòu)合理,基本符合FAO/WHO專(zhuān)家委員會(huì)于1973年推普的模式,而且,富含多糖和具有特殊的保健功能的VC、B族維生素、β-胡蘿卜素、微量元素含量等營(yíng)養(yǎng)成分。多糖是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一,具有許多生物活性,包括抗腫瘤,免疫,降血糖,抗病毒等。由于多糖類(lèi)化合物的獨(dú)特功能和較低的毒性,在抗體,腫瘤治療,艾滋病,抗衰老,治療糖尿病等臨床應(yīng)用方面具有良好的前景。近幾十年來(lái),隨著世界各國(guó)科學(xué)家對(duì)植物多糖分離純化,結(jié)構(gòu)分析,免疫學(xué)及藥理學(xué)等方面研究的不斷深入,尋找一種資源相對(duì)豐富,成本低廉的植物多糖已成為食品界、醫(yī)學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)。目前,多糖的研究集中在藥用植物多糖和真菌多糖,而對(duì)葛仙米多糖的研究較少。本項(xiàng)研究是葛仙米深加工的基礎(chǔ),葛仙米中含有豐富的生理活性物質(zhì),分離并鑒別這些物質(zhì)的活性,為葛仙米深加工產(chǎn)業(yè)提供理論指導(dǎo),提取出生理活性物質(zhì)可作為生產(chǎn)功能保健食品的主劑或輔助成分,做成膠囊、片劑等的葛仙米保健食品。1材料和設(shè)備1.1實(shí)驗(yàn)材料葛仙米:湖北省鶴峰縣走馬鎮(zhèn)生產(chǎn)。1.2酮、硫脲、硫脲、果膠酶工業(yè)酒精(95%),氯仿(AR),正丁醇(AR),蒽酮(AR),硫脲(AR),纖維素酶(15U/mg),果膠酶(20000U/g)。1.3儀器、設(shè)備和冷凍干燥機(jī)電子天平(FA2104)上海天平儀器廠(chǎng);分光光度計(jì)(UV·755B)上海分析儀器總廠(chǎng);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(R201)上海中科機(jī)械研究所;大容量離心機(jī)(800B)上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng);真空冷凍干燥機(jī)(ZL-1);紅外光譜儀(傅利葉變換紅外光譜儀)。2實(shí)驗(yàn)方法2.1工藝2.2葛仙米多糖的提取清洗:稱(chēng)取一定量的葛仙米,加水洗去葛仙米內(nèi)的雜質(zhì),瀝水后用蒸餾水浸泡20h,每隔5h換一次蒸餾水,使葛仙米充分溶脹,并除去一部分色素。脫色:把清洗好的葛仙米瀝去大部分水,加入工業(yè)酒精,溶液顏色逐漸加深,15min后倒去深褐色的酒精,重復(fù)3次,使酒精的顏色變?yōu)榈t色。粉碎:取于50℃烘箱內(nèi)烘36h的葛仙米,用萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎,過(guò)80目篩,裝入試劑瓶備用。脫脂:取2.5g已粉碎的葛仙米,用甲醇于78℃回流6h進(jìn)行脫脂,開(kāi)始時(shí),回流滴出的甲醇為黑色,回流結(jié)束,回流出的甲醇為淡黃色,而提取燒瓶?jī)?nèi)的甲醇顏色為墨綠色。水提:取初步脫色、脫脂的葛仙米加入三角瓶中,按料水比為1:90,于90℃的水浴鍋中提取6h。濃縮:水提后的葛仙米經(jīng)四層紗布過(guò)濾,所得濾液置于圓底燒瓶中,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮去大部分水分。脫蛋白:本實(shí)驗(yàn)是采用Sevage法脫蛋白,此方法是通過(guò)調(diào)節(jié)正丁醇與三氯甲烷的比例,從而達(dá)到較好的脫蛋白效果(本實(shí)驗(yàn)所用的正丁醇與三氯甲烷的比例為5:2)。沉淀、脫色:本實(shí)驗(yàn)沉淀與脫色是同時(shí)進(jìn)行的。色素易溶于有機(jī)溶劑,而多糖不溶于50%~90%的酒精。脫色是本實(shí)驗(yàn)的難點(diǎn),要多次調(diào)整工業(yè)酒精的濃度逐步脫去多糖的色素。干燥:為了保證葛仙米多糖的功能性成分,采用真空冷凍干燥,冷凍溫度為:-24℃。堿提:水提后的葛仙米經(jīng)四層紗布過(guò)濾后所得的濾渣按1:25加入1mol/L于室溫時(shí)稀堿液浸提6h。由于濃縮時(shí)需要加熱,為了不讓多糖分解,需要調(diào)節(jié)溶液的酸堿度,加入較濃的鹽酸,使溶液的濃度為中性。2.3初步確定實(shí)驗(yàn)中的因素2.3.1提升機(jī)溫度的確定取已粉碎的葛仙米2.5g,索氏提取6h,按1:100加水,在不同的溫度下提取5h,提取次數(shù)為3次,用蒽酮比色法測(cè)其吸光度。2.3.2游泳時(shí)間的確定取已粉碎的葛仙米2.5g,索氏提取6h,按1:100加水,在90℃的條件下,提取不同的時(shí)間,提取3次,用蒽酮比色法測(cè)其吸光度。2.3.3確定混合溶液的比例取已粉碎的葛仙米2.5g,索氏提取6h,在90℃的條件下,提取5h,按不同的料液比提取3次,用蒽酮比色法測(cè)其吸光度。2.3.4葛仙米的酮比色法由于水提溫度較高,使酶失去活性,本實(shí)驗(yàn)只做了酶對(duì)堿溶性粗多糖提取的影響。取2.5g葛仙米按1:90加水,在90℃的條件下,提取6h,提取3次,過(guò)濾后,按1:20加入濃度為0.75mol/L的堿液,提取5h,然后分別加入一定量的纖維素酶和果膠酶,用蒽酮比色法測(cè)其吸光度。2.3.5防水時(shí)間的確定取已粉碎的葛仙米2.5g,索氏提取6h,按1:100加水,在90℃的條件下,提取5h,用蒽酮比色法測(cè)其吸光度。2.3.6堿土中酮比色法測(cè)定總酮比色法取已粉碎的葛仙米2.5g,索氏提取6h,按1:90加水,在90℃的條件下,提取6h,提取3次,過(guò)濾后,按1:20加入濃度不同的堿液,提取4h,提取3次,用蒽酮比色法測(cè)其吸光度。2.3.7堿土中3%3.2%取已粉碎的葛仙米2.5g,索氏提取6h,按1:90加水,在90℃的條件下,提取6h,提取3次,過(guò)濾后,按1:20加入濃度為0.75mol/L的堿液,用不同的時(shí)間提取3次,用蒽酮比色法測(cè)其吸光度。2.3.8堿土中堿液的提取取已粉碎的葛仙米2.5g,索氏提取6h,按1:90加水,在90℃的條件下,提取6h,提取3次,過(guò)濾后,按不同的比例加入濃度為0.75mol/L的堿液,提取時(shí)間為5h,提取3次,用蒽酮比色法測(cè)其吸光度。2.3.9樣品的提取時(shí)間取2.5g葛仙米按1:90加水,在90℃的條件下,提取6h,提取3次,過(guò)濾后,按1:20加入濃度為0.75mol/L的堿液,提取時(shí)間為5h,提取不同的時(shí)間,用蒽酮比色法測(cè)其吸光度。2.4試驗(yàn)因素的最終確定2.4.1各因素間的相互影響的消除通過(guò)單因素試驗(yàn)知道較佳的因素水平,為了消除各因素間的相互影響,根據(jù)這些確定的因素,確定正交表的因素的各個(gè)水平。根據(jù)各實(shí)驗(yàn)因素水平,做正交實(shí)驗(yàn)。2.4.2各因素間的相互影響的消除通過(guò)單因素試驗(yàn)知道較佳的因素水平,為了消除各因素間的相互影響,根據(jù)這些確定的因素,確定正交表的因素的各個(gè)水平。根據(jù)各實(shí)驗(yàn)因素水平,做正交實(shí)驗(yàn)。2.5減少污染效果的調(diào)整通過(guò)實(shí)驗(yàn)可知:影響多糖顏色的因素除去酒精脫色、索氏回流脫色,還有脫蛋白的效果、酒精沉淀多糖時(shí)的脫色。2.5.1脫蛋白質(zhì)法的確定通過(guò)比較Sevag法脫蛋白與三氯乙酸脫蛋白后的效果比較,選擇Sevag法脫蛋白(正丁醇和三氯甲烷二者之和的比是5:2,脫蛋白3次)。2.5.2酒精沉淀葡萄糖濃度的調(diào)整通過(guò)調(diào)整工業(yè)酒精的濃度來(lái)沉淀多糖和去除多糖內(nèi)的色素。2.6直接測(cè)定還原糖和菲林試劑的方法2.6.1計(jì)算糖含量的差異2.7葛仙米的酮比色法由于水提溫度較高,使酶失去活性,本實(shí)驗(yàn)只做了酶對(duì)堿溶性粗多糖提取的影響。取2.5g葛仙米按1:90加水,在90℃的條件下,提取6h,提取3次,過(guò)濾后,按1:20加入濃度為0.75mol/L的堿液,提取5h,然后加入一定量的纖維素酶和果膠酶,用蒽酮比色法測(cè)其吸光度。2.8多酚組的紅外光譜分析多糖制品采用溴化鉀(KBr)壓片,用傅利葉紅外光譜儀進(jìn)行掃描。3結(jié)果與分析3.1水溶液多糖的提取通過(guò)單因素試驗(yàn)知道較佳的水提溫度是90℃,料液比為1:90,水提取時(shí)間為6h,水提取數(shù)為3次,為了消除各因素間的相互影響,根據(jù)這些確定的因素,確定正交表的因素的各個(gè)水平。根據(jù)各實(shí)驗(yàn)因素水平,取定容至250ml的濃縮液2ml,定容至100ml,用蒽酮比色法測(cè)其吸光度。由以上正交試驗(yàn)及極差分析結(jié)果可以看出,水溶性多糖的最佳提取方案為90℃,6h,1:90加水,水提取4次。對(duì)多糖影響較大的因素是多糖提取的次數(shù),而提取溫度,提取時(shí)間,料液比對(duì)多糖的得率影響不大,并且后面三者對(duì)多糖的得率影響不大。3.3正交試驗(yàn)結(jié)果通過(guò)單因素試驗(yàn)知道較佳的堿液濃度為0.75mol/L,加堿液的比例為1:25,堿提取時(shí)間為5h,堿提取數(shù)為3次,(酶的加入對(duì)堿溶性多糖的提取率影響不大)為了消除各因素間的相互影響,根據(jù)這些確定的因素,確定正交表的因素的各個(gè)水平。根據(jù)各實(shí)驗(yàn)因素水平,取定容至250ml的濃縮液5ml,定容至100ml,用蒽酮比色法測(cè)其吸光度。由表2和極差分析可知堿溶性多糖的最佳提取方法是:1mol/L的NaOH溶液,提取6h,加1:25的堿液,提取4次。對(duì)多糖得率影響較大的因素是堿液的濃度和堿提的次數(shù),其中以堿提次數(shù)影響較大,而堿提時(shí)間和加堿液的比例影響不大,且二者影響基本相同。3.3糖原測(cè)試3.3.1污染后在不同水溶液中還原糖含量的檢測(cè)結(jié)果實(shí)驗(yàn)采用斐林試劑直接滴定法對(duì)葛仙米水溶性粗多糖還原糖含量進(jìn)行了檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果如表3:由表3可以看出,葛仙米水溶性粗多糖中還原糖含量達(dá)0.42%。3.3.2仙米堿溶解粗多糖中還原糖含量的檢測(cè)同樣,實(shí)驗(yàn)采用斐林試劑直接滴定法對(duì)葛仙米堿溶性粗多糖中還原糖含量進(jìn)行了檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果如表4:由表4可見(jiàn):葛仙米堿溶性粗多糖中還原糖含量為0.57%。3.3.3對(duì)葛仙米多糖提取率的影響多糖含量=粗多糖-還原糖由表5可知:水溶性多糖的最高提取率是14.09%,堿溶性多糖的最高提取率是5.70%,水溶性多糖的提取率與堿溶性多糖相差較大,說(shuō)明葛仙米中水溶性多糖的含量比堿溶性多糖高。3.4溴化鉀壓片與紅外掃描法實(shí)驗(yàn)分別取水溶性多糖和堿溶性多糖10~20mg進(jìn)行溴化鉀壓片,用傅利葉紅外光譜儀在4000~500cm-1區(qū)進(jìn)行紅外掃描,結(jié)果見(jiàn)圖3、圖4。4在堿溶性葛仙米多糖中的應(yīng)用4.4酶對(duì)多糖的提取率影響不大。4.5水溶性多糖和堿溶性多糖的組成有待今后進(jìn)一步采用凝膠柱層析進(jìn)行分析。多糖含量=粗多糖-還原糖圖3、圖4表明水溶性多糖和堿溶性多糖在4000~500cm-1內(nèi)具有多糖性質(zhì)的一般特征吸收:即3600~3300cm-1處為-OH和-NH2的吸收峰,3000cm-1左右為C-H的伸縮振動(dòng)吸收峰,1600cm-1左右為的酰胺的振動(dòng)峰1400cm-1左右為C-H的彎曲振動(dòng)吸收峰,1000cm-1左右為吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)中C=O的吸收峰。但從圖4、圖5中可以看出,水溶性多糖與堿溶性多糖紅外光譜圖