免疫熒光方法

免疫熒光方法免疫熒光〔Immunofluorescence,IF〕試驗方法免疫熒光技術(shù)是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的根底上建立起來的一項技術(shù)。它是依據(jù)抗原抗體反響的原理，先將的抗原或抗體標記上熒光基團，再用這種熒光抗體〔或抗原〕作為探針檢查細胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原〔或抗體〕。利用熒光顯微鏡可以觀看熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位，以及利用定量技術(shù)〔比方流式細胞儀〕測定含量。免疫熒光試驗的主要步驟包括細胞片制備、固定及通透〔或稱為透化〕、封閉、抗體孵育及熒光檢測等。細胞片制備〔通俗的說法是細胞爬片〕是免疫熒光試驗的第一步，細胞片的質(zhì)量對試驗的成敗至關(guān)重要，緣由很簡潔，假設(shè)發(fā)生細胞掉片，一切都無從談起。這一步關(guān)鍵的是玻片〔SlidesorCoverslips〕的處理以及細胞的活力，有人依據(jù)成功閱歷總結(jié)出很多有益的細節(jié)或小竅門，格外值得借鑒。固定和通透步驟最重要的是依據(jù)所爭論抗原的性質(zhì)選擇適當?shù)墓潭ǚ椒?，適宜的固定劑和固定程序?qū)τ讷@得好的試驗結(jié)果是格外重要的。免疫熒光中的封閉和抗體孵育與其它方法〔ELISA或WesternBlot〕中的一樣步驟是類似的，最重要的區(qū)分在于免疫熒光試驗中要用到熒光抗體，因此必需謹記避光操作，此外抗體濃度的選擇可能更加關(guān)鍵。最終需要留意的是，標記好熒光的細胞片應(yīng)盡早觀看，或者用封片劑封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因標記蛋白解離或熒光減弱而影響試驗結(jié)果。由于操作步驟比較多，同時在分析結(jié)果時無法像WB那樣可以依據(jù)分子量的大小區(qū)分非特異性識別，所以要得到一個完善的免疫熒光試驗結(jié)果，除了需要高質(zhì)量的抗體，以及對試驗條件進展反復(fù)優(yōu)化外，還必需設(shè)立嚴謹?shù)脑囼灡日??？傊?，免疫熒光試驗從細胞樣品處理、固定、封閉、抗體孵育到最終的封片及觀看拍照，每步都格外關(guān)鍵，需要嚴格把握試驗流程中每個步驟的質(zhì)量，才能最終到達你的試驗?zāi)康?。根本試驗步驟：細胞預(yù)備。對單層生長細胞，在傳代培育時，將細胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培育皿中，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對懸浮生長細胞，取對數(shù)生長細胞，用PBS離心洗滌〔1000rpm,5min〕2次，用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。固定。依據(jù)需要選擇適當?shù)墓潭▌┕潭毎?。固定完畢后的PBS4℃3PBS3×5min.通透。使用交聯(lián)劑〔如多聚甲醛〕固定后的細胞，一般需要在參與抗體孵育前，對細胞進展通透處理，以保證抗體能夠到達抗原部位。選擇通透劑應(yīng)充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透的時間一般在5-15minPBS3×5min.封閉。使用封閉液對細胞進展封閉，時間一般為30min.1h4℃過夜。PBST35min.二抗結(jié)合。間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育漂洗35min后，再用蒸餾水漂洗一次。封片及檢測。滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查?！惨弧臣毎A(yù)備用于免疫熒光試驗的細胞可以是直接生長在蓋玻片上的貼壁細胞，也可以是經(jīng)過離心后涂片的懸浮細胞或者是將取自體內(nèi)的組織細胞懸液離心后涂片。貼壁良好的細胞一般在培育時直接放入coverslips讓細胞生長在其上即可，盡量避開使用貼壁性能不好的細胞進展免疫熒光試驗，以免后續(xù)的漂洗操作引起細胞脫落。少數(shù)試驗需要使用這類細胞或者懸浮細胞進展免疫熒光觀看，建議使用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片?！捕彻潭ê屯ㄍ赋隣幷摷毎獗砜乖虿环€(wěn)定抗原可不固定外，一般均應(yīng)固定。固定的目的有三：①防止細胞從玻片上脫落；②除去防礙抗原-抗體結(jié)合的類脂；③使標本易于保存。標本的固定原則是：①不能損傷細胞內(nèi)的抗原；②不能凝集蛋白質(zhì)；③應(yīng)保持細胞和亞細胞構(gòu)造；④固定后應(yīng)保持通透性，以保證抗體自由進入全部細胞與亞細胞組分與抗原結(jié)合。常用的固定劑有多種，應(yīng)依據(jù)所爭論抗原的性質(zhì)和所使用的抗體特性選擇適當?shù)墓潭▌?。通常固定方法可以分為兩類：有機溶劑和交聯(lián)劑。有機溶劑如甲醇和丙酮等可去除類脂并使細胞脫水，同時將細胞構(gòu)造蛋白沉淀。交聯(lián)劑如多聚甲醛通常通過自由氨基酸基團形成分子間橋連，從而產(chǎn)生一種抗原相互連接的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)造。交聯(lián)劑比有機溶劑更易于保持細胞的構(gòu)造，但由于交聯(lián)阻礙抗體結(jié)合，可能會降低一些細胞組分的抗原性，因此需要增加一個通透步驟以使抗體能夠進入標本。兩種固定方法都可能使蛋白抗原變性，因此使用變性蛋白作為抗原生產(chǎn)的抗體在免疫熒光中可能更為有效。最常用的固定劑有多聚甲醛和甲醇，少數(shù)狀況也使用乙醇，丙酮及戊二醛等進展固定。通常，細胞構(gòu)造抗原、病毒及一些酶類抗原使用丙酮、乙醇及高濃度的甲醛固定可獲得較好的結(jié)果，而細胞膜相關(guān)組分抗原一般以多聚甲醛固定。細胞器和細胞顆粒內(nèi)的抗原一般也用多聚甲醛固定，并需要進展通透以使抗體能到達抗原表位。通透步驟只在檢測細胞內(nèi)抗原表位的時候才需要，由于抗體需要進入細胞內(nèi)部去檢測蛋白。但是，假設(shè)待檢測的是跨膜蛋白，且其抗原表位處于胞質(zhì)內(nèi)區(qū)域，則同樣需要對細胞進展通透。相反，假設(shè)所檢測的抗原表位位于膜蛋白的胞外段，則不需要進展通透。丙酮本身具有通透作用，因此用丙酮作為固定劑時是不需要通透的。甲醇同樣具有通透作用，但有些場合并不適合用甲醇，由于一些表位對甲醇格外敏感。常用的通透劑是去垢劑，如Triton,NP-40,以及Tween20,Saponin,Digitonin和Leucoperm等。Triton和NP-40屬于烈性去垢劑，可局部溶解細胞核膜，因此格外適合核抗原檢測。但應(yīng)當留意的是，假設(shè)在高濃度下使用或者作用時間過長，它們將破壞蛋白，從而影響試驗結(jié)果。TritonX-100是最常用的通透劑，但是它將破壞細胞膜，因此不適用于細胞膜相關(guān)抗原。后面一組去垢劑要溫存得多，它們可以在細胞質(zhì)膜上形成足夠大的孔隙以允許抗體通過，但是不會溶解細胞質(zhì)膜。適于胞質(zhì)抗原或者質(zhì)膜上靠近胞質(zhì)一面的抗原，也適于可溶性的核抗原。一般的操作程序是先固定后通透，但針對有些水不溶性的目的抗原的檢測宜先通透再固定，這樣做的緣由主要是可以通過通透去除很多水溶性的蛋白，從而大大削減了免疫熒光的背景和非特異性信號。PBS〔三〕封閉封閉的目的是為了削減抗體的非特異性結(jié)合，最常用的封閉劑為1%BSA,PBSpH1%gelatin,1%bovine或與二抗種屬一樣的血清〔3-10%〕等?！菜摹晨贵w孵育直接免疫熒光法中的一抗和間接免疫熒光法中的二抗都是熒光抗體，因此在這些抗體孵育的時候必需留意避光。此外，為保證結(jié)合質(zhì)量和防止枯燥，抗體孵育應(yīng)盡量在濕盒中進展?！参濉撤馄盁晒庥^看標記好熒光的細胞片原則上可以直接進展觀看，特別是有時候封片不當反而使得前功盡棄。但在絕大多數(shù)狀況下，為了保存結(jié)果，以便進一步觀看、照像、統(tǒng)計分析等，需作封片處理。常規(guī)的方法是承受甘油或中性樹脂封片，為了增加封片的效果，往往需要在封片時添加特別的抗熒光淬滅劑?！擦硺吮颈４嬗捎跓晒馍睾偷鞍踪|(zhì)分子的穩(wěn)定性都是相對的，因此隨著保存時間的延長，在各種條件影響下，標記蛋白可能變性解離，失去其應(yīng)有的亮度和特異性。因此給標本的保存帶來確定的困難，所以在標本進展熒光染色之后應(yīng)馬上觀看。由于性能良好的抗熒光淬滅劑的消滅，熒光標記的標本可以在低溫〔4℃或-20℃〕下保存相當長的時間。在某些情形下，考慮到試驗的本錢及試驗條件，也可以實行權(quán)宜的方法，比方固定標本片后低溫保存，在需要時再進展熒光標記，即隨用隨染。直接免疫熒光法測抗原根本原理將熒光素標記在相應(yīng)的抗體上，直接與相應(yīng)抗原反響。其優(yōu)點是方法簡便、特異性高，非特異性熒光染色少。缺點是敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細菌、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查。試劑與儀器磷酸鹽緩沖鹽水〔PBS〕：L，熒光標記的抗體溶液：以L，的PBS進展稀釋9份+碳酸鹽緩沖液1份配制搪瓷桶三只〔內(nèi)有LPBS1500ml〕有蓋搪瓷盒一只〔內(nèi)鋪一層浸濕的紗布墊〕熒光顯微鏡玻片架濾紙H37℃溫箱等。試驗步驟1、滴加L，的PBS于待檢標本片上，10min后棄去，使標本保持確定濕度。2、滴加適當稀釋的熒光標記的抗體溶液，使其完全掩蓋標本，置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，保溫確定時間〔參考：30min〕。3、取出玻片，置玻片架上，先用L，的PBS沖洗后，再按挨次過L，PBS3-5min，不時振蕩。4、取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標本枯燥，加一滴緩沖甘油，以蓋玻片掩蓋。5、馬上用熒光顯微鏡觀看。觀看標本的特異性熒光強度，一般可用“+”表示：〔-〕無熒光；〔±〕極弱的可疑熒光；〔+〕熒光較弱，但清楚可見；〔++〕熒光光明；〔+++--++++〕熒光閃亮。待檢標本特異性熒光染色強度達“++”以上，而各種比照顯示為〔±〕或〔-〕，即可判定為陽性。留意事項1、對熒光標記的抗體的稀釋，要保證抗體的蛋白有確定的濃度，一般稀釋度不應(yīng)超過1：20，抗體濃度過低，會導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過弱，影響結(jié)果的觀看。2、染色的溫度和時間需要依據(jù)各種不同的標本及抗原而變化，染色時間可以從10min到數(shù)小時，一般30min已足夠。染色溫度多承受室溫〔25℃左右〕，高于37℃可加強染色效果，但對不耐熱的抗原〔如流行性乙型腦炎病毒〕可承受0-2℃的低溫，延長染色時間。低溫37℃30min3、為了保證熒光染色的正確性，首次試驗時需設(shè)置下述比照，以排解某些非特異性熒光染色的干擾。1-2滴L，的PBS。特異性比照〔抑制試驗〕：標本加未標記的特異性抗體，再加熒光標記的特異性抗體。陽性比照：的陽性標本加熒光標記的特異性抗體。假設(shè)標本自發(fā)熒光比照和特異性比照呈無熒光或弱熒光，陽性比照和待檢標本呈強熒光，則為特異性陽性染色。4、一般標本在高壓汞燈下照耀超過3min，就有熒光減弱現(xiàn)象，經(jīng)熒光染色的標本最好在當天觀看，隨著時間的延長，熒光強度會逐漸下降。免疫熒光染色〔間接法〕1、切片固定后用毛細滴管吸取經(jīng)適當稀釋的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持確定的濕度，37℃作用30min。然后用l洗兩次，10min，用吸水吸去或吹干余留的液體。2、再滴加間接熒光抗體〔如兔抗人-球蛋白熒光抗體等〕，同上步驟，染色30min，37℃，緩沖鹽水洗兩次10min，攪拌，緩沖甘油封固，鏡檢。比照染色：①抗體比照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清，再用上法進展染色，結(jié)果應(yīng)為陰性。②抗原比照：即類屬抗原染色，亦應(yīng)為陰性。③陽性比照。間接法中上述方法稱雙層法〔DoubleLayerMethod〕。另一種稱夾心法，即用未標記的特異性抗原加在切片上先與組織中之相應(yīng)抗體結(jié)合，再用該抗原之熒光抗體重疊結(jié)合其上，而間接地顯示出組織和細胞中抗體的存在，方法步驟如下：①切片或涂片固定后，置于染色濕盒內(nèi)。37℃，30min。25min，吹干。37℃，30min。⑤如③水洗。⑥緩沖甘油封固，鏡檢。易生物試驗技術(shù)頻道-生物試驗技術(shù)資料庫！細胞內(nèi)抗原的檢測-間接免疫熒光法細胞內(nèi)抗原的檢測過程與細胞外表抗原檢測過程根本全都，只是在與一抗孵育前，需要預(yù)先對細胞用非離子去污劑進展透化處理?！静僮鞣椒ā咳∫压潭ê玫募毎榔蛩ζ蚪?jīng)過預(yù)處理的組織切片〔石蠟或冰凍切片〕；用含%TritonX-100或NP-40的PBS溶液透化固定后的細胞2min〔室溫〕，有些標本可能需要長達15min，時間視抗原而定；余下步驟接上述“細胞外表抗原的檢測-間接免疫熒光法”步驟〔2〕；【留意事項】在使用前，一抗二抗均應(yīng)測試其適宜的稀釋度。多聚甲醛的固定是不穩(wěn)定的，標本經(jīng)多聚甲醛固定后，應(yīng)再用去污劑處理，假設(shè)標本在水溶液中浸泡的時間過長，則會使交聯(lián)結(jié)構(gòu)解體。因此，應(yīng)避開固定后的標本在水溶液中浸泡的時間過長。信號微弱的解決方法：①提高一抗和二抗的濃度以增加敏感性，這必需測試各種濃度抗體的滴度；②延長一抗和二抗的孵育時間。由于細胞染色時抗原吸附在固相載體上，抗原抗體結(jié)合時間較在溶液中長。孵育時間可因試驗設(shè)計作適當調(diào)整，但少于20min抗體和抗原幾乎不能有效結(jié)合。在以上兩點中，應(yīng)摸索出一個最正確條件以產(chǎn)生有效信號且保持良好的背景。這就需要反復(fù)試驗，由于每組抗體和抗原的狀況會有所不同；③轉(zhuǎn)變檢測方法，用共聚焦顯微鏡觀看，可提高敏感性。背景不好的解決方法細胞樣本進展熒光染色時，背景問題主要來自兩個方面，即非特異性染色和特異性穿插反響。①非特異性吸附：非特異性吸附背景問題的產(chǎn)生與抗原抗體的特異性結(jié)合無關(guān)。即一抗或二抗與樣品相互作用而發(fā)生吸附，而不是與抗原發(fā)生特異性結(jié)合。*將全部抗體溶液或含蛋白的檢測試劑用100，000′g離心30min以去除蛋白聚合物。*滴定一抗和所用的檢測試劑，以確定能夠產(chǎn)生適宜信號的最