抗菌肽的研究進展

抗菌肽的研究進展

20世紀80年代，瑞典科學(xué)家boman研究團隊用蠟芽菌（ba細胞細菌）誘導(dǎo)慈姑，發(fā)現(xiàn)了第一個抗菌酶1。人們最初把這類具有抗菌活性的多肽稱為“antibacterialpeptides”,原意為“抗細菌肽”;后來發(fā)現(xiàn)其有抗真菌等微生物的作用,便改稱為“antimicrobialpeptides”,意為“抗微生物肽”［2］?？咕氖怯苫蚓幋a在核糖體內(nèi)合成的多肽,不同種類的抗菌肽通常有共同的特點:短肽(30~60個氨基酸),強陽離子性(等電點范圍為8.9~10.7),熱穩(wěn)定性好(100℃,15min),分子質(zhì)量約為4ku,無藥物屏蔽且不影響真核細胞。當今,抗菌肽已經(jīng)可以由原核生物到人類的大部分有機生物體中成功分離和分類［3－4］?？咕耐ǔＷ饔糜诩毦?在真核生物的天然免疫方面發(fā)揮著重要作用,被認為是古代進化中哺乳動物體內(nèi)有效保留的免疫分子［5－6］。由于全球抗生素藥物的濫用,越來越多的細菌可能發(fā)展成為對傳統(tǒng)抗生素耐藥的菌株。人們迫切地尋找能夠代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗生素的藥物,使得抗菌肽受到廣泛的重視。目前,全球科研人員對抗菌肽的作用機制、藥物療效、安全性等進行深入研究,且提供了抗菌肽在線更新數(shù)據(jù)庫(http://aps.unmc.edu/AP/main.php［7］)的服務(wù)。本文對抗菌肽的作用機制、不同來源和應(yīng)用前景等研究進行了綜述。1抗菌肽的來源及抗菌肽計算抗菌肽根據(jù)其來源的不同通常可以分為4大類,分別為來源于昆蟲、動物、微生物基因工程菌的抗菌肽以及人工合成的抗菌肽。迄今為止,已有1500多種不同來源的抗菌肽被相繼報道［8］。1.1抗菌肽的制備昆蟲作為世界上種類最多的生物(大約有100多萬個品種),有著高度的適應(yīng)能力和高效的防御機制?？咕氖抢ハx在受到微生物感染或意外傷害時,由血淋巴及機體組織中產(chǎn)生的一類多肽。昆蟲的抗菌肽在體液免疫防御中發(fā)揮了重要作用,其脂肪體(功能類似于哺乳動物的肝臟)合成的抗菌肽分泌到血淋巴中對全身的病原體起反應(yīng)［9］。迄今為止,已經(jīng)有200多種來自昆蟲體內(nèi)的抗菌肽被發(fā)現(xiàn)。這些多肽根據(jù)其氨基酸的序列和抗菌的功能被分為5種:cecropins、防御素、富含脯氨酸的多肽、富含甘氨酸的多肽及溶菌酶［10］。最近在昆蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的新抗菌肽有hinnavinⅡ、S1家蠶抗菌肽(Slmoricin)、奢錦天牛天蠶素(A.luxuriosacecropin)、防御素NV(defensin-NV)、ASABF-6Cys-α、(acaloleptinisoform5)、armadilli-din、細菌素1(bactrocerin-1)、OdVP1、SK84、富含脯氨酸肽2(proline-richpeptide2)等［11］。1.1.1cecropis的分類cecropins是在天蠶蛹的血淋巴中發(fā)現(xiàn)的,它是世界上第一個被發(fā)現(xiàn)的抗菌肽。隨后,有研究證實cecropins也存在于背囊動物、蛔蟲、線蟲等體內(nèi)。但是,cecropins僅被報道存在于雙翅目和鱗翅目昆蟲,是否廣泛存在于昆蟲中尚不能確定。cecropins肽鏈長35~39個氨基酸,缺少半胱氨酸并且形成2個線性的α螺旋,有利于其破壞細菌的細胞膜［12－14］。1.1.2鹽濃度對合成菌的抗菌能力防御素有富含半胱氨酸的陽離子結(jié)構(gòu),是具有3個或者4個二硫鍵的獨特結(jié)構(gòu)的多肽。防御素已從哺乳動物、昆蟲和植物中分離出來,它們作為先天免疫效應(yīng)分子,對病原體感染提供了最初的有效防御。有關(guān)類防御素的三維結(jié)構(gòu)的研究表明,其初級結(jié)構(gòu)與其家族中其他的成員相類似,整體折疊結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,并且側(cè)鏈的性質(zhì)決定了其功能的特異性。已證實其抗菌活力與鹽濃度相關(guān)［15］。昆蟲防御素可有效對抗革蘭氏陽性細菌,并且對某些革蘭氏陰性細菌、真菌、酵母及原生動物也有抵抗活性［16－17］。1.1.3抗菌肽的成分迄今為止,許多抗菌肽已經(jīng)在不同的昆蟲中被證實,如:肌毒素(creatoxin)、attacins、雙翅殺菌肽(diptericins)和鞘翅殺菌肽(coleoptericins)等。這些抗菌肽都富含14%~22%的甘氨酸殘基,并且這些殘基對肽鏈的三級結(jié)構(gòu)有重要影響。富含甘氨酸的抗菌肽家族通?？梢钥拐婢透锾m氏陰性細菌,以及通過破壞細胞膜來抗癌細胞［18］。1.1.4脯氨酸質(zhì)控菌肽富含脯氨酸的抗菌肽是從哺乳動物和昆蟲體中分離出來的,主要是抗革蘭氏陰性細菌,包括某些植物半生細菌和一些人類病原體［19］。它們在脊椎動物和無脊椎動物中是一群陽離子宿主防御肽,典型特征是包含大量的脯氨酸殘基,并常與精氨酸殘基組成重復(fù)序列。與其他類型的抗菌肽不同,它們的作用方式不涉及膜的溶解,而是進入易感細胞中,在細胞內(nèi)部產(chǎn)生功效。這一特性使它們成為一種新型潛在的細胞穿透肽,從而作為非滲透藥物進入到細菌和真核細胞中［20］。1.2物中多態(tài)性肽的篩選抗菌肽起初是在無脊椎動物動物中發(fā)現(xiàn)的,隨后在脊椎動物中也有發(fā)現(xiàn),這些肽顯示出多樣的序列結(jié)構(gòu)和特異性的靶標?；蚓幋a的抗菌肽能夠在哺乳動物、兩棲動物、魚類、昆蟲等多種不同生物體的組織中表達［21－22］。1.3抗菌肽的生產(chǎn)由于長期使用抗生素導(dǎo)致耐藥性菌株增多,人類需要尋找一種新型的抗菌劑?？咕挠兄鴱V譜抗菌活性,能快速殺死作用靶標,它最有希望成為傳統(tǒng)抗菌素的替代品［23］。但是實際生產(chǎn)中應(yīng)用抗菌肽還有一定的問題,最主要是昂貴的生產(chǎn)成本限制了抗菌肽的應(yīng)用。利用基因工程重組技術(shù)異源表達系統(tǒng)來生產(chǎn)抗菌肽是一種新模式［24］。其中,大腸桿菌是生產(chǎn)抗菌肽良好的表達系統(tǒng),但是這種小肽很難在這種高水平工程菌株中表達,特別是遇到毒肽類時,會對宿主菌有殺傷作用。最近有人開發(fā)利用甲基畢赤酵母表達系統(tǒng)來大規(guī)模表達不同來源的蛋白質(zhì),有良好的表達效果［25］。1.4方面取得的成果近年來,隨著人們對抗菌肽研究的深入,科研人員嘗試人工合成抗菌肽,并在醫(yī)療應(yīng)用方面取得了一定的成果。利用抗菌肽研制的藥物已進入市場,如:美國馬蓋寧制藥公司研發(fā)出來的馬蓋寧(magainin)藥物可殺死病毒和腫瘤細胞,柞蠶抗菌肽能抑制乙型肝炎和殺滅腫瘤細胞,在醫(yī)藥上已制成腎肝寧膠囊治療腎炎及肝炎等［26］。2治療藥物的作用抗菌肽具有廣譜抗菌活性,可以快速查殺靶標,并且其中很多是純天然的肽,使它迅速成為潛在的治療藥物。抗菌肽的治療范圍為:革蘭氏陰性細菌、革蘭氏陽性細菌、真菌、寄生蟲、腫瘤細胞等。2.1抗菌肽的抗菌性能抗菌肽的抗細菌功能包括抗革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌以及革蘭氏兼行細菌。大部分抗菌肽均具有抗革蘭氏陽性細菌的功能,但不同抗菌肽的抗菌活性有較大差異,且抗菌譜也不同。如表1［27－28］所示,家蠶抗菌肽可分為7大家族:cecropins、moricins、attacins、lebocins、enbocins、gloverins及defensins,各個家族中的抗菌肽抗菌活性和抗菌譜均不相同。最近研究表明,在抗菌時不同的抗菌肽之間甚至抗菌肽與傳統(tǒng)的抗生素之間有協(xié)同和輔助作用,將抗菌肽和抗生素兩者連用可以提高藥物療效,或者拓寬傳統(tǒng)抗生素的抗菌譜［29］。2.2抗菌肽的相互作用目前已有超過7萬種真菌被發(fā)現(xiàn),其中一部分是威脅人類健康的。許多抗菌肽除了抗細菌之外還有抗真菌的功能,其中一個重要因素就是抗菌肽與質(zhì)膜的相互作用［30］。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的抗真菌肽有cecropins、果蠅抗菌肽、線肽素、貽貝素、蝎血素以及人工改造的各種抗菌肽等［31］。研究證明,抗菌肽抗真菌能力與真菌的屬、種和孢子的狀態(tài)有關(guān)［32］。2.3抗菌肽的藥效在全球范圍內(nèi)寄生蟲引起的熱帶疾病已經(jīng)對社會經(jīng)濟造成巨大損失。由于寄生蟲對藥物毒素耐藥性的增加,導(dǎo)致對新型疾病治療方法需求的增加?？咕目捎糜诩膊】刂啤⒅委熕拗鞲腥?或防止攜帶寄生蟲的昆蟲宿主對疾病的傳播。有些抗菌肽可以有效地殺死寄生于人類或動物體內(nèi)的寄生蟲。如:cecropins類似物shiva-1、蛙皮抗菌肽爪蛙素等可以殺死瘧原蟲［33］。來自蛔蟲體內(nèi)的抗菌肽可以殺死利什曼鞭毛蟲［34］。柞蠶抗菌肽cecropinsD對引導(dǎo)毛滴蟲也有殺傷作用［35］。抗菌肽靶目標是寄生蟲的質(zhì)膜,從而間接引起細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)和細胞器改變,干擾細胞正常代謝［36］。2.4肽內(nèi)病毒的組成眾所周知,病毒可以通過感染所有生物細胞進行自我復(fù)制。研究表明,多種抗菌肽都具有抗病毒活性,這些病毒的共同特點是擁有膜結(jié)構(gòu),如艾滋病病毒、皰疹病毒和皰疹病毒型口炎病毒等［35］。抗菌肽可能通過多種機制發(fā)揮抗病毒作用,與病毒的包膜相結(jié)合、抑制病毒的繁殖,或者干擾病毒的組裝合成［37］。2.5重組人細胞肺癌一些陽離子抗菌肽對腫瘤細胞有廣譜殺滅活性效果,這為癌癥患者提供了一類新型的抗癌藥物。其抗腫瘤機制主要有:溶解腫瘤細胞膜、破壞細胞內(nèi)線粒體、對細胞DNA造成損傷、破壞細胞骨架、促進機體免疫效應(yīng)、誘導(dǎo)細胞凋亡、抑制腫瘤血管生成等［38］。目前,已有文獻報道抗菌肽對肝癌細胞、膀胱癌細胞、宮頸癌細胞等的殺傷作用和劑量相關(guān)性研究［39－41］。3抗菌肽抑制或滅微生物的過程抗菌肽的確切作用機制目前還在深入研究中,研究人員提出多種理論假設(shè)來解釋抗菌肽抑制或殺滅微生物的過程。但是抗菌肽的抗菌機制研究只針對個別幾種抗菌肽,所以目前還沒有一個能夠涵蓋所有種類抗菌肽作用機理的假說,且不確定哪種假說更接近真實情況。3.1抗菌肽的作用機制抗菌肽能夠與細胞膜表面相互作用,使膜的通透性改變。陽離子抗菌肽的正電荷區(qū)域與細胞膜上的負電荷區(qū)域相互作用,使抗菌肽分子的疏水端插入細胞膜的脂質(zhì)膜中,進而改變脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)?？咕呐c細胞膜作用后形成跨膜電位,打破酸堿平衡,影響滲透壓平衡,抑制呼吸作用,總之抗菌肽與膜的相互作用直接關(guān)系到抗菌肽的抗菌活性［42］。如圖1［43］所示,目前,常用的至少有4個模型來描述抗菌肽的作用機制。A為聚集體模型(aggregatechannel),即抗菌肽與細胞膜上的磷脂分子結(jié)合成復(fù)合物,一旦復(fù)合物崩潰,抗菌肽就進入到細胞內(nèi),細胞膜也因受到彎曲張力導(dǎo)致細胞死亡。如:鱟肽等［44－46］。B為環(huán)孔模型(toroid-al),認為聚集的抗菌肽分子是垂直嵌入到細胞膜上,其疏水區(qū)的位移可以使細胞膜疏水中心形成裂口,引發(fā)磷脂單分子層向內(nèi)彎曲,形成一個直徑為1~2nm的環(huán)孔。如:magainins等［46－47］。C為桶板模型(barrel-stave),有研究人員指出結(jié)合于細胞膜表面的抗菌肽相互聚集,以多聚體的形式插入細胞膜雙分子層中,因而形成一個跨膜離子通道。離子通道的形成使外界的水分子和離子等可以滲入到細胞內(nèi)部,細胞質(zhì)也可以外流。嚴重時細胞膜會崩裂導(dǎo)致細胞死亡［48］。D為地毯模型(carpet-like),抗菌肽先是平行排列在細胞膜上,當數(shù)量達到一定程度時就像地毯一樣覆蓋在膜表面,以“去垢劑”的作用方式破壞細胞膜而引起細胞死亡。此模型中,地毯模型無需抗菌肽的特殊結(jié)構(gòu),也無需形成孔道,但抗菌肽的正電荷需要分布于多肽全長,且在整個過程中抗菌肽始終與脂質(zhì)頭端作用而無多肽垂直重排過程［49］。3.2抗菌肽的抗菌機制抗菌肽除了作用于細胞膜,還可以作用于細胞內(nèi)的其他靶標?？咕脑谶M入細胞之后,通過與細胞內(nèi)靶標的特異性結(jié)合干擾細胞代謝,達到抑制和殺滅細菌的目的。此理論解釋了許多抗菌肽在非常低的濃度下仍然能夠?qū)е录毦劳龅默F(xiàn)象?？咕闹饕ㄟ^以下幾個方面在細胞內(nèi)發(fā)揮作用:1)與細胞內(nèi)的酸性物質(zhì)結(jié)合,阻斷DNA復(fù)制和RNA合成;2)影響蛋白質(zhì)的合成;3)抑制細胞壁的合成,阻礙細胞分裂;4)抑制細胞內(nèi)酶活性等［4］。Nan等［50］通過對indolicidin的修飾,發(fā)現(xiàn)其類似物IN-3和IN-4可以透過大腸桿菌質(zhì)膜,在細胞內(nèi)積累并與DNA分子結(jié)合。Yenugu等［51］發(fā)現(xiàn)抗菌肽HE2alpha、HE2betal或HE2beta2處理的大腸桿菌也能抑制其蛋白質(zhì)的合成,而且電鏡觀察到細菌細胞膜的變化和胞內(nèi)容物的泄露。Has-per等［52］研究證明,nisin可將LipidⅡ從細胞壁合成位點或隔膜處移除,以阻斷細胞壁的合成。Vin-cent等［53］研究發(fā)現(xiàn),由大腸桿菌質(zhì)粒編碼的細菌素microcinJ25與RNA聚合酶集合后,可阻斷RNA聚合酶中堿基運輸和合成過程中副產(chǎn)物的排出,從而阻止堿基與酶的活性中心集合,抑制RNA聚合酶的活性。綜上所述,抗菌肽的抗菌機制復(fù)雜,抗菌肽不但能夠殺滅大量細菌,還能殺傷腫瘤細胞、真菌、病毒、寄生蟲等?？咕牡淖饔脤ο箅m然種類繁多,但共同的特點是作用于有膜成分的靶標。4來越重要性當今,不同來源的抗菌肽在我們的生活中顯得越來越重要?？咕脑卺t(yī)藥、食品保存、食品添加劑等方面有很高的關(guān)注度,尤其是在抗腫瘤的研究上,得到全世界科研人員的普遍關(guān)注和青睞。4.1抗菌肽的作用機制抗菌肽具有高效、廣譜抗菌,潛在的抗腫瘤活性,以及能加速機體免疫和傷口愈合過程等功能,使其可能成為代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗生素和抗腫瘤藥物的一種新型藥物。由于抗生素的濫用,導(dǎo)致“超級細菌”不斷增多,如:發(fā)生在印度新德里的超級細菌事件,就是一種攜帶肺炎克雷伯菌、大腸桿菌耐藥酶的革蘭氏陰性細菌。而抗菌肽的出現(xiàn)能很好地解決細菌耐藥性的問題,抗菌肽的作用機制與傳統(tǒng)抗生素不同,其代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗生素成為趨勢［54］?？咕目稍诓黄茐娜梭w健康細胞的條件下對人髓樣白血病細胞k552株、艾氏腹水瘤EAC、人宮頸癌細胞、直腸癌HR8340及肝癌細胞BEL27402等起到殺傷作用［55］?？咕膶IV、皰疹病毒等有膜病毒都有一定的殺傷作用:meliiins和cecropins在亞毒性濃度下可以通過對基因表達的影響來抑制艾滋病病毒的增殖［56］。除此之外,抗菌肽還能加速傷口處細胞的分裂增殖:如LL-37通過刺激呼吸道上皮細胞移動與增殖,達到加速傷口愈合的目的［57］。4.2抗菌肽的應(yīng)用醫(yī)藥行業(yè)是抗菌肽應(yīng)用最為廣泛和最有發(fā)展前景的行業(yè),目前國內(nèi)外科研人員在這一領(lǐng)域取得了豐碩的成果,如:美國馬蓋寧公司經(jīng)過設(shè)計改造過的抗菌肽magainin對病毒和腫瘤細胞均有較好的殺傷作用。國內(nèi)的黃自然利用柞蠶抗菌肽研制的治療肝炎的“五齡丸”;中科院上海生化與細胞所張永連課題組研究的抗菌型多肽對男性生殖疾病的檢測與治療具有重要意義;鄧小娟從柞蠶中提取的抗菌肽對耐藥性很強的金黃葡萄球菌有殺菌作用;張為民研究柞蠶抗菌肽對人結(jié)腸癌細胞LS-174T、人胃黏膜上皮細胞株GES-1有殺傷作用,并發(fā)現(xiàn)該抗菌肽在體外對人結(jié)腸癌細胞具有選擇性殺傷作用等。但是,不同種類的抗菌肽在抗菌活性和抗菌譜方面既有相似之處,也有很大的差異,為了尋找更為高效廣譜的生物抗菌肽,仍然需要進一步研究［58］。隨著人們對抗菌肽的結(jié)構(gòu)和作用機制認識的深入,越來越多的科研人員希望改造出具有更高效、廣譜、低毒性的抗菌肽,改造對象主要針對cecropins、magainins和defensins等家族,其中最多的改造研究是cecropins類抗菌肽。如:由shiva-1改造的shiva-2A抗菌活性明顯更強;由cecropinsA和cecropinsD改造的cecropinsAd,具有強烈的抗菌活性而對真核細胞無害;由cecropinsA和melitin合成的cecropins-melitin雜合肽,具有比cecropinsA相似或更強的抗菌活性和抗菌譜等［59］。同樣,將抗菌肽基因?qū)胫参矬w中改造植物,能獲得抗菌植株,或者將抗菌肽基因轉(zhuǎn)入動物體內(nèi)可明顯提高動物的抗病能力［60］。4.3蝦蟹類和魚類抗菌肽我國是水產(chǎn)養(yǎng)殖大國,但是近年來隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的高速發(fā)展,水產(chǎn)養(yǎng)殖病害問題嚴重,制約著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展［61］?？咕氖囚~、蝦、貝類等動物防御素系統(tǒng)的主要成分之一。水生生物抗菌肽研究主要集中在甲殼綱的一些種類,如:鱟、蟹、蝦、貝等,魚類方面也有一些報道,這顯示出抗菌肽在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)上的潛在應(yīng)用前景。研究表明,在對蝦的養(yǎng)殖過程中添加抗菌蛋白,可以顯著提高生長速度、相對增重率、飼料系數(shù)、成活率及抗病能力等［62］?？股貢谒a(chǎn)動物體內(nèi)積累,破壞體內(nèi)正常的菌群平衡,也會造成生態(tài)平衡紊亂。水生生物抗菌肽的高效抗病毒、抗菌作用等為水產(chǎn)養(yǎng)殖的抗病害問題提供了新的解決方案［63］。國內(nèi)在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面的研究已有很多報道,如:鱟素抗菌肽在不同溫度、pH、體外蛋白酶的作用,利用畢赤酵母表達系統(tǒng)表達貽貝抗菌肽,從對蝦體內(nèi)克隆抗菌肽基因等［58］。多種研究說明抗菌肽在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)擁有廣泛的應(yīng)用前景。4.4抗菌肽在動物飼糧中的應(yīng)用近年來,由于抗生素在飼料添加中的廣泛應(yīng)用,造成藥物殘留問題嚴重,從而影響了禽畜產(chǎn)品品質(zhì)和人體健康?？咕木哂歇毺貧⒕鷻C制和抗菌廣譜性,且病原菌不易對抗菌肽產(chǎn)生耐藥性等特性,成為新型飼料添加劑進入人們的視野。研究表明,在動物飼糧中添加抗菌肽能夠抑制病菌繁殖,改善動物腸道菌群結(jié)構(gòu),提高動物生產(chǎn)性能。侯振平等［64］、Tang等［65］、潘行正等［66］發(fā)現(xiàn),在仔豬飼糧添加抗菌肽能夠增加腸道益生菌數(shù)量,控制腹瀉率,提高仔豬生長性能,從而提高成活率。王秀青等［67］、呂尊周等［68］研究發(fā)現(xiàn),雞食用添加抗菌肽的飼料能提高日增重及增強免疫性能。這些研究說明抗菌肽具有促進禽畜機體對營養(yǎng)物質(zhì)的合成和利用,抑制病原菌繁殖,改善腸道菌群結(jié)構(gòu),提高機體免疫能力等作用。4.5抗菌肽的應(yīng)