耐砷土壤中細菌的分離鑒定與培養(yǎng)試驗

耐砷土壤中細菌的分離鑒定與培養(yǎng)試驗

砷（as）是世界著名的有毒元素。人類的生產(chǎn)活動（如使用砷、海防、磺化、采礦、開采和燃燒）可能會導致砷、土壤、水和其他環(huán)境的擴散，從而最終嚴重影響人類的健康。針對土壤和水體中的砷污染，目前的修復措施主要包括吸收、沉淀、離子交換、固定、植物修復等。然而，這些技術成本高、消耗高、廢物處理方法復雜等。近年來，微生物對砷的生物積累和分解被認為是修復砷環(huán)境中的一種非常有效、經(jīng)濟的方法。微生物對砷的生物積累包括對自身代謝產(chǎn)物和細胞的轉(zhuǎn)化。例如，在1891年，gasi從含有高等水分的紙張中分離出具有高耐腐蝕性的短鞭菌，這些短菌可以將砷轉(zhuǎn)化為惡意的含鋯靶點?，F(xiàn)在，許多微生物已經(jīng)證明它們對環(huán)境中的砷具有很高的耐蔭性、生物積累和發(fā)芽能力。例如，1891年，gasi從含有高等水分的紙張中分離出具有高耐腐蝕性的短鞭菌，并且可以將砷轉(zhuǎn)化為惡意含鋯菌。因此，在c.ernansky（h）和lennsky等人的控制下，發(fā)現(xiàn)了具有較高耐腐蝕性的假單胞菌（c）留下香。當砷濃度為100mgl-1時，它們?nèi)匀豢梢院芎玫厣L。當砷濃度為10mgl-1時，5天后分別發(fā)生g，25.823,94gg。根據(jù)c.**和任冠士根的分析，提取的企業(yè)家黃相思的生物量為100g。對于類黃酮類、遺傳誘導類和遺傳誘導類，高度精煉的半甲胺類黃酮類黃酮類、遺傳誘導類、l-116.96和17.06mgl-1的生物量顯著高于未添加對照的硫酸根l-1。這表明細菌對硫酸鈉有一定的生物積累和分解能力。姜友芬等人從新疆奎屯高硫酸鎂環(huán)境中分離出5株抗高血壓藥物。微生物對砷的耐性是其具備生物累積與揮發(fā)能力的基礎,只有先分離出具有高耐砷能力的微生物菌株,才有將其利用于砷污染環(huán)境微生物修復的可能.目前國內(nèi)外針對砷污染環(huán)境中具有高耐砷能力微生物的分離、培養(yǎng)和應用的研究還很少,尤其是國內(nèi)對該方面的研究更為缺乏.因此,本研究從湖南石門與郴州等地的砷污染土壤中分離出耐砷微生物,并通過室內(nèi)培養(yǎng)實驗進行了篩選與耐砷能力驗證,最后對得到的高耐砷菌株進行了形態(tài)與分子鑒定,該結果不僅可為相關研究提供方法借鑒,同時也可以為砷污染環(huán)境微生物修復提供有效的微生物材料.1材料和方法1.1樣品及培養(yǎng)基的制備5個土壤樣品采自湖南省石門縣已有上百年開采歷史的雄黃礦區(qū)(29°38′N,111°01′E),1個土壤樣品采自湖南省郴州市砷污染區(qū)(25°35′N,113°00′E),各采樣點土壤總砷含量及微生物數(shù)量見表1.采集的土壤樣品經(jīng)梯度稀釋后涂布于含砷濃度為500mg·L-1的馬丁培養(yǎng)基上進行真菌的分離,分離出的真菌經(jīng)反復純化后備用.以分析純Na3AsO4·12H2O[As(V)]作為含砷培養(yǎng)基中砷的來源.1.2實驗方法與過程在砷脅迫條件下,大多數(shù)真菌的生長會受到明顯的抑制,而對于具有高耐砷能力的真菌而言抑制作用則不明顯,甚至表現(xiàn)出促進生長的現(xiàn)象.本試驗在此基礎上運用基本的微生物學操作方法設計了如下實驗:將直徑為6mm的真菌菌餅分別接種到土豆-葡萄糖-蛋白胨(PGP)培養(yǎng)基平板上,4個直徑約為5mm的濾紙片蘸取砷溶液后放置于該菌餅的周圍,25℃下培養(yǎng),觀察真菌菌落生長對不同濃度砷的反應.砷濃度設置為:1000、3000、5000、10000、20000、30000mg·L-1.PGP培養(yǎng)基成分為:土豆100g,葡萄糖10g,蛋白胨2.5g,瓊脂20g,超純水1000ml.1.3高效液相色譜法檢測菌干質(zhì)量將Ghosh等報道的方法經(jīng)修改后用于本試驗,具體過程為:將相同厚度且生長速率相同的直徑為6mm的真菌菌餅接入含砷濃度分別為0、10、30、50、80、100、200mg·L-1的50ml液態(tài)PGP培養(yǎng)基中,在轉(zhuǎn)速為140r·min-1,溫度為25℃的搖床上培養(yǎng)2d后,經(jīng)離心將菌懸液與菌質(zhì)分離,離心轉(zhuǎn)速為4000rpm,時間為5min.菌質(zhì)用超純水反復清洗后于50℃下烘干至恒量,測定菌株干質(zhì)量;利用稀釋平板計數(shù)法在含砷濃度為500mg·L-1的固態(tài)PGP培養(yǎng)基上對菌懸液進行孢子計數(shù).1.4upgm模型形態(tài)學鑒定依據(jù)《真菌鑒定手冊》進行;對于篩選出的高耐砷真菌進行基于18SrRNA的分子鑒定,其具體過程參照White等的方法,PCR擴增引物為:ITS5:5’-ggaagtaaaagtcgtaacaagg-3’,ITS4:5’-tcctccgcttattgatatgc-3’.將得到的序列輸入GenBank,與已收錄的真菌基因序列進行BLAST比較.利用CLUSTALX2.0與其他相關真菌序列進行比對,MEGA(3.1)軟件中的Neighbor-Joining模型進行UPGMA分析生成系統(tǒng)發(fā)育樹,發(fā)育樹用Bootstrap法(重復數(shù)為500)檢驗.1.5真菌生物量的多重比較見表1采用Excel2003軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析,利用SPSS11.5軟件中的FisherLSD法對溶液培養(yǎng)條件下真菌的生物量數(shù)據(jù)進行多重比較(P<0.05).2結果與討論2.1真菌分離和可能屬種的篩選從表1可知,砷污染的土壤樣品中分離出的可培養(yǎng)微生物數(shù)量均相對較少,土壤樣品中較高含量的砷在一定程度上可能抑制了土壤微生物的生長.本研究中,經(jīng)含砷濃度為500mg·L-1的培養(yǎng)基初步篩選,6個土壤樣品中一共分離得到13株真菌,其中,采集自湖南石門雄黃礦區(qū)荒地的土壤樣品中分離得到6株,采集自雄黃礦區(qū)礦渣與自然土交界層的土壤樣品中分離得到3株,其他土壤樣品中均分離得到1株.表2中列出了該13株真菌的形態(tài)學主要特征及部分菌株可能的屬種.2.2真菌sm-12f1和濾紙片含砷濃度培養(yǎng)5d后,菌株SM-12F4、CZ-8F1的菌絲已將含砷濾紙片完全覆蓋,培養(yǎng)環(huán)境中的砷并沒有影響該真菌菌落的生長,其可適應的濾紙片含砷濃度均為30000mg·L-1;真菌SM-12F1也表現(xiàn)出很好的菌落生長狀況,其可適應的濾紙片含砷濃度為20000mg·L-1(圖1);較低濃度的砷脅迫明顯抑制了其他真菌的生長.表明即使在砷含量較高的土壤樣品中分離出的真菌仍然對砷具有不同的耐性,菌株SM-12F4、CZ-8F1、SM-12F1相對于其他真菌具有更高的耐砷能力.2.3耐砷能力分析從圖2可以看出,當培養(yǎng)環(huán)境中砷濃度范圍分別為0～50、0～50、0～80mg·L-1時,真菌SM-12F1、CZ-8F1、SM-12F4的生物量均表現(xiàn)出隨砷濃度增加而增加的趨勢,且當砷濃度分別在50、50、80mg·L-1時,菌株SM-12F1、CZ-8F1、SM-12F4的生物量與不加砷的對照相比均有顯著增加.這可能是因為該3株真菌通過新陳代謝利用了培養(yǎng)環(huán)境中的砷,從而促進了自身生物量的增加.微生物對環(huán)境中砷的耐性是其具備生物累積與揮發(fā)砷能力的前提,本研究中SM-12F1、SM-12F4、CZ-8F1均表現(xiàn)出了非常高的耐砷能力,而其他10株真菌的生物量則隨砷濃度增加而下降,培養(yǎng)環(huán)境中的砷明顯抑制了該10株真菌的生長.菌株在不同砷濃度下的產(chǎn)孢情況是評價其耐砷能力的一項重要指標.表3的結果表明,隨著砷濃度的增加,菌株SM-12F1、CZ-8F1、SM-12F4、SM-1F1、SM-5F1、SM-5F7、SM-11F2、SM-12F5的孢子產(chǎn)生量并沒有發(fā)生較大的變化,且當砷濃度從10mg·L-1增加到30mg·L-1時,菌株CZ-8F1的孢子數(shù)量還表現(xiàn)出增加的趨勢.該結果也為利用該菌株制備生物材料,從而應用于砷污染環(huán)境的微生物修復提供了可能.結合各真菌在不同砷濃度下的菌落生長狀況及溶液培養(yǎng)條件下的耐砷情況,菌株SM-12F1、SM-12F4、CZ-8F1表現(xiàn)出了較強的耐砷能力.Levy等總結了微生物耐砷的可能機理:1)砷從微生物細胞內(nèi)排出;2)As(V)還原為As(Ⅲ),后者與體內(nèi)的谷胱甘肽絡合,或儲存于細胞液泡內(nèi),或再排出體外;3)與體內(nèi)的其他蛋白螯合;4)通過甲基化作用將砷轉(zhuǎn)化為氣態(tài)砷化物然后排放到細胞外.本研究中,菌株SM-12F1、SM-12F4、CZ-8F1在一定砷濃度范圍內(nèi)均表現(xiàn)出了隨著砷濃度增加其生物量也增加的趨勢,其原因可能在于培養(yǎng)溶液中的As(V)可能會被該微生物還原為As(III),而該過程中伴隨有能量的產(chǎn)生,從而促進了該菌株生物量的增加,在細胞體內(nèi)產(chǎn)生的As(III)可能會通過各種過程在細胞內(nèi)累積,如與谷胱甘肽或其他蛋白螯合等,也可以被進一步甲基化并最終以氣態(tài)砷化物的形式排出細胞體,從而降低了其毒害作用而提高了菌株的耐砷能力.2.4屬內(nèi)種真菌的生長和形態(tài)鑒定將3株高耐砷真菌的基因序列經(jīng)BLAST與Genbank中已收錄的真菌基因序列進行比對,結果表明,真菌SM-12F1、SM-12F4、CZ-8F1分別與棘孢木霉(Trichodermaasperellum)、微紫青霉(Penicillinjanthinellum)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)相似度最高,其相似度分別為99%、96%和99%.建立的系統(tǒng)發(fā)育樹表明,SM-12F1、SM-12F4、CZ-8F1分別與棘孢木霉、微紫青霉和尖孢鐮刀菌位于同一個進化枝中(圖3).因此,結合形態(tài)鑒定結果,該3株真菌分別鑒定為棘孢木霉、微紫青霉和尖孢鐮刀菌.目前,木霉、青霉、鐮刀菌等屬的真菌己被廣泛認為具有一定的揮發(fā)砷的能力;2002年,Granchinho等分離得到一株尖孢鐮刀霉,該真菌能從外界環(huán)境中生物累積As(V),同時在其細胞內(nèi)檢測到As(Ⅲ)和DMA(二甲基砷),后者是一種易于揮發(fā)的砷化物.對比其他已報道的耐砷真菌,本研究中微紫青霉和棘孢木霉的耐砷能力是第一次報道.然而,目前篩選出的3株高耐砷真菌是否具備生物累積與揮發(fā)砷的能力及其能力的大小仍需要進一步探討.3菌落生長和產(chǎn)孢能力從高砷污染土壤樣品中分離得到13株真菌,在砷濃度分別為30000、30000、20000mg·L-1的脅迫條件下,真菌SM-12F4,CZ-8F1和SM-12F1均表現(xiàn)出