石犀柏種質(zhì)資源遺傳多樣性的rapd分析

石犀柏種質(zhì)資源遺傳多樣性的rapd分析

柏樹(shù)又稱(chēng)成立，屬于白合科天冬屬。這是一種重要的藥物和食品植物。近年來(lái)世界各國(guó)均有栽培,其育種研究得到快速發(fā)展,單交種、雙交種、三交種、無(wú)性系雜交種、全雄雜交種、多倍體石刁柏等新品種不斷涌現(xiàn)。石刁柏為多年生作物,一次種植多年采收,品種好壞直接影響多年生長(zhǎng)周期的產(chǎn)量和品質(zhì)。種質(zhì)資源是產(chǎn)生優(yōu)良品種的基礎(chǔ),對(duì)石刁柏種質(zhì)資源的收集、整理、保存和深入研究,已成為石刁柏種質(zhì)資源學(xué)家的緊迫任務(wù)。已有學(xué)者運(yùn)用形態(tài)學(xué)標(biāo)記和生化標(biāo)記在石刁柏親緣關(guān)系分析和種質(zhì)資源鑒定等方面做了一些工作。近來(lái)分子標(biāo)記(Molecularmarker)在石刁柏目的基因定位和遺傳圖譜的構(gòu)建等方面亦被廣泛采用做了大量工作,但在石刁柏種質(zhì)資源的收集整理、保存和遺傳學(xué)評(píng)價(jià)等基礎(chǔ)研究方面,目前尚缺乏系統(tǒng)分析。隨著人民生活水平的迅速提高,對(duì)石刁柏產(chǎn)品的需求日益增加,供需矛盾越發(fā)明顯,加快新品種的育種研究已成為生產(chǎn)上的迫切需求。本研究采用分子標(biāo)記與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)相結(jié)合的研究方法,對(duì)40多份石刁柏種質(zhì)資源進(jìn)行初步遺傳變異分析,以期為石刁柏品種的選育和種質(zhì)資源合理利用提供依據(jù)。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)地和試劑本實(shí)驗(yàn)材料共43份,42份(Ao1～Ao42)取自濰坊市農(nóng)科院實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(chǎng),1份(Ao43)取自中國(guó)科學(xué)院植物研究所植物園實(shí)驗(yàn)地。供試材料情況見(jiàn)表1。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1相關(guān)形態(tài)學(xué)性狀材料Ao1～Ao42種于濰坊市農(nóng)科院實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)。實(shí)驗(yàn)小區(qū)共0.2hm2,采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),3次重復(fù),株距為25cm,行距1.8m。于2001-2003年觀察記錄不同材料整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育期間的相關(guān)形態(tài)學(xué)性狀,共11個(gè)指標(biāo):莖粗(X1)、第一分枝高度(X2)、株高(X3)、第一分枝高度/株高(X4)、最長(zhǎng)分枝長(zhǎng)度(X5)、分枝節(jié)間距(X6)、花梗顏色(X7)、每簇?cái)M葉數(shù)(X8)、莖數(shù)(X9)、產(chǎn)量(X10)、一級(jí)筍率(X11)。為便于統(tǒng)計(jì)分析,將花梗顏色性狀按全紫賦值為0、半紫半綠(以花梗關(guān)節(jié)為界)賦值為1;每簇?cái)M葉數(shù)按綜合評(píng)分法編碼,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)是:3擬葉,1;4擬葉,2;5擬葉,3;6擬葉,4;7擬葉,5;8擬葉,6。原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后利用SPSSFORWINDOWS(Version10.0)軟件進(jìn)行相關(guān)、聚類(lèi)分析。1.2.2pcr檢測(cè)dna分別剪取不同石刁柏基因型雄株幼嫩擬葉2g提取基因組DNA作為模板,提取參照Rogers和Bendich的CTAB法。DNA純化后用含0.5μg/ml溴化乙錠的0.8%瓊脂糖電泳檢測(cè),將DNA濃度平衡至20ng/μl。PCR反應(yīng)體系如下:20ng/μl模板DNA1μl,10pm/μl隨機(jī)引物2μl(上海生工生物公司),1UTaqPlusDNAPolymerase(天根生化科技公司),10×反應(yīng)緩沖液(200mMTris-HClpH8.4,200mMKCl,15mMMgCl2,天根生化科技公司)2μl,dNTP混合液(2.5Mmeach)1μl(大連寶生物公司),加ddH2O至終體積20μl。擴(kuò)增反應(yīng)在PTC-100PCR儀中進(jìn)行,擴(kuò)增程序?yàn)?94℃30s,35℃10s循環(huán)2次;50℃1s,72℃45s,94℃5s,35℃30s循環(huán)38次;最后72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.8%瓊脂糖凝膠電泳(電泳緩沖液為1×TAE),溴化乙錠染色后用紫外凝膠成像儀觀察照相。用100bpDNALadderMarker作分子量標(biāo)記,每個(gè)樣品的擴(kuò)增帶按有或無(wú)記錄,有賦值為1,無(wú)賦值為0,得到原始數(shù)據(jù)矩陣。用NTSYS-pc軟件(Version2.00)計(jì)算基因型間的Nei氏遺傳相似系數(shù),按非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法(UPGMA)建立各基因型間的聚類(lèi)圖。2結(jié)果與分析2.1石誹柏產(chǎn)量、形態(tài)與枝高的關(guān)系對(duì)石刁柏的11個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行相關(guān)性分析(表2),發(fā)現(xiàn)石刁柏產(chǎn)量與莖粗、株高和莖數(shù)3個(gè)性狀均呈極顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)依次為0.545、0.791、0.713,可見(jiàn)莖粗、株高和莖數(shù)是影響石刁柏產(chǎn)量的主要因素。莖粗和株高與一級(jí)筍率呈極顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.425、0.421,產(chǎn)量與一級(jí)筍率顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.395,說(shuō)明一級(jí)筍率與莖粗、株高、產(chǎn)量具有相同的變化趨勢(shì)。但是一級(jí)筍率卻與花梗顏色呈顯著負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)為-0.394。除產(chǎn)量和一級(jí)筍率外,與株高呈極顯著正相關(guān)的有莖粗、第一分枝高度、莖數(shù)。每簇?cái)M葉數(shù)與株高和第一分枝高度均呈顯著負(fù)相關(guān)。另外,莖粗與第一分枝高度呈顯著正相關(guān)(0.345),說(shuō)明石刁柏莖越粗,第一分枝越高?；üｎ伾c莖粗呈極顯著負(fù)相關(guān),表明花梗全紫的石刁柏莖粗,而花梗半紫半綠的石刁柏莖相對(duì)較細(xì)。2.2美國(guó)各品種10、ao33、ao18、ao3以11個(gè)形態(tài)指標(biāo)作為原始數(shù)據(jù),標(biāo)準(zhǔn)化后計(jì)算石刁柏品種間(OUT)的歐氏距離,對(duì)得到的距離矩陣采用完全連接法(Furthestneighbor)進(jìn)行聚類(lèi)分析,建立親緣關(guān)系聚類(lèi)樹(shù)狀圖(圖1)。42份材料(Ao43除外)可聚為7大類(lèi):第Ⅰ大類(lèi)包括Ao1、Ao41、Ao15、Ao30、Ao40、Ao38、Ao39、Ao33、Ao2、Ao18、Ao5共11份材料,具有第一分枝高度/株高比例較大,每簇?cái)M葉數(shù)為3或5,莖數(shù)較多等共同特點(diǎn);第Ⅱ大類(lèi)包括Ao13、Ao14、Ao7、Ao12、Ao26、Ao29、Ao24、Ao36、Ao23、Ao35、Ao27、Ao34、Ao25、Ao42,具有產(chǎn)量相對(duì)較高、一級(jí)筍率較高、莖較粗、株高相對(duì)較高、除Ao7外均為全雄品系等共同特點(diǎn);第Ⅲ大類(lèi)包括Ao22、Ao28,在43個(gè)基因型中產(chǎn)量最高;第Ⅳ大類(lèi)包括Ao31、Ao37、Ao6,均為美國(guó)品種,產(chǎn)量、一級(jí)筍率較低,每簇?cái)M葉數(shù)變化較大,3至7枚均存在;第Ⅴ大類(lèi)包括Ao10、Ao16、Ao9、Ao11、Ao8、Ao3,一級(jí)筍率較低(除Ao16外),每簇?cái)M葉數(shù)在3～5個(gè),以4個(gè)為主;第Ⅵ大類(lèi)包括Ao20、Ao32、Ao4、Ao19、Ao21,前三者為紫蘆筍,嫩莖粗大,一級(jí)筍率高,花梗全為紫色;Ao17獨(dú)自為第Ⅶ大類(lèi),第一分枝高度較低、每簇?cái)M葉數(shù)在5-8枚之間,以6、7個(gè)居多,整個(gè)株型較小,擬葉偏多。2.3rapp分析2.3.1段大小及基因型間的相似性分析從60個(gè)隨機(jī)引物中篩選出12個(gè)能產(chǎn)生清晰、穩(wěn)定可重復(fù)DNA片段的引物,用以對(duì)供試材料進(jìn)行RAPD擴(kuò)增。在供試材料中共獲得183條擴(kuò)增產(chǎn)物,產(chǎn)生的DNA片段大小主要分布在200～1600bp之間;其中170條具有遺傳多態(tài)性,約占總數(shù)的92.92%;平均每個(gè)引物擴(kuò)增的DNA帶數(shù)超過(guò)15條,多態(tài)性帶超過(guò)14(表3)。各基因型間的相似性系數(shù)分布在0.407～0.931之間,平均相似性為0.765,其中0.7～0.8和0.8～0.9范圍內(nèi)的遺傳相似性系數(shù)分別占總數(shù)的44.65%、38.49%。以上結(jié)果顯示石刁柏基因型之間遺傳多態(tài)性較高。圖2為引物S1對(duì)43個(gè)不同石刁柏基因型進(jìn)行PCR擴(kuò)增所產(chǎn)生的基因組DNA指紋圖譜。2.3.2全雄品種聚類(lèi)分析經(jīng)UPGMA方法建立樹(shù)狀圖(圖3),可將參試品種劃分為8大類(lèi)群。從聚類(lèi)圖中可以看出,第Ⅰ大類(lèi)群可分為2個(gè)亞群,Ao43獨(dú)為一個(gè)亞群,其余為第二個(gè)亞群。根據(jù)材料的地理來(lái)源可以看出,RAPD的聚類(lèi)結(jié)果能在一定程度上反應(yīng)材料間的地理關(guān)系。比如,來(lái)源于法國(guó)的Ao16和Ao17首先聚類(lèi),相似性系數(shù)高達(dá)0.931;美國(guó)所培育的全雄雜交種Ao10、Ao11、Ao13、Ao15、Ao14也聚為一類(lèi),其相似性系數(shù)為0.847～0.908,平均相似性系數(shù)為0.876。德國(guó)品種Ao26和Ao27相似性系數(shù)為0.918,Ao29和Ao30相似性系數(shù)為0.911分別聚成小類(lèi)后再聚成一類(lèi),它們均為全雄株,前三者具有產(chǎn)量相對(duì)較高、一級(jí)筍率較高、莖較粗、株高相對(duì)較高的特點(diǎn)。來(lái)自美國(guó)的Ao6、Ao7、Ao8、Ao9平均相似性系數(shù)為0.856,也在第二個(gè)亞群中聚為一個(gè)小群。另外,Ao1和Ao40聚為一個(gè)小類(lèi),相似性系數(shù)為0.872,親緣關(guān)系很近,這與Ao40為Ao1的后代相符。來(lái)自于不同國(guó)家的Ao23、Ao28、Ao19、Ao16、Ao17、Ao35、Ao20、Ao21、Ao22表現(xiàn)出與一些美國(guó)、德國(guó)品種很高的遺傳相似性。Ao19(新西蘭)與Ao14(美國(guó))(相似性系數(shù)為0.913)聚為小類(lèi)后與法國(guó)的Ao16、Ao17相聚,再與美國(guó)的一些全雄雜交種相聚,表現(xiàn)出很高的遺傳相似性(平均相似性系數(shù)為0.880)。意大利的Ao35與德國(guó)的Ao29、Ao30(遺傳相似性分別為0.875、0.883)親緣關(guān)系比較接近。Ao20(新西蘭)、Ao21(西班牙)、Ao22(荷蘭)聚為一小類(lèi)后,與美國(guó)、德國(guó)等國(guó)家的品種聚在第Ⅰ大類(lèi)群。第Ⅱ大類(lèi)群也分為兩個(gè)亞群。Ao3、Ao25和Ao12為第一亞群。Ao3為美國(guó)的一個(gè)雙交種,Ao25和Ao12分別來(lái)自于荷蘭和美國(guó),二者均為全雄雜交種。第二亞群包括Ao31、Ao38、Ao39、Ao32、Ao34、Ao33六個(gè)基因型,遺傳相似性系數(shù)分別在0.765～0.867之間,變異幅度為0.102,平均相似性系數(shù)為0.817。Ao35、Ao34和Ao36均為來(lái)自意大利的全雄品系,但前兩者分別在第Ⅰ、Ⅱ大類(lèi)群,Ao36獨(dú)為第Ⅴ類(lèi)群,說(shuō)明意大利所培育的這3個(gè)雜交種遺傳多樣性相對(duì)比較豐富。與此類(lèi)似,在荷蘭培育的4個(gè)全雄雜交種中,Ao23和Ao22在第Ⅰ大類(lèi)群,二者的遺傳相似性為0.782,與平均相似性系數(shù)0.765接近,其余兩個(gè)雜交種Ao25和Ao24則分別位于第Ⅱ、Ⅳ大類(lèi)群。Ao38、Ao39和Ao37為美國(guó)不同育種公司生產(chǎn)的UC800品種。從理論上講,同一品種遺傳相似性應(yīng)該很高,但聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)只Ao38和Ao39(遺傳相似性系數(shù)為0.810)聚為一類(lèi),而Ao37竟獨(dú)為第Ⅶ大類(lèi)群,與前兩者的遺傳相似性分別為0.703、0.707,均低于平均相似性系數(shù)0.765。另外Ao4、Ao42、Ao18分別單獨(dú)聚為Ⅲ、Ⅵ、Ⅷ類(lèi)群。Ao4是由美國(guó)加里福尼亞石刁柏種子公司育成的第一個(gè)四倍體紫蘆筍品種,嫩莖比一般二倍體種粗大,紫羅蘭色,生食口感極佳,20世紀(jì)90年代初推廣以后已成為一種高級(jí)生食蔬菜品種。Ao18是1994年由新西蘭推出的一個(gè)無(wú)性系雜交種,出芽早,耐寒,在土壤溫度為8.5℃時(shí)便開(kāi)始萌芽(其余的一般高于10℃)。2.4遺傳距離和多態(tài)位點(diǎn)百分?jǐn)?shù)43個(gè)石刁柏基因型的11個(gè)形態(tài)指標(biāo)依次為莖粗、第一分枝高度、株高、第一分枝高度/株高、最長(zhǎng)分枝長(zhǎng)度、分枝節(jié)間距、花梗顏色、每簇?cái)M葉數(shù)、莖數(shù)、產(chǎn)量、一級(jí)筍率,3個(gè)遺傳多樣性指標(biāo)表示為Y1(多態(tài)位點(diǎn)百分?jǐn)?shù))、Y2(特有帶百分?jǐn)?shù))、Y3(遺傳距離),其偏相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表4。結(jié)果表明,多態(tài)位點(diǎn)百分?jǐn)?shù)與分枝節(jié)間距和每簇?cái)M葉數(shù)均呈顯著正相關(guān),偏相關(guān)系數(shù)分別為0.4231、0.4082。特有帶百分?jǐn)?shù)與莖粗呈極顯著正相關(guān)(0.5241),與花梗顏色顯著相關(guān)(0.4588),但與最長(zhǎng)分枝長(zhǎng)度顯著負(fù)相關(guān)(-0.4542),說(shuō)明特有帶百分?jǐn)?shù)與莖粗和花梗顏色存在相同的變化趨勢(shì),而與最長(zhǎng)分枝長(zhǎng)度存在相反的變化趨勢(shì)。遺傳距離與莖粗、最長(zhǎng)分枝長(zhǎng)度和花梗顏色也存在一定的相關(guān)性,其偏相關(guān)系數(shù)分別為0.4515、0.4760、-0.3868,說(shuō)明莖越粗、分枝越長(zhǎng)的石刁柏,其遺傳多樣性越大,花梗全紫的紫蘆筍比綠蘆筍和白蘆筍遺傳多樣性大。3討論3.1莖粗、株高、產(chǎn)量和花鏡率產(chǎn)量和一級(jí)筍率是評(píng)價(jià)石刁柏質(zhì)量的重要指標(biāo)。田間實(shí)驗(yàn)相關(guān)分析表明:石刁柏產(chǎn)量與莖粗、株高和莖數(shù)均呈極顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)依次為0.545、0.791、0.713,莖粗、株高和莖數(shù)是影響石刁柏產(chǎn)量的3個(gè)主要因素。莖粗、株高和莖數(shù)三者的乘積作為生育指數(shù)可估測(cè)翌年的產(chǎn)量,一般當(dāng)年生育指數(shù)愈高,翌年產(chǎn)量也愈高,反之就低。另外,莖粗、株高、產(chǎn)量3個(gè)變量與一級(jí)筍率顯著相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.425、0.421、0.395,說(shuō)明一級(jí)筍率與莖粗、株高、產(chǎn)量具有相同的變化趨勢(shì),莖越粗,植株越高,產(chǎn)量越高,一級(jí)筍率也越高。但一級(jí)筍率卻與花梗顏色呈顯著負(fù)相關(guān),即花梗全紫的石刁柏一級(jí)筍率高,而花梗半紫半綠的石刁柏一級(jí)筍率不及前者,這是因?yàn)榛üＨ系氖蟀亟^大部分為紫蘆筍,在實(shí)際生產(chǎn)中紫蘆筍的莖一般粗于綠筍和白筍,因此一級(jí)筍率相對(duì)較高。莖粗、植株高度、莖數(shù)構(gòu)成石刁柏產(chǎn)量、品質(zhì)特性,因此品種選育時(shí)要綜合考慮3個(gè)性狀的影響,將提高石刁柏產(chǎn)量與品質(zhì)結(jié)合起來(lái)。3.2石誹柏種質(zhì)資源rapd聚類(lèi)分析在石刁柏種質(zhì)資源的收集、整理、評(píng)價(jià)研究以及今后的種質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)中,形態(tài)學(xué)指標(biāo)是一類(lèi)重要的數(shù)據(jù)資料。特別是在開(kāi)展石刁柏種質(zhì)資源研究的起步階段,積累相關(guān)的形態(tài)學(xué)資料是應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)加速石刁柏種質(zhì)改良的基礎(chǔ)。同時(shí),由于分子標(biāo)記遺傳位點(diǎn)多、多態(tài)性高,已成為理想的標(biāo)記方式。1998年,Hollingsworth等運(yùn)用RAPD嘗試對(duì)6個(gè)石刁柏栽培種進(jìn)行多態(tài)性的鑒定,結(jié)果顯示RAPD可應(yīng)用于鑒定各品種的遺傳變異。本研究采用形態(tài)學(xué)指標(biāo)和分子標(biāo)記所進(jìn)行的聚類(lèi)分析表明,形態(tài)學(xué)聚類(lèi)結(jié)果與分子聚類(lèi)結(jié)果既有重疊,又有不同。例如Ao1、Ao2、Ao5、Ao15、Ao30、Ao40、Ao41在形態(tài)和分子聚類(lèi)結(jié)果中均聚到同一大類(lèi)(第Ⅰ大類(lèi)群);Ao33、Ao38和Ao39雖分布在兩大聚類(lèi)圖不同的大類(lèi)群中,但三者聚類(lèi)結(jié)果比較相似。從整體來(lái)看,分子聚類(lèi)與形態(tài)聚類(lèi)結(jié)果又有許多差異。比如,Ao16和Ao17在分子聚類(lèi)圖中最先聚類(lèi),而在形態(tài)聚類(lèi)圖中二者被分到不同的類(lèi)群當(dāng)中,并且Ao17是單獨(dú)聚類(lèi)。產(chǎn)生這種結(jié)果的原因