海昆腎喜對(duì)糖尿病腎病大鼠腎組織結(jié)締組織生長(zhǎng)因子蛋白表達(dá)的影響

海昆腎喜對(duì)糖尿病腎病大鼠腎組織結(jié)締組織生長(zhǎng)因子蛋白表達(dá)的影響

糖尿病性腎衰竭（dn）是糖尿病最嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一。腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化是各種原因引起的慢性腎臟疾病進(jìn)展至終末期腎病的共同病理特征，糖尿病腎病也存在上述病理過程。一系列生長(zhǎng)因子與細(xì)胞因子在此過程中發(fā)揮重要作用，而結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connectivetissuegrowthfactor,CTGF）是其中關(guān)鍵性的因子之一。因此本實(shí)驗(yàn)建立糖尿病腎病大鼠模型，研究海昆腎喜對(duì)CTGF蛋白表達(dá)的影響，探討海昆腎喜防治DN的作用機(jī)制。材料和方法1.實(shí)驗(yàn)1：scxr京清潔級(jí)雄性SD大鼠60只（購自北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證編號(hào)：SCXR京2004-0006），體質(zhì)量（200±20)g，飼養(yǎng)于通風(fēng)清潔櫥中。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，測(cè)體質(zhì)量、尿蛋白陰性后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)期間，自由飲水，進(jìn)食普通飼料。2.免疫組化試劑海昆腎喜（吉林省輝南長(zhǎng)龍生化藥業(yè)股份有限公司提供，批號(hào)：20030052）；鏈脲佐菌素（Sigma，批號(hào)：S0130）；厄貝沙坦（浙江華海藥業(yè)股份有限公司提供，批號(hào)：S0130）。CTGF免疫組化試劑：CTGF兔抗大鼠、小鼠、人多克隆抗體（Ⅰ抗）（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20060678）;HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（Ⅱ抗）（批號(hào)：20060008）及高敏過氧化物酶復(fù)合物（SABC）（批號(hào)：060608）（武漢博士德生物工程有限公司）。微量加樣器，保濕盒，37℃溫箱，冰箱。3.大鼠的造模及培養(yǎng)60只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按體質(zhì)量隨機(jī)分組：正常組10只，造模組50只。造模組按55mg/kg體質(zhì)量空腹一次性腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）,72h后測(cè)血糖和尿糖，血糖≥16.7mmol/L，尿糖≥4個(gè)+者為造模成功。將造模成功的大鼠按血糖高低隨機(jī)分組，分為模型組、厄貝沙坦組、海昆小劑量組和海昆大劑量組。從造模成功后，厄貝沙坦組（17.5mg/kg）、海昆小劑量組（0.77mg/kg）及海昆大劑量組（3.08mg/kg）大鼠給予相應(yīng)藥物灌胃治療；其余各組大鼠給予等量生理鹽水灌胃。以上各組大鼠均為分籠飼養(yǎng)，給予普通飼料及自由飲水，每天更換墊料，用藥12周。12周末處死大鼠，無菌取腎臟，進(jìn)行腎組織HE、Mallory染色，觀察腎組織病理形態(tài)學(xué)改變，采用免疫組織化學(xué)方法分析腎組織CTGF蛋白的表達(dá)情況。4.觀察方法和指標(biāo)4.1一般條件下的情況4.224小時(shí)尿蛋白測(cè)定實(shí)驗(yàn)4、8、12周末用代謝籠收集24h尿液，記錄尿量，用考馬斯亮蘭法測(cè)OD值，計(jì)算24h尿蛋白含量。4.3血液生化指標(biāo)的測(cè)定用藥第12周周末，進(jìn)行大鼠頸動(dòng)脈取血，分離血清，檢測(cè)血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、甘油三酯(TG)。4.4he，蛇蟲光鏡下觀察腎臟形態(tài)學(xué)變化和組織病理變化。4.5微波修復(fù)90-9715min石蠟切片脫蠟至水；0.01%曲拉通15min37℃；3%H2O2-甲醇20min；微波修復(fù)90℃-98℃15min；山羊血清封閉20min；滴加一抗（1∶200）,4℃過夜；滴加二抗30min37℃；滴加SABC30min37℃；DAB顯色；梯度脫水封片。陰性對(duì)照，一抗用PBS代替。4.6結(jié)果的統(tǒng)計(jì)與分析使用ICMIAS系列多功能圖像分析系統(tǒng)對(duì)腎組織CTGF蛋白結(jié)果進(jìn)行分析，按每組大鼠隨機(jī)選取5個(gè)視野對(duì)腎組織的病變情況進(jìn)行分析，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。5.統(tǒng)計(jì)方法所有數(shù)據(jù)以SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果表示為x-±s，用方差分析法進(jìn)行組間比較。各組大鼠體質(zhì)量及腎喜小劑量的比較實(shí)驗(yàn)期間，模型組大鼠均出現(xiàn)多飲、多食、多尿及消瘦等代謝紊亂的癥狀，體毛減少、凌亂，活動(dòng)減少；并隨時(shí)間的推移出現(xiàn)糖尿病的各種并發(fā)癥狀，如眼部出現(xiàn)白內(nèi)障以及面部、頸部、生殖器及尾部等的感染癥狀等。各治療組大鼠的整體狀況均有改善，其中以海昆腎喜大劑量組為優(yōu)。造模后的各組大鼠的體質(zhì)量與正常組大鼠比較，每周體質(zhì)量均明顯減少，厄貝沙坦組、海昆腎喜小劑量組及海昆腎喜大劑量組大鼠的體質(zhì)量較模型組有所提高，腎臟肥大指數(shù)也較模型組顯著減?。ㄒ姳?）。見表2。造模大鼠在造模4周后，24h尿蛋白顯著增多，而且逐周加重。厄貝沙坦組、海昆腎喜小劑量組及海昆腎喜大劑量組大鼠24h尿蛋白的排泄量均較模型組有所改善，在此時(shí)間段，厄貝沙坦組和海昆腎喜大劑量組大鼠的尿蛋白均較模型組顯著減少（P<0.01），在第12周海昆腎喜小劑量組大鼠的尿蛋白也較模型組減少（P<0.05）。正常組可見正常結(jié)構(gòu)的腎小球和腎小管。模型組大鼠腎小球球囊壁粘連增厚，腎小囊擴(kuò)張，系膜細(xì)胞及基質(zhì)重度增生，毛細(xì)血管腔重度擴(kuò)張，腎小球重度纖維化；腎小管擴(kuò)張，上皮細(xì)胞空泡樣變。厄貝沙坦組腎小球球囊壁輕度粘連增厚，系膜細(xì)胞及基質(zhì)中度增生，毛細(xì)血管腔輕度擴(kuò)張，腎小球中度纖維化；個(gè)別腎小管上皮細(xì)胞空泡樣變。海昆腎喜組腎小球系膜基質(zhì)輕度增厚，球囊壁輕度增厚，腎小囊輕度擴(kuò)張，個(gè)別腎小管上皮細(xì)胞空泡樣變，腎小球輕中度纖維化，并以海昆腎喜大劑量組改善明顯。5.腎間質(zhì)細(xì)胞ctgf表達(dá)見表3。正常組大鼠腎組織中腎小管上皮細(xì)胞、腎間質(zhì)細(xì)胞及腎小球系膜細(xì)胞胞漿中有少量的CTGF表達(dá)；模型組與正常組相比較，腎小管上皮細(xì)胞和腎間質(zhì)細(xì)胞胞漿中CTGF呈強(qiáng)陽性表達(dá)，也有一些腎小球系膜細(xì)胞胞漿內(nèi)CTGF表達(dá)上調(diào)；厄貝沙坦組和海昆腎喜小、大劑量組CTGF的表達(dá)與模型組相比顯著減少，且三者間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。ctgf與腎衰1988年Almendral等首先發(fā)現(xiàn)了小鼠的CTGF,1991年Bradham等在人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基中首次發(fā)現(xiàn)了人類的CTGF。在人類，CTGF廣泛存在于多種組織器官中，以腎臟含量最高。正常生理情況下體內(nèi)的CTGF表達(dá)很低。細(xì)胞通過胞飲方式CTGF從細(xì)胞表面進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，然后聚集在細(xì)胞核周圍，在胞漿中通過激活蛋白激酶或直接影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮作用，主要表現(xiàn)介導(dǎo)細(xì)胞黏附、遷移和增殖、分化、存活的功能，均通過細(xì)胞與基質(zhì)之間作用實(shí)現(xiàn)。DN的病理特征是腎小球硬化和腎小管纖維化。在這兩種病理過程中，CTGF都起著重要的作用。DN腎小球硬化的直接原因是腎小球系膜細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）沉著，在這個(gè)過程中，TGF是致腎小球硬化的最強(qiáng)的細(xì)胞因子。實(shí)驗(yàn)研究表明，TGF的促膠原蛋白合成作用可以完全被CTGF中和性抗體或者CTGF反義核酸所阻斷。CTGF作為TGF的下游調(diào)節(jié)因子，介導(dǎo)和調(diào)節(jié)著TGF的促膠原合成與致硬化作用。另有研究表明，在沒有TGF存在的實(shí)驗(yàn)條件下，CTGF可以直接上調(diào)系膜細(xì)胞中黏連蛋白(FN)、纖溶酶原激活物抑制因子以及1型膠原和4型膠原在系膜細(xì)胞外的積聚，說明CTGF在TGF途徑之外本身可以有致硬化作用。目前認(rèn)為，腎功能衰竭的發(fā)生與發(fā)展和腎小管間質(zhì)的纖維化密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)肥胖型糖尿病db/db模型小鼠腎皮質(zhì)和腎小球的CTGFmRNA含量明顯高于正常小鼠對(duì)照組；當(dāng)DN處于早期階段，系膜增生尚輕微，也還未見間質(zhì)病變和蛋白尿時(shí)，在腎小球區(qū)的CTGF表達(dá)就已經(jīng)升高了。臨床研究發(fā)現(xiàn)在1型糖尿病患者的尿液檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)CTGF，提示CTGF可作為DN進(jìn)展的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。由此可見，CTGF在DN發(fā)生發(fā)展過程中起著極其重要的作用?！昂＠ツI喜”的主要成分是褐藻多糖硫酸酯，它是褐藻類海藻特有的化學(xué)物質(zhì)，是一種水溶性雜聚糖，主要成分是L-褐藻糖-4-硫酸酯，其次還伴隨有少量的半乳糖、甘露糖、木糖、葡萄糖及蛋白質(zhì)、鉀、鈉、鈣、鎂等金屬離子，它的結(jié)構(gòu)特征為1,2-聯(lián)結(jié)的聚-α-L-吡喃褐藻糖，而硫酸酯在C-4位的羥基上。是治療慢性腎衰竭和早期尿毒癥的國(guó)家二類中藥新藥。有實(shí)驗(yàn)研究顯示褐藻多糖硫酸酯能夠中和清除代謝廢物，不僅具有降低血脂、抗血小板聚集、改善血液流變學(xué)的作用，而且具有重建受傷的腎小球基底膜負(fù)電荷屏障的作用，能夠防止系膜基質(zhì)擴(kuò)張和基底膜增生，從而減少尿蛋白量，保護(hù)腎功能；此外臨床研究表明海昆能夠增加腎臟血流量、增強(qiáng)免疫，還能促進(jìn)受損細(xì)胞修復(fù)，能明顯改善各種原因（包括DN）導(dǎo)致的慢性腎衰患者的消化道癥狀，降低Scr和BUN，同時(shí)升高血紅蛋白和血漿白蛋白，使腎衰患者營(yíng)養(yǎng)狀況得到明顯改善。由此可見，海昆腎喜臨床治療DN有確切療效，因此筆者采用海昆腎喜作為實(shí)驗(yàn)用藥。通過筆者的實(shí)驗(yàn)研究表明，從一般狀態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)海昆腎喜能夠改善DN大鼠體質(zhì)量減輕、體毛凌亂、飲食活動(dòng)、各種感染等整體狀態(tài)；從各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)海昆腎喜能夠明顯減少DN大鼠24h尿蛋白的排泄，調(diào)節(jié)DN大鼠血脂異常，降低其血清中TG的濃度（且存在一定的量效關(guān)系，大小劑量之間存在差異，P<0.05），能夠降低DN大鼠Scr和BUN，改善腎功能；從腎臟病理圖片觀察發(fā)現(xiàn)海昆腎喜能夠抑制DN大鼠腎小球系膜細(xì)胞及基質(zhì)增生、球囊壁增厚以及腎小管細(xì)胞的擴(kuò)張和空泡樣變，延緩腎臟纖維化的進(jìn)程，對(duì)腎臟有明顯的保護(hù)作用；從免疫組化方法中CTGF蛋白的表達(dá)情況來看，海昆腎喜對(duì)DN大鼠腎臟保護(hù)作用的機(jī)制可能是通過抑制腎組織CTGF的過度表達(dá)，進(jìn)而延緩DN