耐鹽大豆品種的篩選

耐鹽大豆品種的篩選

受世界氣候惡化、工業(yè)污染加劇、化肥使用不當(dāng)?shù)纫蛩氐挠绊懀寥利}分日益嚴(yán)重，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展受到嚴(yán)重威脅。鹽漬化土壤對(duì)植物生長(zhǎng)的影響主要表現(xiàn)為植株葉片失綠、提早衰亡,降低植株的絕對(duì)/相對(duì)生長(zhǎng)速率和生物量的積累。而耐鹽性強(qiáng)的植株在鹽漬生境下能表現(xiàn)出具有遺傳性的耐鹽性狀。為克服鹽堿環(huán)境對(duì)糧食生產(chǎn)的限制,國(guó)內(nèi)外農(nóng)業(yè)科學(xué)家進(jìn)行了廣泛深入的研究,形成了一個(gè)全新而廣闊的研究領(lǐng)域,并導(dǎo)致一種新型農(nóng)業(yè)——鹽堿農(nóng)業(yè)的興起。而這個(gè)領(lǐng)域研究的一個(gè)重要方面就是農(nóng)作物耐鹽種質(zhì)資源的篩選、評(píng)價(jià)與創(chuàng)新。菜用大豆是以幼嫩豆粒作為蔬菜食用的一種大豆,營(yíng)養(yǎng)豐富,風(fēng)味清香,近年來(lái)栽培面積逐年增加,已成為中國(guó)部分地區(qū)出口創(chuàng)匯的大宗蔬菜品種之一。大量研究結(jié)果表明,大豆種質(zhì)資源間耐鹽性存在較大差異,并且耐鹽機(jī)制各不相同。本研究搜集了國(guó)內(nèi)外15個(gè)菜用大豆栽培品種,采用基質(zhì)培法對(duì)其耐鹽性進(jìn)行篩選,同時(shí)對(duì)篩選出的品種的耐鹽生理特性進(jìn)行了分析,旨在為菜用大豆耐鹽品種的選育、耐鹽機(jī)制的深入研究奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1理想的種苗多,無(wú)低壓藥,國(guó)外在農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,聯(lián)合植物大學(xué),清試材為從國(guó)內(nèi)外搜集的15個(gè)菜用大豆栽培品種:臺(tái)灣75(購(gòu)自浙江浙農(nóng)種業(yè)公司);臺(tái)灣292、遼鮮1號(hào)(購(gòu)自遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院);開(kāi)育10號(hào)、日本青(購(gòu)自遼寧省開(kāi)育市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所);綠領(lǐng)1號(hào)、綠領(lǐng)3號(hào)、綠領(lǐng)8號(hào)、綠領(lǐng)303、綠領(lǐng)特早(購(gòu)自南京綠領(lǐng)種業(yè)有限公司);理想M-5、理想高產(chǎn)95-1(購(gòu)自南京理想種苗有限公司);Sayakomachi(購(gòu)自日本渡邊種苗公司);春舞(購(gòu)自日本雪印種苗公司);天峰(購(gòu)自日本坂田種苗公司)。1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)與材料和處理試驗(yàn)在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)玻璃溫室內(nèi)進(jìn)行。2006年10月1日將干種子直播于上直徑39cm、下直徑26cm、高34cm的塑料盆中,蛭石作基質(zhì),每盆4株。3次重復(fù),每重復(fù)每品種3盆,隨機(jī)排列。真葉展開(kāi)后進(jìn)行NaCl處理。將NaCl溶于1/4濃度日本園試營(yíng)養(yǎng)液中,均勻澆入基質(zhì),每隔2d澆液1次,每盆每次澆液1L。起始NaCl濃度為70mmol/L,以后每次澆液時(shí)遞增30mmol/L,統(tǒng)計(jì)各個(gè)品種的致死濃度(植株2/3以上葉片黃化、萎蔫即視為死亡),并據(jù)此對(duì)不同品種的耐鹽性進(jìn)行分類。選耐鹽級(jí)別不同的3個(gè)品種(耐鹽品種、中等耐鹽品種和鹽敏感品種),分別統(tǒng)計(jì)NaCl濃度為0mmol/L(CK)、75mmol/L、100mmol/L、125mmol/L、150mmol/L、175mmol/L時(shí)的鹽害指數(shù)、植株干重,以驗(yàn)證3個(gè)品種的耐鹽性,并篩選NaCl處理的適宜濃度。試驗(yàn)于2007年3月10日在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)玻璃溫室內(nèi)進(jìn)行,試材培育方法同上。每盆4株,每處理3盆,3次重復(fù),隨機(jī)排列。真葉展開(kāi)后,將NaCl溶于1/4濃度日本園試營(yíng)養(yǎng)液,均勻澆入基質(zhì)中,每隔1d澆液1次,每次澆液1L。處理15d后,統(tǒng)計(jì)各處理植株鹽害指數(shù),然后將植株從盆中取出,用清水將根部的基質(zhì)沖洗干凈,置于恒溫箱中在75℃下烘至恒重,測(cè)其干重。為驗(yàn)證3個(gè)品種成株期與苗期的耐鹽性是否一致,并探討NaCl脅迫下不同品種生理響應(yīng)的差異,在其結(jié)莢期進(jìn)行NaCl處理,統(tǒng)計(jì)各品種的鮮莢產(chǎn)量、植株干重及相關(guān)生理指標(biāo)。處理濃度為上述試驗(yàn)篩選出的NaCl濃度。試驗(yàn)于2007年4月10日在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)玻璃溫室內(nèi)進(jìn)行,試材培育同上,每盆4株。開(kāi)花后12d進(jìn)行NaCl處理,NaCl溶于1/2濃度日本園試營(yíng)養(yǎng)液,均勻澆入基質(zhì)中,每隔1d澆液1次,每次澆液1L。對(duì)照僅澆營(yíng)養(yǎng)液。每處理5盆,3次重復(fù),隨機(jī)排列?；ê?2d開(kāi)始取樣(NaCl處理0d),NaCl處理后,每3d取樣1次,共取樣6次,取植株從上向下第4片完全展開(kāi)葉,測(cè)定其各項(xiàng)生理指標(biāo)。進(jìn)入采收期后,采摘適于采收的豆莢,稱其鮮重,至70%以上鹽敏感品種植株葉片出現(xiàn)明顯鹽害癥狀(退綠、黃化)時(shí)結(jié)束采收(因?yàn)榇藭r(shí)大部分豆莢莢殼變黃,失去商品性),統(tǒng)計(jì)NaCl處理期間單株產(chǎn)量,然后每重復(fù)取5盆,測(cè)其植株干重。1.3生長(zhǎng)和指標(biāo)測(cè)定鹽害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照邵桂花等的方法,并稍加修改。0級(jí):未受害;1級(jí):植株生長(zhǎng)發(fā)育正常,受害葉面積<10%;2級(jí):植株生長(zhǎng)發(fā)育基本正常,受害葉面積達(dá)10%～25%;3級(jí):植株生長(zhǎng)發(fā)育受抑制,受害葉面積達(dá)25%～50%;4級(jí):植株生長(zhǎng)發(fā)育嚴(yán)重受抑制,受害葉面積達(dá)50%～75%;5級(jí):植株死亡或僅有心葉存活。鹽害指數(shù)=×100生理指標(biāo)測(cè)定:采用氮藍(lán)四唑(NBT)光還原法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)活性;過(guò)氧化物酶(POD)活性參照陳建勛等的方法測(cè)定;紫外分光光度法測(cè)定過(guò)氧化氫酶(CAT)活性;抗壞血酸過(guò)氧化物酶活性(APX)參照Nakano等的方法;硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定丙二醛(MDA)含量。1.4統(tǒng)計(jì)分析用SAS軟件進(jìn)行相關(guān)差異顯著性分析,成對(duì)數(shù)據(jù)用t測(cè)驗(yàn)法進(jìn)行分析,多組數(shù)據(jù)用Duncan’s多重比較法進(jìn)行分析。2結(jié)果2.1確定理想高產(chǎn)97-1、綠領(lǐng)3號(hào)為鹽敏感品種由表1可以看出,理想高產(chǎn)95-1、綠領(lǐng)3號(hào)的NaCl致死濃度為190mmol/L;綠領(lǐng)特早、天峰的致死濃度為340mmol/L;其余12品種的致死濃度為250mmol/L,據(jù)此可確定理想高產(chǎn)95-1、綠領(lǐng)3號(hào)為鹽敏感品種;綠領(lǐng)特早、天峰為耐鹽品種;其余為中等耐鹽品種。上述結(jié)果表明,菜用大豆品種間的耐鹽性差異較大。2.2u3000葉片的耐鹽性根據(jù)上述篩選結(jié)果,選3個(gè)耐鹽級(jí)別不同的品種綠領(lǐng)特早、臺(tái)灣75、理想高產(chǎn)95-1,在不同NaCl濃度下對(duì)其耐鹽性進(jìn)行驗(yàn)證,并篩選NaCl處理的臨界濃度。2.2.1不同nacl濃度下的鹽害指數(shù)表2顯示,隨著NaCl濃度的增加,3個(gè)品種的鹽害指數(shù)均逐漸升高,但綠領(lǐng)特早的鹽害指數(shù)在不同NaCl濃度下(75mmol/L時(shí)除外)均顯著低于臺(tái)灣75和理想高產(chǎn)95-1,而臺(tái)灣75的鹽害指數(shù)在不同NaCl濃度下均顯著低于理想高產(chǎn)95-1。相同濃度條件下品種間不同小寫(xiě)字母表示差異達(dá)0.05顯著水平。2.2.2nacl對(duì)3個(gè)品種幼苗干重的影響由表3可知:NaCl濃度為75mmol/L時(shí)3個(gè)品種的幼苗干重均與對(duì)照無(wú)顯著差異;濃度為100mmol/L時(shí)幼苗干重均顯著低于對(duì)照,且隨著NaCl濃度的增加,干物質(zhì)積累量均逐漸降低。說(shuō)明100mmol/LNaCl顯著抑制了3個(gè)品種幼苗干物質(zhì)的積累,并且隨著NaCl濃度的升高受抑制程度逐漸加重,同時(shí)也說(shuō)明100mmol/L是3個(gè)品種進(jìn)行NaCl處理的適宜濃度。同一品種內(nèi)不同小寫(xiě)字母表示差異達(dá)0.05顯著水平。2.2.3個(gè)品種相對(duì)干重的差異由于不同菜用大豆品種在一些植物學(xué)性狀上存在天然差異,如果以這些性狀為指標(biāo)來(lái)衡量不同品種的耐鹽性有可能會(huì)出現(xiàn)謬誤。為此,筆者認(rèn)為用相對(duì)量來(lái)比較不同品種的耐鹽性較為合適。相對(duì)量:品種在NaCl脅迫下某性狀的量占該品種對(duì)照同一性狀量的百分?jǐn)?shù)。表4顯示:隨著NaCl濃度的升高,3個(gè)品種的相對(duì)干重均逐漸降低。NaCl濃度為75mmol/L時(shí)3個(gè)品種的相對(duì)干重?zé)o顯著差異,其余濃度下(125mmol/L除外),綠領(lǐng)特早的相對(duì)干重均顯著高于臺(tái)灣75和理想高產(chǎn)95-1,臺(tái)灣75均顯著高于理想高產(chǎn)95-1;濃度為175mmol/L時(shí),綠領(lǐng)特早的單株干重占對(duì)照的65.28%,而臺(tái)灣75和理想高產(chǎn)95-1僅占對(duì)照的56.93%和46.49%。說(shuō)明隨著NaCl濃度的升高,3個(gè)品種的干物質(zhì)積累均受到顯著抑制,但綠領(lǐng)特早受抑制程度較輕。相同濃度條件下品種間不同小寫(xiě)字母表示差異達(dá)0.05顯著水平。綜上所述,隨著NaCl脅迫濃度的升高,3個(gè)品種的鹽害指數(shù)和干物質(zhì)積累的受抑制程度均逐漸升高。3個(gè)品種相比,綠領(lǐng)特早比臺(tái)灣75和理想高產(chǎn)95-1具有較強(qiáng)的耐鹽性,而臺(tái)灣75的耐鹽性又強(qiáng)于理想高產(chǎn)95-1。這一結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了綠領(lǐng)特早為耐鹽品種,臺(tái)灣75為中等耐鹽品種,理想高產(chǎn)95-1為鹽敏感品種。且表明100mmol/LNaCl是進(jìn)行NaCl處理的適宜濃度。2.3結(jié)莢期試驗(yàn)用上述篩選出的NaCl濃度(100mmol/L)在3個(gè)菜用大豆品種的結(jié)莢期進(jìn)行NaCl處理,以驗(yàn)證其結(jié)莢期的耐鹽性是否與苗期一致。2.3.1對(duì)鮮莢產(chǎn)量和植株干重的影響由表5可知:在100mmol/LNaCl脅迫下,3個(gè)品種的鮮莢產(chǎn)量、植株干重均顯著低于對(duì)照;綠領(lǐng)特早的鮮莢相對(duì)產(chǎn)量和植株相對(duì)干重均顯著高于臺(tái)灣75和理想高產(chǎn)95-1,且臺(tái)灣75均顯著高于理想高產(chǎn)95-1。說(shuō)明100mmol/LNaCl脅迫對(duì)3個(gè)菜用大豆品種的產(chǎn)量形成和植株干物質(zhì)積累均會(huì)產(chǎn)生顯著的抑制作用,但綠領(lǐng)特早的受抑制程度較其它2個(gè)品種輕,可見(jiàn)綠領(lǐng)特早具有較強(qiáng)的耐鹽性,而臺(tái)灣75的耐鹽性又強(qiáng)于理想高產(chǎn)95-1,3個(gè)品種結(jié)莢期的耐鹽性與苗期一致。鮮莢產(chǎn)量和植株干重是在同一品種的對(duì)照與處理間進(jìn)行比較,不同小寫(xiě)字母表示差異達(dá)0.05顯著水平;鮮莢相對(duì)產(chǎn)量和植株相對(duì)干重是在3個(gè)品種間進(jìn)行比較,不同小寫(xiě)字母表示差異達(dá)0.05顯著水平。2.3.2臺(tái)灣65和理想高產(chǎn)65-1的抗氧化活性表6顯示:綠領(lǐng)特早的SOD活性在100mmol/LNaCl脅迫3d、12d時(shí)顯著高于對(duì)照,脅迫15d時(shí)顯著低于對(duì)照,其余時(shí)期均與對(duì)照無(wú)顯著差異;臺(tái)灣75的SOD活性在NaCl脅迫6d、9d時(shí)顯著高于對(duì)照,其余時(shí)期均顯著低于對(duì)照;理想高產(chǎn)95-1的SOD活性在NaCl脅迫3d、15d時(shí)顯著低于對(duì)照,其余時(shí)期均與對(duì)照無(wú)顯著差異。說(shuō)明綠領(lǐng)特早在100mmol/LNaCl脅迫早期即迅速作出響應(yīng),使SOD活性升高,以消除過(guò)量的活性氧,而臺(tái)灣75和理想高產(chǎn)95-1的SOD活性在脅迫早期均受到顯著抑制,且隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),受抑制程度進(jìn)一步加重。表6還顯示:在100mmol/LNaCl脅迫下,綠領(lǐng)特早的POD活性除脅迫3d、15d時(shí)顯著低于對(duì)照外,其余時(shí)期均顯著高于對(duì)照;臺(tái)灣75的POD活性在脅迫6d時(shí)顯著高于對(duì)照,脅迫3d、9d時(shí)與對(duì)照無(wú)顯著差異,其余時(shí)期均顯著低于對(duì)照;理想高產(chǎn)95-1的POD活性在脅迫9d時(shí)顯著高于對(duì)照,其余時(shí)期均顯著低于對(duì)照。就CAT活性而言,綠領(lǐng)特早在100mmol/LNaCl脅迫9d、15d時(shí)顯著低于對(duì)照,其余時(shí)期均顯著高于對(duì)照;臺(tái)灣75在脅迫3d、6d時(shí)顯著高于對(duì)照,脅迫9d時(shí)與對(duì)照無(wú)顯著差異,其余時(shí)期均顯著低于對(duì)照;理想高產(chǎn)95-1在脅迫3d時(shí)與對(duì)照無(wú)顯著差異,脅迫9d時(shí)顯著高于對(duì)照,其余時(shí)期均顯著低于對(duì)照。APX活性方面,綠領(lǐng)特早除脅迫15d時(shí)與對(duì)照無(wú)顯著差異外,其余時(shí)期均顯著高于對(duì)照;臺(tái)灣75在脅迫3d、12d時(shí)與對(duì)照無(wú)顯著差異,脅迫6d、9d時(shí)顯著高于對(duì)照,脅迫15d時(shí)則顯著低于對(duì)照;理想高產(chǎn)95-1在脅迫3d、6d時(shí)顯著高于對(duì)照,脅迫9d、12d時(shí)顯著低于對(duì)照,脅迫15d時(shí)則與對(duì)照無(wú)顯著差異。表明綠領(lǐng)特早的POD、CAT、APX活性在100mmol/LNaCl處理的大部分時(shí)期均受到顯著誘導(dǎo),活性升高,而臺(tái)灣75和理想高產(chǎn)95-1的POD、CAT、APX活性除個(gè)別時(shí)期未受影響或顯著高于對(duì)照外,其余較長(zhǎng)時(shí)間均受到顯著抑制。2.3.3臺(tái)灣65、理想高產(chǎn)65-1與mda的關(guān)系由表7可知:100mmol/LNaCl脅迫下,綠領(lǐng)特早、臺(tái)灣75的MDA含量均呈上升-下降-上升的趨勢(shì),其中綠領(lǐng)特早的MDA含量除脅迫15d時(shí)顯著高于對(duì)照外,其余時(shí)期均與對(duì)照無(wú)顯著差異,臺(tái)灣75的MDA含量在脅迫3d、9d時(shí)與對(duì)照無(wú)顯著差異,其余時(shí)期均顯著高于對(duì)照;理想高產(chǎn)95-1的MDA含量呈逐漸上升的趨勢(shì),除脅迫3d時(shí)與對(duì)照無(wú)顯著差異外,其余時(shí)期均顯著高于對(duì)照。脅迫15d時(shí)綠領(lǐng)特早的MDA含量比對(duì)照增加11.6%,而臺(tái)灣75、理想高產(chǎn)95-1分別比對(duì)照增加16.8%、18.6%。說(shuō)明100mmol/LNaCl脅迫能使臺(tái)灣75、理想高產(chǎn)95-1植株體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧,引起膜脂過(guò)氧化,致使MDA在脅迫前期(6d時(shí))即大量積累;而綠領(lǐng)特早僅在脅迫后期(15d時(shí))才引起MDA過(guò)量積累,且增幅較低。3臺(tái)灣65的耐鹽性對(duì)大豆耐鹽性評(píng)價(jià)有很多種方法,歸納起來(lái),主要有兩類評(píng)價(jià)指標(biāo):一類是生長(zhǎng)指標(biāo);也稱表型指標(biāo);另一類是生理指標(biāo)。生長(zhǎng)指標(biāo)主要包括鹽害指數(shù)、絕對(duì)生物產(chǎn)量/相對(duì)生物產(chǎn)量及絕對(duì)籽粒產(chǎn)量/相對(duì)籽粒產(chǎn)量等;生理指標(biāo)包括鹽離子含量及分布、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、質(zhì)膜透性及與鹽脅迫相關(guān)的酶活性等。本試驗(yàn)以NaCl致死濃度為評(píng)價(jià)指標(biāo),對(duì)15個(gè)菜用大豆品種的耐鹽性進(jìn)行鑒定,篩選出2個(gè)耐鹽品種綠領(lǐng)特早、天峰和2個(gè)鹽敏感品種理想高產(chǎn)95-1、綠領(lǐng)3號(hào)。并在此基礎(chǔ)上,用鹽害指數(shù)、植株相對(duì)干重以及鮮莢相對(duì)產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)耐鹽級(jí)別不同的3個(gè)菜用大豆品種綠領(lǐng)特早(耐鹽)、臺(tái)灣75(中等耐鹽)和理想高產(chǎn)95-1(鹽敏感)的苗期及結(jié)莢期的耐鹽性進(jìn)行了進(jìn)一步鑒定。結(jié)果表明,3個(gè)品種在苗期的耐鹽特性與結(jié)莢期一致,即綠領(lǐng)特早較其余2個(gè)品種具有較強(qiáng)的耐鹽性;臺(tái)灣75的耐鹽性又強(qiáng)于理想高產(chǎn)95-1。上述結(jié)果也表明,以NaCl致死濃度(100mmol/L)為指標(biāo)在苗期對(duì)菜用大豆的耐鹽性進(jìn)行篩選是可行的,而且由于方法簡(jiǎn)單、易于操作,可用于菜用大豆的大批量快速篩選。NaCl脅迫可引起植物產(chǎn)生初級(jí)的滲透脅迫和離子脅迫,使葉綠體和線粒體內(nèi)活性氧分子(Reactiveoxygenspecies,ROS)大量積累,產(chǎn)生次級(jí)氧化脅迫。活性氧分子超氧陰離子(O-2·)、過(guò)氧化氫(H2O2)、羥自由基(HO·)等通過(guò)對(duì)膜脂、蛋白質(zhì)和核酸等細(xì)胞組分的氧化損傷改變正常的細(xì)胞代謝,引起植物傷害?；钚匝跚宄到y(tǒng)由酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)組成,超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)與抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)以及抗氧化物質(zhì)協(xié)同作用,可防御活性氧對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷,以減輕鹽脅迫對(duì)植物細(xì)胞的傷害。組成酶系統(tǒng)的各種酶的活性和非酶系統(tǒng)中各種還原性物質(zhì)或抗氧化物質(zhì)含量的