耐鹽大豆品種的篩選

耐鹽大豆品種的篩選

受世界氣候惡化、工業(yè)污染加劇、化肥使用不當?shù)纫蛩氐挠绊?，土壤鹽分日益嚴重，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展受到嚴重威脅。鹽漬化土壤對植物生長的影響主要表現(xiàn)為植株葉片失綠、提早衰亡,降低植株的絕對/相對生長速率和生物量的積累。而耐鹽性強的植株在鹽漬生境下能表現(xiàn)出具有遺傳性的耐鹽性狀。為克服鹽堿環(huán)境對糧食生產(chǎn)的限制,國內(nèi)外農(nóng)業(yè)科學(xué)家進行了廣泛深入的研究,形成了一個全新而廣闊的研究領(lǐng)域,并導(dǎo)致一種新型農(nóng)業(yè)——鹽堿農(nóng)業(yè)的興起。而這個領(lǐng)域研究的一個重要方面就是農(nóng)作物耐鹽種質(zhì)資源的篩選、評價與創(chuàng)新。菜用大豆是以幼嫩豆粒作為蔬菜食用的一種大豆,營養(yǎng)豐富,風(fēng)味清香,近年來栽培面積逐年增加,已成為中國部分地區(qū)出口創(chuàng)匯的大宗蔬菜品種之一。大量研究結(jié)果表明,大豆種質(zhì)資源間耐鹽性存在較大差異,并且耐鹽機制各不相同。本研究搜集了國內(nèi)外15個菜用大豆栽培品種,采用基質(zhì)培法對其耐鹽性進行篩選,同時對篩選出的品種的耐鹽生理特性進行了分析,旨在為菜用大豆耐鹽品種的選育、耐鹽機制的深入研究奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1理想的種苗多,無低壓藥,國外在農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,聯(lián)合植物大學(xué),清試材為從國內(nèi)外搜集的15個菜用大豆栽培品種:臺灣75(購自浙江浙農(nóng)種業(yè)公司);臺灣292、遼鮮1號(購自遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院);開育10號、日本青(購自遼寧省開育市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所);綠領(lǐng)1號、綠領(lǐng)3號、綠領(lǐng)8號、綠領(lǐng)303、綠領(lǐng)特早(購自南京綠領(lǐng)種業(yè)有限公司);理想M-5、理想高產(chǎn)95-1(購自南京理想種苗有限公司);Sayakomachi(購自日本渡邊種苗公司);春舞(購自日本雪印種苗公司);天峰(購自日本坂田種苗公司)。1.2試驗設(shè)計與材料和處理試驗在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)玻璃溫室內(nèi)進行。2006年10月1日將干種子直播于上直徑39cm、下直徑26cm、高34cm的塑料盆中,蛭石作基質(zhì),每盆4株。3次重復(fù),每重復(fù)每品種3盆,隨機排列。真葉展開后進行NaCl處理。將NaCl溶于1/4濃度日本園試營養(yǎng)液中,均勻澆入基質(zhì),每隔2d澆液1次,每盆每次澆液1L。起始NaCl濃度為70mmol/L,以后每次澆液時遞增30mmol/L,統(tǒng)計各個品種的致死濃度(植株2/3以上葉片黃化、萎蔫即視為死亡),并據(jù)此對不同品種的耐鹽性進行分類。選耐鹽級別不同的3個品種(耐鹽品種、中等耐鹽品種和鹽敏感品種),分別統(tǒng)計NaCl濃度為0mmol/L(CK)、75mmol/L、100mmol/L、125mmol/L、150mmol/L、175mmol/L時的鹽害指數(shù)、植株干重,以驗證3個品種的耐鹽性,并篩選NaCl處理的適宜濃度。試驗于2007年3月10日在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)玻璃溫室內(nèi)進行,試材培育方法同上。每盆4株,每處理3盆,3次重復(fù),隨機排列。真葉展開后,將NaCl溶于1/4濃度日本園試營養(yǎng)液,均勻澆入基質(zhì)中,每隔1d澆液1次,每次澆液1L。處理15d后,統(tǒng)計各處理植株鹽害指數(shù),然后將植株從盆中取出,用清水將根部的基質(zhì)沖洗干凈,置于恒溫箱中在75℃下烘至恒重,測其干重。為驗證3個品種成株期與苗期的耐鹽性是否一致,并探討NaCl脅迫下不同品種生理響應(yīng)的差異,在其結(jié)莢期進行NaCl處理,統(tǒng)計各品種的鮮莢產(chǎn)量、植株干重及相關(guān)生理指標。處理濃度為上述試驗篩選出的NaCl濃度。試驗于2007年4月10日在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)玻璃溫室內(nèi)進行,試材培育同上,每盆4株。開花后12d進行NaCl處理,NaCl溶于1/2濃度日本園試營養(yǎng)液,均勻澆入基質(zhì)中,每隔1d澆液1次,每次澆液1L。對照僅澆營養(yǎng)液。每處理5盆,3次重復(fù),隨機排列。花后12d開始取樣(NaCl處理0d),NaCl處理后,每3d取樣1次,共取樣6次,取植株從上向下第4片完全展開葉,測定其各項生理指標。進入采收期后,采摘適于采收的豆莢,稱其鮮重,至70%以上鹽敏感品種植株葉片出現(xiàn)明顯鹽害癥狀(退綠、黃化)時結(jié)束采收(因為此時大部分豆莢莢殼變黃,失去商品性),統(tǒng)計NaCl處理期間單株產(chǎn)量,然后每重復(fù)取5盆,測其植株干重。1.3生長和指標測定鹽害分級標準參照邵桂花等的方法,并稍加修改。0級:未受害;1級:植株生長發(fā)育正常,受害葉面積<10%;2級:植株生長發(fā)育基本正常,受害葉面積達10%～25%;3級:植株生長發(fā)育受抑制,受害葉面積達25%～50%;4級:植株生長發(fā)育嚴重受抑制,受害葉面積達50%～75%;5級:植株死亡或僅有心葉存活。鹽害指數(shù)=×100生理指標測定:采用氮藍四唑(NBT)光還原法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性;過氧化物酶(POD)活性參照陳建勛等的方法測定;紫外分光光度法測定過氧化氫酶(CAT)活性;抗壞血酸過氧化物酶活性(APX)參照Nakano等的方法;硫代巴比妥酸(TBA)法測定丙二醛(MDA)含量。1.4統(tǒng)計分析用SAS軟件進行相關(guān)差異顯著性分析,成對數(shù)據(jù)用t測驗法進行分析,多組數(shù)據(jù)用Duncan’s多重比較法進行分析。2結(jié)果2.1確定理想高產(chǎn)97-1、綠領(lǐng)3號為鹽敏感品種由表1可以看出,理想高產(chǎn)95-1、綠領(lǐng)3號的NaCl致死濃度為190mmol/L;綠領(lǐng)特早、天峰的致死濃度為340mmol/L;其余12品種的致死濃度為250mmol/L,據(jù)此可確定理想高產(chǎn)95-1、綠領(lǐng)3號為鹽敏感品種;綠領(lǐng)特早、天峰為耐鹽品種;其余為中等耐鹽品種。上述結(jié)果表明,菜用大豆品種間的耐鹽性差異較大。2.2u3000葉片的耐鹽性根據(jù)上述篩選結(jié)果,選3個耐鹽級別不同的品種綠領(lǐng)特早、臺灣75、理想高產(chǎn)95-1,在不同NaCl濃度下對其耐鹽性進行驗證,并篩選NaCl處理的臨界濃度。2.2.1不同nacl濃度下的鹽害指數(shù)表2顯示,隨著NaCl濃度的增加,3個品種的鹽害指數(shù)均逐漸升高,但綠領(lǐng)特早的鹽害指數(shù)在不同NaCl濃度下(75mmol/L時除外)均顯著低于臺灣75和理想高產(chǎn)95-1,而臺灣75的鹽害指數(shù)在不同NaCl濃度下均顯著低于理想高產(chǎn)95-1。相同濃度條件下品種間不同小寫字母表示差異達0.05顯著水平。2.2.2nacl對3個品種幼苗干重的影響由表3可知:NaCl濃度為75mmol/L時3個品種的幼苗干重均與對照無顯著差異;濃度為100mmol/L時幼苗干重均顯著低于對照,且隨著NaCl濃度的增加,干物質(zhì)積累量均逐漸降低。說明100mmol/LNaCl顯著抑制了3個品種幼苗干物質(zhì)的積累,并且隨著NaCl濃度的升高受抑制程度逐漸加重,同時也說明100mmol/L是3個品種進行NaCl處理的適宜濃度。同一品種內(nèi)不同小寫字母表示差異達0.05顯著水平。2.2.3個品種相對干重的差異由于不同菜用大豆品種在一些植物學(xué)性狀上存在天然差異,如果以這些性狀為指標來衡量不同品種的耐鹽性有可能會出現(xiàn)謬誤。為此,筆者認為用相對量來比較不同品種的耐鹽性較為合適。相對量:品種在NaCl脅迫下某性狀的量占該品種對照同一性狀量的百分數(shù)。表4顯示:隨著NaCl濃度的升高,3個品種的相對干重均逐漸降低。NaCl濃度為75mmol/L時3個品種的相對干重?zé)o顯著差異,其余濃度下(125mmol/L除外),綠領(lǐng)特早的相對干重均顯著高于臺灣75和理想高產(chǎn)95-1,臺灣75均顯著高于理想高產(chǎn)95-1;濃度為175mmol/L時,綠領(lǐng)特早的單株干重占對照的65.28%,而臺灣75和理想高產(chǎn)95-1僅占對照的56.93%和46.49%。說明隨著NaCl濃度的升高,3個品種的干物質(zhì)積累均受到顯著抑制,但綠領(lǐng)特早受抑制程度較輕。相同濃度條件下品種間不同小寫字母表示差異達0.05顯著水平。綜上所述,隨著NaCl脅迫濃度的升高,3個品種的鹽害指數(shù)和干物質(zhì)積累的受抑制程度均逐漸升高。3個品種相比,綠領(lǐng)特早比臺灣75和理想高產(chǎn)95-1具有較強的耐鹽性,而臺灣75的耐鹽性又強于理想高產(chǎn)95-1。這一結(jié)果進一步驗證了綠領(lǐng)特早為耐鹽品種,臺灣75為中等耐鹽品種,理想高產(chǎn)95-1為鹽敏感品種。且表明100mmol/LNaCl是進行NaCl處理的適宜濃度。2.3結(jié)莢期試驗用上述篩選出的NaCl濃度(100mmol/L)在3個菜用大豆品種的結(jié)莢期進行NaCl處理,以驗證其結(jié)莢期的耐鹽性是否與苗期一致。2.3.1對鮮莢產(chǎn)量和植株干重的影響由表5可知:在100mmol/LNaCl脅迫下,3個品種的鮮莢產(chǎn)量、植株干重均顯著低于對照;綠領(lǐng)特早的鮮莢相對產(chǎn)量和植株相對干重均顯著高于臺灣75和理想高產(chǎn)95-1,且臺灣75均顯著高于理想高產(chǎn)95-1。說明100mmol/LNaCl脅迫對3個菜用大豆品種的產(chǎn)量形成和植株干物質(zhì)積累均會產(chǎn)生顯著的抑制作用,但綠領(lǐng)特早的受抑制程度較其它2個品種輕,可見綠領(lǐng)特早具有較強的耐鹽性,而臺灣75的耐鹽性又強于理想高產(chǎn)95-1,3個品種結(jié)莢期的耐鹽性與苗期一致。鮮莢產(chǎn)量和植株干重是在同一品種的對照與處理間進行比較,不同小寫字母表示差異達0.05顯著水平;鮮莢相對產(chǎn)量和植株相對干重是在3個品種間進行比較,不同小寫字母表示差異達0.05顯著水平。2.3.2臺灣65和理想高產(chǎn)65-1的抗氧化活性表6顯示:綠領(lǐng)特早的SOD活性在100mmol/LNaCl脅迫3d、12d時顯著高于對照,脅迫15d時顯著低于對照,其余時期均與對照無顯著差異;臺灣75的SOD活性在NaCl脅迫6d、9d時顯著高于對照,其余時期均顯著低于對照;理想高產(chǎn)95-1的SOD活性在NaCl脅迫3d、15d時顯著低于對照,其余時期均與對照無顯著差異。說明綠領(lǐng)特早在100mmol/LNaCl脅迫早期即迅速作出響應(yīng),使SOD活性升高,以消除過量的活性氧,而臺灣75和理想高產(chǎn)95-1的SOD活性在脅迫早期均受到顯著抑制,且隨著脅迫時間的延長,受抑制程度進一步加重。表6還顯示:在100mmol/LNaCl脅迫下,綠領(lǐng)特早的POD活性除脅迫3d、15d時顯著低于對照外,其余時期均顯著高于對照;臺灣75的POD活性在脅迫6d時顯著高于對照,脅迫3d、9d時與對照無顯著差異,其余時期均顯著低于對照;理想高產(chǎn)95-1的POD活性在脅迫9d時顯著高于對照,其余時期均顯著低于對照。就CAT活性而言,綠領(lǐng)特早在100mmol/LNaCl脅迫9d、15d時顯著低于對照,其余時期均顯著高于對照;臺灣75在脅迫3d、6d時顯著高于對照,脅迫9d時與對照無顯著差異,其余時期均顯著低于對照;理想高產(chǎn)95-1在脅迫3d時與對照無顯著差異,脅迫9d時顯著高于對照,其余時期均顯著低于對照。APX活性方面,綠領(lǐng)特早除脅迫15d時與對照無顯著差異外,其余時期均顯著高于對照;臺灣75在脅迫3d、12d時與對照無顯著差異,脅迫6d、9d時顯著高于對照,脅迫15d時則顯著低于對照;理想高產(chǎn)95-1在脅迫3d、6d時顯著高于對照,脅迫9d、12d時顯著低于對照,脅迫15d時則與對照無顯著差異。表明綠領(lǐng)特早的POD、CAT、APX活性在100mmol/LNaCl處理的大部分時期均受到顯著誘導(dǎo),活性升高,而臺灣75和理想高產(chǎn)95-1的POD、CAT、APX活性除個別時期未受影響或顯著高于對照外,其余較長時間均受到顯著抑制。2.3.3臺灣65、理想高產(chǎn)65-1與mda的關(guān)系由表7可知:100mmol/LNaCl脅迫下,綠領(lǐng)特早、臺灣75的MDA含量均呈上升-下降-上升的趨勢,其中綠領(lǐng)特早的MDA含量除脅迫15d時顯著高于對照外,其余時期均與對照無顯著差異,臺灣75的MDA含量在脅迫3d、9d時與對照無顯著差異,其余時期均顯著高于對照;理想高產(chǎn)95-1的MDA含量呈逐漸上升的趨勢,除脅迫3d時與對照無顯著差異外,其余時期均顯著高于對照。脅迫15d時綠領(lǐng)特早的MDA含量比對照增加11.6%,而臺灣75、理想高產(chǎn)95-1分別比對照增加16.8%、18.6%。說明100mmol/LNaCl脅迫能使臺灣75、理想高產(chǎn)95-1植株體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧,引起膜脂過氧化,致使MDA在脅迫前期(6d時)即大量積累;而綠領(lǐng)特早僅在脅迫后期(15d時)才引起MDA過量積累,且增幅較低。3臺灣65的耐鹽性對大豆耐鹽性評價有很多種方法,歸納起來,主要有兩類評價指標:一類是生長指標;也稱表型指標;另一類是生理指標。生長指標主要包括鹽害指數(shù)、絕對生物產(chǎn)量/相對生物產(chǎn)量及絕對籽粒產(chǎn)量/相對籽粒產(chǎn)量等;生理指標包括鹽離子含量及分布、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、質(zhì)膜透性及與鹽脅迫相關(guān)的酶活性等。本試驗以NaCl致死濃度為評價指標,對15個菜用大豆品種的耐鹽性進行鑒定,篩選出2個耐鹽品種綠領(lǐng)特早、天峰和2個鹽敏感品種理想高產(chǎn)95-1、綠領(lǐng)3號。并在此基礎(chǔ)上,用鹽害指數(shù)、植株相對干重以及鮮莢相對產(chǎn)量為評價指標對耐鹽級別不同的3個菜用大豆品種綠領(lǐng)特早(耐鹽)、臺灣75(中等耐鹽)和理想高產(chǎn)95-1(鹽敏感)的苗期及結(jié)莢期的耐鹽性進行了進一步鑒定。結(jié)果表明,3個品種在苗期的耐鹽特性與結(jié)莢期一致,即綠領(lǐng)特早較其余2個品種具有較強的耐鹽性;臺灣75的耐鹽性又強于理想高產(chǎn)95-1。上述結(jié)果也表明,以NaCl致死濃度(100mmol/L)為指標在苗期對菜用大豆的耐鹽性進行篩選是可行的,而且由于方法簡單、易于操作,可用于菜用大豆的大批量快速篩選。NaCl脅迫可引起植物產(chǎn)生初級的滲透脅迫和離子脅迫,使葉綠體和線粒體內(nèi)活性氧分子(Reactiveoxygenspecies,ROS)大量積累,產(chǎn)生次級氧化脅迫?；钚匝醴肿映蹶庪x子(O-2·)、過氧化氫(H2O2)、羥自由基(HO·)等通過對膜脂、蛋白質(zhì)和核酸等細胞組分的氧化損傷改變正常的細胞代謝,引起植物傷害?；钚匝跚宄到y(tǒng)由酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)組成,超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)與抗壞血酸過氧化物酶(APX)以及抗氧化物質(zhì)協(xié)同作用,可防御活性氧對細胞膜系統(tǒng)的損傷,以減輕鹽脅迫對植物細胞的傷害。組成酶系統(tǒng)的各種酶的活性和非酶系統(tǒng)中各種還原性物質(zhì)或抗氧化物質(zhì)含量的