耐鹽酵母在醬油發(fā)酵食品中的應(yīng)用

耐鹽酵母在醬油發(fā)酵食品中的應(yīng)用

耐鹽母是一種具有長期應(yīng)用前景的極端環(huán)境微生物。它在高鹽環(huán)境中是一種非常應(yīng)用的極端微生物。在蔬菜、黃瓜、風(fēng)味轉(zhuǎn)變中，對產(chǎn)品的口感和質(zhì)量有顯著改善。其作為簡單的單細(xì)胞真核微生物不但具有特殊的生理結(jié)構(gòu)和代謝機制,而且能產(chǎn)生許多有著特殊性質(zhì)的生物活性物質(zhì),使其能夠抵抗外界環(huán)境的脅迫。因此,近年來其受到了學(xué)者們的廣泛關(guān)注。本文介紹了耐鹽酵母在醬油等發(fā)酵食品中的應(yīng)用,并結(jié)合前人的研究成果闡述了酵母的耐鹽機理,旨在加強人們對耐鹽酵母的了解,促進其在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用以及相關(guān)學(xué)科的研究。1耐鹽酵母的發(fā)酵醬油是以大豆和小麥為原料,利用微生物分泌的各種酶將植物蛋白質(zhì)及碳水化合物水解、發(fā)酵形成的具有獨特色、香、味、體的液體調(diào)味品。其香氣成分極為復(fù)雜,現(xiàn)在已知有300多種,主要是醇類、醛類、酚類、酯類、呋喃類、吡嗪類等。其相互平衡制約、襯托助長,構(gòu)成醬油特有的醬香和酯香。醬油獨特風(fēng)味是在釀造過程中由微生物引起的一系列生化反應(yīng)形成的,其中原料發(fā)酵成熟的快慢、成品顏色的濃淡以及味道的鮮美主要與米曲霉和醬油曲霉相關(guān),而醬油香味則與酵母菌和乳酸菌有著直接相關(guān)的關(guān)系。酵母在醬油發(fā)酵過程中,可以利用醬醪中的還原糖進行酒精發(fā)酵,發(fā)酵己糖生成醇,賦予醬油醇和酒的香氣,其中乙醇除參與風(fēng)味的形成外,還具有一定的抑菌作用,對于醬油的保存非常有利。日本把乙醇含量作為衡量醬油質(zhì)量的一個重要指標(biāo),要求出口的A級醬油中乙醇含量須大于800mg/100mL。酵母分解亮氨酸和異亮氨酸生成的戊醇和異戊醇與醬油中的有機酸形成酯,可以改善醬油的酯香味,另外在酵母發(fā)酵后期,酵母細(xì)胞自溶,胞內(nèi)富含的蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物等大分子物質(zhì),變成易于人體吸收的小分子物質(zhì),賦予醬油風(fēng)味和營養(yǎng)。傳統(tǒng)生產(chǎn)中,醬油發(fā)酵過程中的酵母主要來自環(huán)境中落入的酵母,其數(shù)量和種類不確定,不利于醬油工業(yè)的現(xiàn)代化生產(chǎn)。另外醬醪發(fā)酵中食鹽的含量很高,尤其在高鹽稀態(tài)發(fā)酵后期,由于水分蒸發(fā)等因素使得醬醪的含鹽量高于18%,嚴(yán)重抑制了酵母菌生長活力。所以,向醬醪中添加耐鹽產(chǎn)香酵母已成為目前人們提高醬油風(fēng)味的主要手段。TRAMPERJ等在日本高鹽稀態(tài)醬油釀造過程中添加耐鹽酵母菌,結(jié)果證實了耐鹽酵母對醬油風(fēng)味的影響。謝韓等將含有耐鹽酵母的生醬油接入低鹽固態(tài)原油中再發(fā)酵一個月后,檢測發(fā)現(xiàn),醬油中還原糖含量下降30%,乙醇含量上升到0.40g/100mL~0.70g/100mL,醬油明顯變得酯香濃郁,鮮甜適口,口味綿長。李琴等在低鹽固態(tài)發(fā)酵工藝生產(chǎn)的二油、三油中添加魯氏酵母AS2.180和球擬酵母AS2.202進行再發(fā)酵和采用先固后稀添加魯氏酵母和球擬酵母澆淋后酵增香用于改善醬油風(fēng)味,結(jié)果采用新工藝生產(chǎn)的醬油無論在感官指標(biāo)還是理化指標(biāo)都比國內(nèi)天然醬油要好。CATRINUSVANDERSLUIS等研究表明,酵母菌通過代謝賦予醬油最具有代表性主體香氣物質(zhì)包括4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-羥基-2-乙基-5-甲基-3-呋喃酮、4-乙基苯酚、4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮,并被STEINHAUSP等通過采用分子感官科學(xué)的方法予以證實。王林祥等對添加了耐鹽酵母的高鹽稀態(tài)醬油中的對酸性和中性揮發(fā)性組分進行了GC/MS分析,共鑒定出59種化合物,發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝相比,添加了耐鹽酵母的產(chǎn)品具有獨特的醬香氣味,且其主要成分為雜環(huán)化合物,如呋喃類、吡嗪類、吡咯類及一些含硫化合物。目前,用于改善醬油風(fēng)味物質(zhì)的耐鹽產(chǎn)香酵母主要有S酵母(Zygosaccharomycesrouxii)、T酵母菌(Torulopsisversatilis)和C酵母菌(Candidaversatilis)3大類。1.1s酵母laa-somS酵母是最常見的高滲透壓酵母菌,在含鹽量為5%~8%的培養(yǎng)基中生長狀態(tài)良好,在含鹽量18%的培養(yǎng)基中仍具有生長能力。其是許多傳統(tǒng)發(fā)酵食品(如醬油、日本味噌(miso)和泰國發(fā)酵魚制品(plaa-som))的生產(chǎn)菌種,目前尚無證據(jù)表明S酵母對人類有致病能力。S酵母是醬油釀造中后期風(fēng)味物質(zhì)形成的重要菌株之一,能夠提供醬油的風(fēng)味物質(zhì)包括乙醇、高級醇、異戊醇(3-甲基-1-丁醇)、異丁醇(2-甲基-1-丙醇)等芳香雜醇類物質(zhì)和4-羥基-5-甲基-3-呋喃酮、4-羥基-2-乙基-5-甲基-3-呋喃酮(HEMFs)、2,5-二甲基-4-羥基-3(2H)-呋喃酮(DMHF)等呋喃酮類化合物。其中,DMHF是具有草莓、芒果、菠蘿等水果風(fēng)味的重要的芳香化合物。HEMFs是一種具有類似小甜餅干的焦糖風(fēng)味的成分,其能代表醬油的主體香氣,在醬油中含量越多越好。1.2t酵母添加量T酵母也是影響醬油風(fēng)味成分的重要菌株。在醬油發(fā)酵中添加T酵母不僅可以增加乙醇產(chǎn)量,也可以產(chǎn)生4-乙基愈創(chuàng)木酚(4-EG)和4-乙基苯酚(4-EP)——賦予醬油一種丁香香味和煙熏味,增加了醬油的圓潤感,且在發(fā)酵前期添加對醬油風(fēng)味的改善效果明顯。人們通常將T酵母與S酵母共同培養(yǎng),讓其協(xié)同發(fā)酵,達到改善醬油風(fēng)味的目的。但T酵母添加量過大,會影響乳酸菌、S酵母和T酵母的代謝平衡,從而影響醬醪的pH值、香氣和滋味。所以T酵母添加時應(yīng)控制其添加量和添加時期。本實驗曾在高鹽稀態(tài)醬醪發(fā)酵的前期(15d)和后期(45d)分別添加S酵母、T酵母和C酵母,通過氣相色譜法對發(fā)酵結(jié)束后的醬醪進行香氣種類和含量分析得出,在不同時期分別添加3種耐鹽酵母的高鹽稀態(tài)醬醪都比未添加酵母的醬醪所產(chǎn)生的風(fēng)味成分要多,尤其在15d添加T酵母明顯高于其他,由此得出T酵母的最佳添加時間是醬醪發(fā)酵的前期(第15d)。1.3由微生物酵母所的細(xì)反應(yīng)制備的魯氏酵母C酵母在醬油發(fā)酵中可以產(chǎn)生酚類化合物(如4-EG和4-EP)。醬油原料——小麥在處理過程中可被分解成阿魏酸(ferulaicacid)和香豆酸(對羥苯丙烯酸,coumaricacid),然后被多變假絲酵母轉(zhuǎn)化成4-EG和4-EP,而這個反應(yīng)不是魯氏酵母所能完成的。另外,C酵母在高鹽條件下還能使麥芽糖發(fā)酵生成乙醇。2化準(zhǔn)確的出口耐鹽酵母在長期的進化過程中已經(jīng)形成了精準(zhǔn)和完善的適應(yīng)機制,使其能夠根據(jù)周圍環(huán)境的變化準(zhǔn)確的做出應(yīng)答。WATANABEY等總結(jié)Z.rouxii耐鹽機制主要有:一是產(chǎn)生胞內(nèi)滲透壓調(diào)節(jié)物(如甘油、海藻糖、游離氨基酸及其衍生物、尿素和甲胺、甜菜堿和肌氨酸等);二是通過Na+-ATP酶和Na+/H+-反向轉(zhuǎn)運蛋白調(diào)節(jié)胞內(nèi)陽離子的動態(tài)平衡。2.1為控制滲透性物質(zhì)和母細(xì)胞耐鹽性能2.1.1hog-mapk級聯(lián)系統(tǒng)調(diào)節(jié)的單次給藥途徑研究發(fā)現(xiàn)了以下幾個隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,人們對酵母菌耐鹽性有了深入的認(rèn)識。酵母對高鹽環(huán)境的適應(yīng)機制主要表現(xiàn)為細(xì)胞在脅迫條件下一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達過程,特別是轉(zhuǎn)錄水平上的激活和阻遏。目前的研究表明,酵母的基因組中大約有200多個基因與酵母的耐鹽性有關(guān)。人們已發(fā)現(xiàn)酵母在高鹽環(huán)境中起作用的信號傳導(dǎo)途徑有高滲透性甘油促分裂原激酶(high-osmolarityglycerolmitogen-activitedproteinkinase,HOG-MAPK)途徑、依賴于Ca+/CaM的鈣調(diào)磷酸酶(CaN)途徑、環(huán)腺-磷蛋白激酶A(cAMP-dependentProteinKinaseA,Ras-cAMPPKA)途徑和雷帕酶素靶分子(targetofrapamycin,TOR)信號途徑。其中,研究比較清楚的當(dāng)屬HOG-MAPK途徑。當(dāng)酵母菌處于高鹽環(huán)境中時,細(xì)胞外的滲透壓大于胞內(nèi)滲透壓,為了阻止胞內(nèi)水分外排,細(xì)胞會作出應(yīng)答,在胞內(nèi)迅速積累甘油來提高胞內(nèi)滲透壓。而甘油的積累正是由MAPK級聯(lián)系統(tǒng)介導(dǎo)的HOG途徑來完成的。MAPK級聯(lián)系統(tǒng)是細(xì)胞適應(yīng)外界環(huán)境變化的一種非常重要的調(diào)控機制。MAPK級聯(lián)系統(tǒng)由3種蛋白激酶組成:MAPK,MAPKK(MAPKkinase)和MAPKKK(MAPKKkinase)。研究發(fā)現(xiàn),HOG途徑上游的滲透壓信號感受體主要通過2條支路進行協(xié)調(diào)控制:一是由Sho1和Ste11跨膜蛋白組成;另一條信號輸入支路相對復(fù)雜,由Sln1,Ypd1和Ssk13組分蛋白組成的跨膜負(fù)荷物構(gòu)成。這2個途徑采用不同的方式進行控制,相對相互獨立,但又不是絕對分開。當(dāng)高鹽滲透信號被Sln1和Sho1支路接受后,Sln1將信號通過Ypd1和Ssk1傳到Ssk2或Ssk22(Ssk2的同工蛋白),Sho1則將信號傳給Cdc42,Cdc42繼而通過Ste20激活Ste11。Ssk2(或Ssk22)和Ste11這2種不同的MAPKKK可以依次將其下游的蛋白激酶MAPKK-Pbs2和HOG-MAPK級聯(lián)的核心分子MAPK-Hog1中的Thr174和Tyr176殘基磷酸化和激活,最終導(dǎo)致Hog1從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移。進入細(xì)胞核的Hog1通過激活Hot1、Msn2/Msn4、Sko1和/或Smp1等轉(zhuǎn)錄因子對產(chǎn)生甘油所需要基因的進行表達,從而開始甘油的積累。表達甘油所需的基因包括GDP1、HSP12和DDR1等,其中GDP1是HOG途徑中典型的甘油表達基因,能夠使細(xì)胞過量合成并積累甘油,在短時間內(nèi)提高胞內(nèi)滲透壓,抵抗高鹽環(huán)境對細(xì)胞帶來的危害。但甘油長時間積累對細(xì)胞生長也是不利的,酵母細(xì)胞中HOG途徑的負(fù)調(diào)控是通過蛋白磷酸酯酶Ptp2、Ptc1、Ptc2和Ptc3對磷酸化的Hog1進行去磷酸化來完成。HOG-MAPK途徑:除了通過控制甘油合成與終止外,甘油通道蛋白(FPS1)在酵母細(xì)胞滲透壓調(diào)節(jié)方面也起著重要的作用。在高鹽脅迫條件下,酵母細(xì)胞會在數(shù)秒內(nèi)收縮,在1min內(nèi)迅速關(guān)閉Fps1,防止甘油外排,與此同時,HOG途徑在很短時間內(nèi)被激活;當(dāng)胞內(nèi)甘油合成過量時,Fps1又會打開,把過量甘油輸送至胞外。酵母細(xì)胞正是在這種精細(xì)準(zhǔn)確的調(diào)控機制之下,才能迅速適應(yīng)外界環(huán)境變化,維持自己的新陳代謝。2.1.2海藻糖的合成海藻糖是酵母細(xì)胞內(nèi)除甘油外的另一種滲透保護劑。CGHOUNSA等報道,由于海藻糖在穩(wěn)定期的積累,使得穩(wěn)定期的釀酒酵母在極度滲透壓環(huán)境下的存活率要明顯高于對數(shù)期的細(xì)胞;不能合成海藻糖的突變株(tps1Δ和tps2Δ)比同源性的野生菌株對高滲環(huán)境更敏感。同樣,分別以葡萄糖和乙醇為碳源的指數(shù)期的酵母細(xì)胞在極度滲透壓的環(huán)境中,前者細(xì)胞死亡率要比后者高3~4倍,與此相對應(yīng)的是前者細(xì)胞內(nèi)無海藻糖檢出而后者可以檢出。在高鹽環(huán)境下,酵母細(xì)胞內(nèi)與海藻糖代謝相關(guān)的基因表達量增加,導(dǎo)致海藻糖大量合成,而在正常狀態(tài)下又會被迅速分解。在釀酒酵母和大腸桿菌等細(xì)胞中海藻糖的合成過程:釀酒酵母的海藻糖合成酶是由TPSI(TSSI)、TPSII(TSSII)和TSLI基因編的多酶復(fù)合物。TPSI基因具有初級調(diào)控功能,若該基因被阻斷,則導(dǎo)致6-磷酸海藻糖合成酶和6-磷酸海藻糖磷酸酯酶失活。BELLW等還證實了在海藻糖合成酶復(fù)合體中TPSI基因、TPSII基因可以編碼熱休克蛋白(hsp),該蛋白可被熱休克誘導(dǎo)合成。2.2高鹽培養(yǎng)基中的atpase酶STEINKRAUS等報導(dǎo)魯氏酵母的細(xì)胞含有一種哇巴因敏感的ATPase,這種酶被認(rèn)為是一種Na+/K+激活的依賴于Mg2+的ATPase,并且適應(yīng)于高鹽環(huán)境的細(xì)胞與原始細(xì)胞相比,含有這種酶的比例較高。WATANBEY等發(fā)現(xiàn)Z.rouxii和S.cervisee中的ATPase的酶學(xué)性質(zhì)僅有微小差別,并且生長于高鹽培養(yǎng)基中的Z.rouxii細(xì)胞的ATPase酶活性比生長在無鹽培養(yǎng)基細(xì)胞內(nèi)要高。IWAKI等對ZrSOD2克隆和基因缺失的研究表明,該轉(zhuǎn)運蛋白依賴質(zhì)膜上ATP酶產(chǎn)生的跨膜H+梯度,將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Na+外排,實現(xiàn)Z.rouxi在高鹽環(huán)境中的生長。2.3膜外排反應(yīng)鹽脅迫時,酵母細(xì)胞除受甘油和海藻糖等相溶性物質(zhì)調(diào)節(jié)外,細(xì)胞壁及細(xì)胞膜等組分、含量和結(jié)構(gòu)也對鹽脅迫作出了應(yīng)答:細(xì)胞膜麥角固醇種類和含量、脂類的組成發(fā)生變化,阻止甘油外排;細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)和甘露聚糖含量下降;胞壁上具有活性功能的某些蛋白質(zhì)阻止鹽進入細(xì)胞,且胞壁蛋白含量與培養(yǎng)基中氯化鈉濃度成正比增加。3耐鹽酵母的使用3.1目前在醬油釀造過程中使用的耐鹽酵母的增香機制尚不十分明確,仍需要采用現(xiàn)代生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)手段,結(jié)合儀器分析等現(xiàn)代技術(shù)進一步研究。3.2耐鹽酵母在醬油生產(chǎn)中應(yīng)用效果受多方面影響,如酵母最適生