微生物的計(jì)數(shù)-血球計(jì)數(shù)板法

微生物的計(jì)數(shù)——血球計(jì)數(shù)板法【摘要】測(cè)定微生物細(xì)胞數(shù)量的方法很多，有分光光度法、顯微直接計(jì)數(shù)法和平板計(jì)數(shù)法。分光光度法比較簡(jiǎn)便，易操作，但是會(huì)使數(shù)據(jù)嚴(yán)重偏大。而平板計(jì)數(shù)法則會(huì)使實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)嚴(yán)重偏小。

顯微計(jì)數(shù)法適用于各種含單細(xì)胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液，如有雜菌或雜質(zhì)，常不易分辨。菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計(jì)數(shù)板，一般細(xì)菌則采用彼得羅夫·霍澤（PetrofHausser）細(xì)菌計(jì)數(shù)板。兩種計(jì)數(shù)板的原理和部件相同，只是細(xì)菌計(jì)數(shù)板較薄，可以使用油鏡觀察。而血球計(jì)數(shù)板較厚，不能使用油鏡，計(jì)數(shù)板下部的細(xì)菌不易看清。本實(shí)驗(yàn)采用血球計(jì)數(shù)板法，主要目的是了解血球計(jì)數(shù)板法的構(gòu)造和使用方法，學(xué)會(huì)用血球計(jì)數(shù)板對(duì)酵母菌細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求1、了解微生物計(jì)數(shù)常用的三種方法：分光光度法；平板計(jì)數(shù)法；血球計(jì)數(shù)板法。2、了解血球計(jì)數(shù)板的構(gòu)造和使用方法。3、學(xué)會(huì)用血球計(jì)數(shù)板對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。二、基本原理利用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，是一種常用的微生物計(jì)數(shù)方法。此法的優(yōu)點(diǎn)是直觀、快速。將經(jīng)過適當(dāng)稀釋的菌懸液（或孢子懸液）放在血球計(jì)數(shù)板載玻片與蓋玻片之間的計(jì)數(shù)室中，在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。由于計(jì)數(shù)室的容積是一定的（0.1mm2），所以可以根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來換算成單位體積內(nèi)的微生物總數(shù)目。由于此法計(jì)得的是活菌體和死菌體的總和，故又稱為總菌計(jì)數(shù)法。血球計(jì)數(shù)板，通常是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)。中間的平臺(tái)又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺(tái)上各刻有一個(gè)方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng)共分九個(gè)大方格，中間的大方格即為計(jì)數(shù)室，微生物的計(jì)數(shù)就在計(jì)數(shù)室中進(jìn)行。計(jì)數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格，一種是一個(gè)大方格分成16個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格；另一種是一個(gè)大方格分成25個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格。但無論是哪種規(guī)格的計(jì)數(shù)板，每一個(gè)大方格中的小方格數(shù)都是相同的，即16×25=400小方格。每一個(gè)大方格邊長(zhǎng)為1mm，則每一大方格的面積為1mm2，蓋上蓋玻片后，載玻片與蓋玻片之間的高度為0．1mm，所以計(jì)數(shù)室的容積為0．1mm3。在計(jì)數(shù)時(shí)，通常數(shù)五個(gè)中方格的總菌數(shù)，然后求得每個(gè)中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一個(gè)大方格中的總菌數(shù)，然后再換算成1ml菌液中的總菌數(shù)。下面以一個(gè)大方格有25個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板為例進(jìn)行計(jì)算：設(shè)五個(gè)中方格中總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，那么，一個(gè)大方格中的總菌數(shù)因1ml=1cm3=1000mm3，=50000A·B（個(gè)）同理，如果是16個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板，設(shè)五個(gè)中方格的總菌數(shù)為A＇，則沒有足夠多的平行數(shù)據(jù)，難以用科學(xué)的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行結(jié)果的計(jì)算，因此難以得到比較準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。因此，搞好酵母細(xì)胞計(jì)數(shù)的質(zhì)量控制一般需采用以下措施。

1）避免技術(shù)誤差，糾正儀器誤差

①所用器材均應(yīng)清潔干燥，計(jì)數(shù)板、血蓋片、微量吸管及刻度吸管的規(guī)格應(yīng)符合要求或經(jīng)過校正。②嚴(yán)格操作，從消毒、稀釋、加樣到計(jì)數(shù)都應(yīng)\o"規(guī)范"規(guī)范，尤其應(yīng)注意的是樣品稀釋要作到充分混勻。必須一次性充滿計(jì)數(shù)室，防止產(chǎn)生氣泡，充入細(xì)胞懸液的量以不超過計(jì)數(shù)室臺(tái)面與蓋玻片之間的矩形邊緣為宜。

2）縮小計(jì)數(shù)域誤差或分布誤差由于血細(xì)胞在充入計(jì)數(shù)室后呈隨機(jī)分布或，而我們所能計(jì)數(shù)的細(xì)胞分布范圍是有限的，由此造成的計(jì)數(shù)誤差稱為計(jì)數(shù)域誤差或分布誤差。縮小這種誤差的有效方法就是盡量擴(kuò)大細(xì)胞計(jì)數(shù)范圍和計(jì)數(shù)數(shù)目，一般先進(jìn)行誤差估計(jì)，然后決定所需計(jì)數(shù)的數(shù)目和計(jì)數(shù)范圍，只要能將誤差控制在允許范圍內(nèi)即可。2、不足之處血球計(jì)數(shù)板在\o"顯微鏡"顯微鏡下直接進(jìn)行測(cè)定。它觀察在一定的容積中的\o"微生物"微生物的個(gè)體數(shù)目，然后推算出含菌數(shù)，簡(jiǎn)便快捷。但是在計(jì)數(shù)時(shí)包括死活細(xì)胞均被計(jì)算在內(nèi)，還有微小雜物也被計(jì)算在內(nèi)。這樣得出結(jié)果往往偏高，因此適用于對(duì)形態(tài)個(gè)體較大的\o"菌體"菌體或\o"孢子"孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)。思考題1、試述血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)原理。為什么用兩種規(guī)格不同的計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)同一樣品，結(jié)果是一樣的？答：每塊計(jì)數(shù)板由H形凹槽分為2個(gè)同樣的計(jì)數(shù)池計(jì)數(shù)池兩側(cè)各有一支持柱，將特制的專用蓋玻片覆蓋其上，形成高0.10mm的計(jì)數(shù)池。計(jì)數(shù)池畫有長(zhǎng)、寬各3.0mm的方格，分為9個(gè)大方格，每個(gè)大格面積為1.0mm;.容積為0.1mm，中央大方格用雙線分成25個(gè)中方格，位于正中及四角5個(gè)中方格是紅細(xì)胞計(jì)數(shù)區(qū)域，用單線劃分為16個(gè)小方格。四角的4個(gè)大方格是白細(xì)胞計(jì)數(shù)區(qū)域，用單線劃分為16個(gè)中方格。血球計(jì)