生物化學(xué)課件：生物化學(xué)-酶

酶

1酶的概念、命名及分類

2酶的化學(xué)本質(zhì)*3酶的結(jié)構(gòu)及功能的關(guān)系*4酶促反應(yīng)的速度和影響因素*5酶的調(diào)節(jié)

6酶的分離提純及活力測定

7酶工程簡介

總結(jié)1一、酶的概念

（一）酶的生物學(xué)意義

6CO2+6H2O+能量C6H12O6+6O2↑植物動物N2+3H2

500℃,300大氣壓Fe2NH3N2+3H22NH3某些微生物酶的化學(xué)本質(zhì)及催化特點(diǎn)由活細(xì)胞產(chǎn)生的,具有高度專一性和高效催化作用的蛋白質(zhì)及核酸2（二）酶是生物催化劑

1．酶與一般催化劑的共同點(diǎn)（1）用量少而催化效率高（2）能加快化學(xué)反應(yīng)的速度，但不改變平衡點(diǎn)，反應(yīng)前后本身不發(fā)生變化如CO2+H2O H2CO3

3（3）降低反應(yīng)所需的活化能4例2H2O2→2H2O+O2

反應(yīng)活化能非催化反應(yīng)75.24kJ/mol鈀催化反應(yīng)48.9kJ/molH2O2酶催化8.36kJ/mol（4）反應(yīng)過程中本身不被消耗52．酶作為生物催化劑的特殊點(diǎn)（1）高的催化效率以摩爾為單位進(jìn)行比較，酶的催化效率比化學(xué)催化劑高107～1013倍，比非催化反應(yīng)高108～1020倍。例2H2O2→2H2O+O2

1molH2O2酶能催化5×106molH2O2的分解1molFe3+只能催化6×10-4molH2O2的分解6（2）高的專一性（3）溫和的反應(yīng)條件（4）酶活性的可調(diào)節(jié)性如酶濃度的調(diào)節(jié)、激素調(diào)節(jié)、反饋調(diào)節(jié)、抑制劑和激活劑的調(diào)節(jié)、別構(gòu)調(diào)節(jié)、酶的共價(jià)修飾調(diào)節(jié)、酶原活化等。（5）酶的不穩(wěn)定性，其催化活力與輔酶、輔基和金屬離子有關(guān)。7概念：酶對所作用的底物有嚴(yán)格的選擇性，一種酶僅能作用于一類物質(zhì)，或者一類分子結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)，或一定的化學(xué)鍵,催化一定的化學(xué)反應(yīng)并生成一定的產(chǎn)物。酶的專一性是酶的特性之一。酶作用的專一性專一性結(jié)構(gòu)專一立體異構(gòu)專一絕對專一相對專一鍵專一基團(tuán)專一旋光異構(gòu)專一幾何異構(gòu)專一（順反異構(gòu)專一）8絕對專一性脲酶琥珀酸脫氫酶++一種酶只催化一種底物CH2COOHCH2COOHCHCOOHCHCOOH29相對專一性脂肪酶消化道蛋白酶一種酶可作用于一類化合物或一種化學(xué)鍵催化脂肪水解酯類水解催化肽鍵水解10立體異構(gòu)專一性底物具有立體異構(gòu)體時(shí)，酶僅作用于其中的一種。L-乳酸脫氫酶

L-乳酸

D-乳酸11（三）酶的化學(xué)本質(zhì)

1．大多數(shù)酶是蛋白質(zhì)JamesBatchellerSumnerJohnHowardNorthrop

1925年，美國化學(xué)家薩姆納首次從刀豆中提純了脲酶，并證明是一種蛋白質(zhì)。美國化學(xué)家諾思譜把一系列酶提純出來，證明它們都是蛋白質(zhì)。他倆因而共同獲得了1946年諾貝爾獎。12ThomasR.CechUniversityofColoradoatBoulder,USA

近年來，一些研究結(jié)果表明，某些RNA分子也有催化活性。

1982年美國科羅拉多大學(xué)的T.R.Cech等人發(fā)現(xiàn)四膜蟲的rRNA前體在完全無蛋白質(zhì)存在的情況下能進(jìn)行自我拼接，得到成熟的rRNA產(chǎn)物，因此首次提出了RNA具有酶活性的概念。2．某些RNA有催化活性 13SidneyAltmanYaleUniversityNewHaven,CT,USA

1983年，耶魯大學(xué)的S.Altman發(fā)現(xiàn)核糖核酸酶P至少能催化六種tRNA前體的加工。真正發(fā)揮催化活性的是核糖核酸酶P中的RNA成分，而其中的蛋白質(zhì)成分是非活性的。酶的化學(xué)本質(zhì)不完全是蛋白質(zhì)，某些RNA分子也具有催化活性。這類RNA被稱為ribozyme（核酶）。Cech和Altman因此獲得1989年的諾貝爾獎。143．有些DNA也有催化活性

1995年Cuenoud等發(fā)現(xiàn)有些DNA分子亦具有催化活性。DNA15抗體：特異性地結(jié)合抗原且?guī)椭奘杉?xì)胞攝入，摧毀抗原。

抗體酶：既是抗體又具有催化功能的蛋白質(zhì)稱為“抗體酶(abzyme)”。因?yàn)樗蔷哂写呋钚缘目贵w；故又稱為“催化性抗體(catalyticantiboy)”

4.抗體酶161986年美國《Science》周刊發(fā)表了來自Lerner和Schultz的有關(guān)具有酶催化性質(zhì)的抗體研究報(bào)告。意義：利用抗體酶專一性地破壞病毒蛋白質(zhì)以及清除體內(nèi)“垃圾”如血管凝快等?？捎糜诳煽ㄒ蛭净颊叩闹委熀蜏p輕癌癥治療的副作用。在制藥工業(yè)，立體專一性的抗體酶有助于解決令人頭痛的對映體拆分的難題。7117（四）酶的組成1．單純蛋白質(zhì)酶類，如脲酶等水解酶，只由氨基酸組成，此外不含其它成分。2.結(jié)合酶類 全酶=酶蛋白

+輔助因子（輔酶、輔基或金屬離子）兩者單獨(dú)存在時(shí)，均無催化活力，只有兩者結(jié)合成完整的分子，才有催化活力。一種酶蛋白需與特殊的輔酶相結(jié)合，才能成為有活性的酶；同一輔酶可以與不同的蛋白相結(jié)合！因此，決定酶催化專一性的是酶的蛋白質(zhì)部分！輔助因子決定催化反應(yīng)的種類！18根據(jù)金屬離子與酶蛋白結(jié)合程度，可分為兩類：金屬酶和金屬激酶。（1/3的酶需要金屬離子作為輔助因子）在金屬酶中,酶蛋白與金屬離子結(jié)合緊密。如Fe2+/Fe3+、Cu+/Cu3

、Zn2+、Mn2+、Co2

等。金屬酶中的金屬離子作為酶的輔助因子，在酶促反應(yīng)中傳遞電子，原子或功能團(tuán)。19金屬酶中的金屬離子與配體

金屬離子配體

酶或蛋白

Mn2

咪唑丙酮酸脫氫酶Fe2+/Fe3+卟啉環(huán)，咪唑，血紅素，含硫配體氧化-還原酶，過氧化氫酶Cu+/Cu2+咪唑，酰胺細(xì)胞色素氧化酶Co2+卟啉環(huán)變位酶Zn2+-NH3，咪唑，（-RS）2碳酸酐酶，醇脫氫酶Pb2

-SHd-氨基-g-酮戊二酸脫水酶Ni2

-SH尿酶20金屬激酶中的金屬離子激酶是一種磷酸化酶類，在ATP存在下催化葡萄糖，甘油等磷酸化。其中的金屬離子與酶的結(jié)合一般較松散。在溶液中，酶與這類離子結(jié)合而被激活。如Na+、K+、Mg2+、Ca2+等。金屬離子對酶有一定的選擇性,某種金屬只對某一種或幾種酶有激活作用。211.穩(wěn)定構(gòu)象：穩(wěn)定酶蛋白催化活性所必需的分子構(gòu)象；2.構(gòu)成酶的活性中心：作為酶的活性中心的組成成分，參與構(gòu)成酶的活性中心；3.連接作用：作為橋梁，將底物分子與酶蛋白螯合起來。金屬離子的作用22二、酶的命名及分類1,根據(jù)其催化底物來命名；2,根據(jù)所催化反應(yīng)的性質(zhì)來命名；3,結(jié)合上述兩個(gè)原則來命名；4,有時(shí)在這些命名基礎(chǔ)上加上酶的來源或其它特點(diǎn)。（一）酶的命名1、習(xí)慣命名法23系統(tǒng)名稱包括底物名稱、構(gòu)型、反應(yīng)性質(zhì)，

2、國際系統(tǒng)命名法：明確標(biāo)明酶的底物及催化反應(yīng)性質(zhì)G-6-P→F-6-PG-6-P異構(gòu)酶底物

反應(yīng)性質(zhì)酶（1）標(biāo)明底物和催化反應(yīng)的性質(zhì)一個(gè)底物參加反應(yīng)24（2）兩個(gè)底物參加反應(yīng)時(shí)應(yīng)同時(shí)列出，中間用冒號（:）分開。如其中一個(gè)底物為水時(shí)，水可略去。例1：丙氨酸+α-酮戊二酸→谷氨酸+丙酮酸丙氨酸:α-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶例2：脂肪+H2O→脂酸+甘油脂肪水解酶

253.系統(tǒng)分類法及編號

1．分類:根據(jù)催化反應(yīng)的性質(zhì)分6大類酶

1.氧化還原酶類oxidoreductase

2.轉(zhuǎn)移酶類transferase

3.水解酶類hydrolase

4.裂合酶類lyase

5.異構(gòu)酶類isomerase

6.連接酶類ligase/synthetase2626

每一個(gè)酶的分類用4個(gè)阿拉伯?dāng)?shù)字的編號表示，數(shù)字中用“·”隔開，前面冠以EC（為EnzymeCommission）。酶的編號：EC1.1.1.1酶學(xué)委員會(EnzymeCommission)大類亞類亞亞類編號

大類：酶催化反應(yīng)的類型

亞類：被催化基團(tuán)或鍵的性質(zhì)

亞亞類：進(jìn)一步說明催化基團(tuán)或鍵的特點(diǎn)2727乳酸脫氫酶EC1.1.1.27第1大類，氧化還原酶第1亞類，氧化基團(tuán)CHOH第1亞亞類，H受體為NAD+/NADP+該酶在亞亞類中的流水編號2828根據(jù)酶催化反應(yīng)的類型水解酶催化底物的加水分解反應(yīng)。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。反應(yīng)通式：AB+H2OAOH+BH例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反應(yīng)：(1)水解酶hydrolase29氧化-還原酶催化氧化-還原反應(yīng)。主要包括脫氫酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。反應(yīng)通式：AH2+BA+BH2如，乳酸(Lactate)脫氫酶催化乳酸的脫氫反應(yīng)。(2)氧化-還原酶Oxidoreductase（最大類）30轉(zhuǎn)移酶催化基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)，即將一個(gè)底物分子的基團(tuán)或原子轉(zhuǎn)移到另一個(gè)底物的分子上。反應(yīng)通式：AR+BA+BR

例如，谷丙轉(zhuǎn)氨酶催化的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。(3)轉(zhuǎn)移酶Transferase31裂合酶催化從底物分子中移去一個(gè)基團(tuán)或原子形成雙鍵的反應(yīng)及其逆反應(yīng)。反應(yīng)通式：AR+BA+BR

主要包括醛縮酶、水化酶及脫氨酶等。例如，延胡索酸水合酶催化的反應(yīng)。(4)裂合酶Lyase32異構(gòu)酶催化各種同分異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)化，即底物分子內(nèi)基團(tuán)或原子的重排過程。反應(yīng)通式：AB

例如，6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶催化的反應(yīng)。(5)異構(gòu)酶Isomerase33合成酶，又稱為連接酶，能夠催化C-C、C-O、C-N以及C-S鍵的形成反應(yīng)。這類反應(yīng)必須與ATP分解反應(yīng)相互偶聯(lián)。A+B+ATP+H-O-H===A

B+ADP+Pi

例如，丙酮酸羧化酶催化的反應(yīng)。丙酮酸+CO2

草酰乙酸

合酶是指催化不與ATP等核苷三磷酸分解相伴的合成反應(yīng)的酶。反應(yīng)形式多為與裂解相反的加成反應(yīng)。

合成酶是與分解ATP釋能相偶聯(lián)，催化由兩種物質(zhì)(雙分子)合成為一種物質(zhì)反應(yīng)的酶。(6)合成酶LigaseorSynthetase34核酸酶是唯一的非蛋白酶。它是一類特殊的RNA，能夠催化RNA分子中的磷酸酯鍵的水解及其逆反應(yīng)。(7)核酸酶（催化核酸）ribozyme35

單體酶肽鏈寡聚酶多酶復(fù)合體多酶體系多功能酶酶的其它分類方法361、單體酶只有一條肽鏈的酶。一般都為水解酶，如胰凝乳酶、溶菌酶、核糖核酸酶等。與單純酶的區(qū)別：單純酶可以是多條肽鏈。2、寡聚酶由兩個(gè)以上亞基組成的酶。如醛縮酶、已糖激酶、過氧化氫酶等糖酵解中的酶都是寡聚酶。3、多酶復(fù)合體催化功能上有聯(lián)系的幾種酶通過非共價(jià)鍵連接而形成的復(fù)合體37丙酮酸脫氫酶復(fù)合體由三種酶組成丙酮酸脫氫酶是1個(gè)定位在線粒體中的多酶復(fù)合體.它是由3種酶:丙酮酸脫氫酶(E1)、二氫硫辛酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(E2)、二氫硫辛酸脫氫酶(E3)和調(diào)節(jié)它的活性的丙酮酸脫氫酶激酶38脂肪酸合成酶由7種酶和一個(gè)?；鶖y帶蛋白構(gòu)成39三、酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系A(chǔ)結(jié)合部位Bindingsite酶分子中與底物結(jié)合的部位或區(qū)域一般稱為結(jié)合部位。（一）酶分子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)40酶分子中促使底物發(fā)生化學(xué)變化的部位稱為催化部位。通常將酶的結(jié)合部位和催化部位總稱為酶的活性部位或活性中心。結(jié)合部位決定酶的專一性，催化部位決定酶所催化反應(yīng)的性質(zhì)。B催化部位catalyticsite41酶分子上具有一定空間構(gòu)象的部位，是酶分子中直接與底物結(jié)合，并和酶催化作用直接有關(guān)的部位，稱為酶的活性中心。酶的活性中心的特點(diǎn)：1、活性中心僅占據(jù)整個(gè)酶體積的很小一部分；2、是一個(gè)具有三維構(gòu)型的實(shí)體；3、底物和酶的活性中心的結(jié)合力很弱；4、誘導(dǎo)適應(yīng)過程；5、含有催化基團(tuán)和結(jié)合基團(tuán)。42酶的活性中心酶的活性中心43活性中心內(nèi)的必需基團(tuán)結(jié)合基團(tuán)(bindinggroup)與底物相結(jié)合催化基團(tuán)(catalyticgroup)催化底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物維持酶活性中心應(yīng)有的空間構(gòu)象所必需?；钚灾行耐獾谋匦杌鶊F(tuán)必需基團(tuán)44底物活性中心以外的必需基團(tuán)結(jié)合基團(tuán)催化基團(tuán)活性中心45主要包括：親核性基團(tuán)：絲氨酸的羥基,半胱氨酸的巰基和組氨酸的咪唑基。酶活性中心的必需基團(tuán)46酸堿性基團(tuán)：天冬氨酸和谷氨酸的羧基，賴氨酸的氨基，酪氨酸的酚羥基，組氨酸的咪唑基和半胱氨酸的巰基等?；钚圆课坏幕鶊F(tuán)都是必需基團(tuán)，但是必需基團(tuán)還包括那些在活性部位以外的，對維持空間構(gòu)象必須的基團(tuán)！47酶分子中存在著一些可以與其他分子發(fā)生某種程度的結(jié)合的部位，從而引起酶分子空間構(gòu)象的變化，對酶起激活或抑制作用。C別構(gòu)部位Regulatorysite48

處于無活性狀態(tài)的酶的前身物質(zhì)就稱為酶原。酶原在一定條件下轉(zhuǎn)化為有活性的酶的過程稱為酶原的激活。這個(gè)過程實(shí)際上就是酶的活性部位形成或暴露的過程。酶原的激活過程通常伴有酶蛋白一級結(jié)構(gòu)的改變。（二）酶原的激活49

酶原激活的機(jī)制為：酶原分子一級結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致了酶原分子空間結(jié)構(gòu)的改變，使催化活性中心得以形成，故使其從無活性的酶原形式轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘拿?。酶原激活的生理意義在于：保護(hù)自身組織細(xì)胞不被酶水解消化。

50

酶原激活的機(jī)理:酶原分子構(gòu)象發(fā)生改變形成或暴露出酶的活性中心

一個(gè)或幾個(gè)特定的肽鍵斷裂，水解掉一個(gè)或幾個(gè)短肽在特定條件下5151胃蛋白酶原（pepsinogen）的激活52賴?yán)i天天天天甘異賴?yán)i天天天天纈組絲SSSS46183甘異纈組絲SSSS腸激酶胰蛋白酶原活性中心胰蛋白酶原的激活過程胰蛋白酶5353（a）鎖鑰學(xué)說

認(rèn)為整個(gè)酶分子的天然構(gòu)象是具有剛性結(jié)構(gòu)的，酶表面具有特定的形狀。酶與底物的結(jié)合如同一把鑰匙對一把鎖一樣剛性模式：EmilFisher提出四、酶作用專一性假說54（b）誘導(dǎo)契合學(xué)說該學(xué)說認(rèn)為酶表面并沒有一種與底物互補(bǔ)的固定形狀，而只是由于底物的誘導(dǎo)才形成了互補(bǔ)形狀.柔性學(xué)說：Koshland提出55底物結(jié)合在酶的活性中心，導(dǎo)致底物分子之間相互靠近，使底物的有效濃度在活性中心附近得以極大升高。

底物結(jié)合在酶的活性中心，指反應(yīng)物的反應(yīng)基團(tuán)

之間、酶的催化基團(tuán)與底物的反應(yīng)基團(tuán)之間的正確取位產(chǎn)生的效應(yīng)。1、鄰近效應(yīng)和定向效應(yīng)（作用基團(tuán)相互鄰近并定向）酶促反應(yīng)的機(jī)制56Distortion(形變)某些基團(tuán)電子云密度改變，產(chǎn)生電子張力，使敏感鍵的一端更加敏感，底物分子發(fā)生形變。

Induced-fit（誘導(dǎo)—鑲嵌）

促使底物進(jìn)一步轉(zhuǎn)換成過渡態(tài)。大大降低反應(yīng)活化能。572.

底物的形變和誘導(dǎo)契合57

向反應(yīng)物提供H+或接受H+以穩(wěn)定過渡態(tài)，加速反應(yīng)酸催化(－OH、－NH3+、＝NH+、-COOH、－SH)A-:H+EHE-H2OEH+OH-+H+AH+B+堿催化(失電子態(tài))A-:B++E-COO-A-+E-COOH

E-COO-+H+3.酸堿催化5858——酶活性中心親電/親核基團(tuán)參與S敏感鍵斷裂的機(jī)制。酶中參與共價(jià)催化的基團(tuán)主要包括His的咪唑基，Cys的硫基，Asp的羧基，Ser的羥基等。4.共價(jià)催化5959親電催化指的是酶活性部位的催化基團(tuán)在催化反應(yīng)過程中汲取底物的電子，產(chǎn)生底物與酶共價(jià)結(jié)合的過渡態(tài)中間物；親核催化是酶活性部位的催化基團(tuán)在反應(yīng)過程中向底物供給電子，產(chǎn)生底物與酶共價(jià)結(jié)合的過渡態(tài)中間物。

60605.金屬離子催化61

結(jié)合底物為反應(yīng)定向。

電荷屏蔽作用。

電子傳遞中間體，可逆的改變金屬離子的氧化態(tài)調(diào)節(jié)氧化還原反應(yīng)。

616.活性部位微環(huán)境的影響活性部位是一個(gè)疏水環(huán)境，介電常數(shù)較低，帶電基團(tuán)之間的作用力較強(qiáng)，有助于催化基團(tuán)與底物的作用。62627.多原催化和協(xié)同效應(yīng)在實(shí)際催化中，上述多種因素可以同時(shí)起作用。

6363五、酶促反應(yīng)動力學(xué)KineticsofEnzyme-CatalyzedReaction

64酶催化反應(yīng)動力學(xué)也稱酶促反應(yīng)動力學(xué)（kineticsofenzyme-catalyzedreactions），是研究酶促反應(yīng)速度以及影響此速度的各種因素的科學(xué)。在研究酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系以及酶的作用機(jī)制時(shí)，需要酶促反應(yīng)動力學(xué)提供相關(guān)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)；為了找到最有利的反應(yīng)條件從而提高酶催化反應(yīng)的效率以及了解酶在代謝過程中的作用和某些藥物的作用機(jī)制等，也需要我們掌握酶促反應(yīng)動力學(xué)的相關(guān)規(guī)律。因此，對于酶促反應(yīng)動力學(xué)的研究既有要的理論意義又具有相當(dāng)?shù)膶?shí)踐價(jià)值。65酶促反應(yīng)動力學(xué)研究各種因素對酶促反應(yīng)速度的影響。影響因素包括有酶濃度、底物濃度、pH、溫度、抑制劑、激活劑等。66單底物、單產(chǎn)物反應(yīng)酶促反應(yīng)速度用單位時(shí)間內(nèi)底物的消耗量和產(chǎn)物的生成量來表示反應(yīng)速度取其初速度，即底物的消耗量很?。ㄒ话阍?﹪以內(nèi)）時(shí)的反應(yīng)速度研究前提67酶活力測定時(shí)需注意：1選擇反應(yīng)的最適溫度，根據(jù)不同的底物和緩沖液選擇反應(yīng)的最適pH。2速度要快，取反應(yīng)的初速度。3底物濃度要足夠大（一般在10Km以上）使酶被底物飽和，以充分反應(yīng)待測酶的活力68在低底物濃度時(shí),反應(yīng)速度與底物濃度成正比，表現(xiàn)為一級反應(yīng)特征。當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到一定值，幾乎所有的酶都與底物結(jié)合后，反應(yīng)速度達(dá)到最大值（Vmax），此時(shí)再增加底物濃度，反應(yīng)速度不再增加，表現(xiàn)為零級反應(yīng)。（一）底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響69（一）米氏方程式中間產(chǎn)物學(xué)說E+Sk1k2k3ESE+P70

71※1913年Michaelis和Menten提出反應(yīng)速度與底物濃度關(guān)系的數(shù)學(xué)方程式，即米氏方程式，簡稱米氏方程式(Michaelisequation)。vVmax[S]Km+[S]＝72米氏方程式推導(dǎo)基于兩個(gè)假設(shè)：①反應(yīng)剛剛開始，產(chǎn)物的生成量極少，逆反應(yīng)可不予考慮。②［S］超過［E］，［S］的變化可忽略不計(jì)。73當(dāng)v=Vmax/2時(shí)Km＝[S]1.Km值等于酶促反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度，單位是mol/L。2＝Km+[S]VmaxVmax[S]VmaxV[S]KmVmax/2（二）Km與Vmax的意義74

2.Km可近似表示酶對底物的親和力；當(dāng)K2>>K3時(shí)，Km≈Ks

Km越小，酶與底物的親和力越大。75

3.可用于判斷反應(yīng)級數(shù)：

當(dāng)[S]<0.01Km時(shí)，反應(yīng)為一級反應(yīng)當(dāng)[S]>100Km時(shí)，ν=Vmax，反應(yīng)為零級反應(yīng)當(dāng)0.01Km<[S]<100Km時(shí)，為混合級反應(yīng)764.

Km是酶的特征性常數(shù)：在一定條件下，某種酶的Km值是恒定的，因而可以通過測定不同酶（特別是一組同工酶）的Km值，來判斷是否為不同的酶。5.

Km可用來判斷酶的最適底物：當(dāng)酶有幾種不同的底物存在時(shí)，通過測定酶在不同底物存在時(shí)的Km值，Km值最小者，即為該酶的最適底物。6.

可用來確定酶活性測定時(shí)所需的底物濃度：77米氏常數(shù)的應(yīng)用價(jià)值Km是酶的一個(gè)特征性常數(shù)：也就是說Km的大小只與酶本身的性質(zhì)有關(guān)，而與酶濃度無關(guān)。Km值還可以用于判斷酶的專一性和天然底物，Km值最小的底物往往被稱為該酶的最適底物或天然底物。Km可以作為酶和底物結(jié)合緊密程度的—個(gè)度量指標(biāo)，用來表示酶與底物結(jié)合的親和力大小。已知某個(gè)酶的Km值，就可以計(jì)算出在某一底物濃度條件下，其反應(yīng)速度相當(dāng)于Vmax的百分比。Km值還可以幫助我們推斷具體條件下某一代謝反應(yīng)的方向和途徑，只有Km值小的酶促反應(yīng)才會在競爭中占優(yōu)勢。787.Vmax

Vmax是酶完全被底物飽和時(shí)的反應(yīng)速度，一定酶濃度下，酶對特定底物的Vmax也是一個(gè)常數(shù)。Kcat

當(dāng)酶被底物充分飽和時(shí)，單位時(shí)間內(nèi)每個(gè)酶分子催化底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的分子數(shù),叫做酶的轉(zhuǎn)換數(shù)。可用來比較每單位酶的催化能力。

79（三）Ｋm值與Ｖmax值的測定雙倒數(shù)作圖法(doublereciprocalplot)，又稱為林-貝氏(Lineweaver-Burk)作圖法Vmax[S]Km+[S]v=（林－貝氏方程）兩邊同取倒數(shù)80

雙倒數(shù)作圖法81（二）pH的影響在一定的pH下,酶具有最大的催化活性,通常稱此pH為最適pH。唾液精氨酸酶胃蛋白酶最適pH是酶的特性之一82（三）溫度的影響一方面是溫度升高,酶促反應(yīng)速度加快。另一方面,溫度升高,酶的高級結(jié)構(gòu)將發(fā)生變化或變性，導(dǎo)致酶活性降低甚至喪失。因此大多數(shù)酶都有一個(gè)最適溫度。在最適溫度條件下,反應(yīng)速度最大。83一般來說，動物細(xì)胞內(nèi)的酶最適溫度一般為35～40℃，植物細(xì)胞中的酶最適溫度較動物細(xì)胞中稍高，通常在40～50℃之間，而微生物中的酶最適溫度差別則較大，如用于進(jìn)行PCR反應(yīng)的TaqDNA聚合酶的最適溫度可高達(dá)70℃。84（四）激活劑對反應(yīng)速度的影響凡是能提高酶活性的物質(zhì)都稱為激活劑(activator)，而激活劑中大部分是無機(jī)離子或簡單的有機(jī)化合物。作為激活劑的金屬離子主要包括K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Zn2+及Fe2+等離子，無機(jī)陰離子主要包括Cl-、Br-、I-、CN-、PO4-等。如Mg2+可以作為多種激酶及合成酶的激活劑，Cl-可以作為唾液淀粉酶的激活劑。

85（五）抑制劑對酶活性的影響使酶的活性降低或喪失的現(xiàn)象，稱為酶的抑制作用。能夠引起酶的抑制作用的化合物則稱為抑制劑。酶的抑制劑一般具備兩個(gè)方面的特點(diǎn)：a.在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與被抑制的底物分子或底物的過渡狀態(tài)相似。b.能夠與酶的活性中心以非共價(jià)或共價(jià)的方式形成比較穩(wěn)定的復(fù)合體或結(jié)合物。86

抑制劑的作用方式a.不可逆抑制抑制劑與酶反應(yīng)中心的活性基團(tuán)以共價(jià)形式結(jié)合，引起酶的永久性失活。如有機(jī)磷毒劑二異丙基氟磷酸酯。87

抑制劑與酶分子的必需基團(tuán)共價(jià)結(jié)合引起酶活性的抑制，且不能采用透析等簡單方法使酶活性恢復(fù)的抑制作用就是不可逆抑制作用。酶的不可逆抑制作用包括非專一性抑制（如有機(jī)磷農(nóng)藥對膽堿酯酶的抑制）和專一性抑制（如路易士氣對巰基酶的抑制）兩種。

88

非專一性不可逆抑制劑主要包括以下六大類：a) 有機(jī)磷化合物。b) 有機(jī)汞、有機(jī)砷化合物：抑制含巰基的酶。c) 重金屬鹽：能使酶蛋白變性而失活。d) 烷化劑：與酶必需基團(tuán)中的巰基、氨基、羧基、咪唑基和硫醚基等結(jié)合，從而抑制酶活性。e) 硫化物、氰化物和CO：這類物質(zhì)能通過與酶中金屬離子形成較為穩(wěn)定絡(luò)合物的形式，來抑制酶的活性。f) 青霉素（Penicillin）：青霉素可通過與糖肽轉(zhuǎn)肽酶活性部位絲氨酸羥基共價(jià)結(jié)合的方式，使糖肽轉(zhuǎn)肽酶失活，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁合成受阻，從而損害細(xì)菌生長。89a.有機(jī)磷化合物(敵百蟲、敵敵畏、農(nóng)藥1605，1059等)臨床上用解磷定來治療有機(jī)磷農(nóng)藥中毒。作用機(jī)理與酶活性中心Ser結(jié)合PROR’OOX+HOEPROR’OOOE+HX膽堿酯酶90（二巰基丙醇）b.金屬離子（如重金屬As、Hg、Ag等）解毒：二巰基丙醇91

專一性不可逆抑制劑可以分為Ks型和Kcat型兩大類。a) Ks型不可逆抑制劑：具有與底物相類似的結(jié)構(gòu)。(結(jié)合基團(tuán)暴露）b) Kcat型不可逆抑制劑：該類抑制劑不但具有與天然底物相類似的結(jié)構(gòu)，而且抑制劑本身也是酶的底物，這類不可逆抑制劑的特點(diǎn)是專一性極高，因此也被稱為自殺性底物（suicidesubstrate）。（結(jié)合基團(tuán)隱藏）92b.可逆抑制抑制劑與酶蛋白以非共價(jià)方式結(jié)合，引起酶活性暫時(shí)性喪失。抑制劑可以通過透析等方法被除去，并且能部分或全部恢復(fù)酶的活性。根椐抑制劑與酶結(jié)合的情況，又可以分為三類類可逆抑制作用包括競爭性、反競爭性、非競爭性抑制幾種類型。

93化學(xué)結(jié)構(gòu)與底物相似，能與底物竟?fàn)幣c酶活性中心結(jié)合。底物被排斥在反應(yīng)中心之外，酶促反應(yīng)被抑制。競爭性抑制通?？梢酝ㄟ^增大底物濃度，即提高底物的競爭能力來消除。(1)競爭性抑制94競爭性抑制95競爭性抑制琥珀酸延胡索酸草酸鹽草酰乙酸丙二酸戊二酸96(2)非競爭性抑制酶可同時(shí)與底物及抑制劑結(jié)合，引起酶分子構(gòu)象變化，并導(dǎo)至酶活性下降。如某些金屬離子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常能與酶分子的調(diào)控部位中的-SH基團(tuán)作用，改變酶的空間構(gòu)象，引起非競爭性抑制。97非競爭性抑制98(3)反競爭性抑制

抑制劑不能與游離酶結(jié)合，但可與ES復(fù)合物結(jié)合并阻止產(chǎn)物生成，使酶的催化活性降低，稱酶的反競爭性抑制。99可逆抑制作用的動力學(xué)特征1.競爭性抑制100⑴競爭性抑制劑往往是酶的底物類似物或反應(yīng)產(chǎn)物；⑵抑制劑與酶的結(jié)合部位與底物與酶的結(jié)合部位相同；⑶抑制劑濃度越大，則抑制作用越大；但增加底物濃度可使抑制程度減??；⑷動力學(xué)參數(shù)：Km值增大，Vm值不變，反應(yīng)速度V減小。競爭性抑制的特點(diǎn)

101

2.非競爭性抑制102非競爭性抑制的特點(diǎn)：⑴非競爭性抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)不一定與底物的分子結(jié)構(gòu)類似；⑵底物和抑制劑分別獨(dú)立地與酶的不同部位相結(jié)合；⑶抑制劑對酶與底物的結(jié)合無影響，故底物濃度的改變對抑制程度無影響；⑷動力學(xué)參數(shù)：Km值不變，Vm值降低，反應(yīng)速度V減小。

103

3.反競爭性抑制104反競爭性抑制的特點(diǎn)：⑴反競爭性抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)不一定與底物的分子結(jié)構(gòu)類似；⑵抑制劑與底物可同時(shí)與酶的不同部位結(jié)合；⑶必須有底物存在，抑制劑才能對酶產(chǎn)生抑制作用；抑制程度隨底物濃度的增加而增加；⑷動力學(xué)參數(shù)：Km減小，Vm降低，反應(yīng)速度V減小。105為了方便理解和記憶，我們現(xiàn)將無抑制劑和有抑制劑等不同情況下的米氏方程和Vmax及Km的變化總結(jié)歸納在表中。106八、酶的調(diào)節(jié)

生物體內(nèi)的各種生理活動均以一定的物質(zhì)代謝為基礎(chǔ)。為了適應(yīng)某種生理活動的變化，需要對一定的代謝活動進(jìn)行調(diào)節(jié)。

通過對酶的催化活性的調(diào)節(jié)，就可以達(dá)到調(diào)節(jié)代謝活動的目的。

可以通過改變其催化活性而使整個(gè)代謝反應(yīng)的速度或方向發(fā)生改變的酶就稱為限速酶或關(guān)鍵酶。

107酶結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)

酶結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)是通過對現(xiàn)有酶分子結(jié)構(gòu)的影響來改變酶的催化活性的調(diào)節(jié)方式。酶結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)是一種快速調(diào)節(jié)方式。1081.變構(gòu)調(diào)節(jié)（別構(gòu)調(diào)節(jié)）

某些代謝物能與變構(gòu)酶分子上的變構(gòu)部位特異性結(jié)合，使酶的分子構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變酶的催化活性以及代謝反應(yīng)的速度，這種調(diào)節(jié)作用就稱為變構(gòu)調(diào)節(jié)(allostericregulation)。具有變構(gòu)調(diào)節(jié)作用的酶就稱為變構(gòu)酶。凡能使酶分子變構(gòu)并使酶的催化活性發(fā)生改變的代謝物就稱為變構(gòu)劑。別構(gòu)激活劑別構(gòu)抑制劑109a．變構(gòu)調(diào)節(jié)的機(jī)制：變構(gòu)酶一般是多亞基構(gòu)成的聚合體，一些亞基為催化亞基，另一些亞基為調(diào)節(jié)亞基。當(dāng)調(diào)節(jié)亞基或調(diào)節(jié)部位與變構(gòu)劑結(jié)合后，就可導(dǎo)致酶的空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而導(dǎo)致酶的催化活性中心的構(gòu)象發(fā)生改變而致酶活性的改變。

110b．協(xié)同效應(yīng)：當(dāng)變構(gòu)酶的一個(gè)亞基與其配體（底物或變構(gòu)劑）結(jié)合后，能夠通過改變相鄰亞基的構(gòu)象而使其對配體的親和力發(fā)生改變，這種效應(yīng)就稱為變構(gòu)酶的協(xié)同效應(yīng)。如果對相鄰亞基的影響是導(dǎo)致其對配體的親和力增加，則稱為正協(xié)同效應(yīng)；反之，則稱為負(fù)協(xié)同效應(yīng)。如果是同種配體所產(chǎn)生的影響，則稱為同促協(xié)同效應(yīng)。如果是不同配體之間產(chǎn)生的影響則稱為異促協(xié)同效應(yīng)。

111S形曲線（正協(xié)同）表觀雙曲線（負(fù)協(xié)同效應(yīng)）別構(gòu)酶的動力學(xué)112112別構(gòu)酶經(jīng)加熱或用化學(xué)試劑等處理，可引起別構(gòu)酶解離，失去調(diào)節(jié)活性。脫敏后表現(xiàn)為米氏酶動力學(xué)雙曲線脫敏作用113113c.變構(gòu)調(diào)節(jié)的方式：變構(gòu)酶通常為代謝途徑的起始關(guān)鍵酶，而變構(gòu)劑則為代謝途徑的終產(chǎn)物。因此，變構(gòu)劑一般以反饋方式對代謝途徑的起始關(guān)鍵酶進(jìn)行調(diào)節(jié)，最常見的為負(fù)反饋調(diào)節(jié)。

114ATP別構(gòu)激活劑CTP別構(gòu)抑制劑天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶115ATP115反饋抑制合成代謝途徑中，當(dāng)代謝終產(chǎn)物積累超過機(jī)體需要時(shí)，終產(chǎn)物會特異性地抑制關(guān)鍵酶的活性，與酶的調(diào)節(jié)位點(diǎn)結(jié)合，引起酶構(gòu)象改變，使其活性中心不再結(jié)合底物，反應(yīng)停止使途徑中隨后的反應(yīng)速度減慢甚至停止。這種通過酶的別構(gòu)效應(yīng)對代謝反應(yīng)進(jìn)行調(diào)節(jié)的方式成為反饋抑制。116d．變構(gòu)調(diào)節(jié)的特點(diǎn)：⑴酶活性的改變通過酶分子構(gòu)象的改變而實(shí)現(xiàn)；⑵酶的變構(gòu)僅涉及非共價(jià)鍵的變化；⑶調(diào)節(jié)酶活性的因素為代謝物；⑷非耗能過程；⑸

無放大效應(yīng)。

1172.共價(jià)修飾調(diào)節(jié)

酶蛋白分子中的某些氨基酸殘基共價(jià)結(jié)合某種基團(tuán)，改變酶蛋白構(gòu)象。從而導(dǎo)致酶活性的改變，稱為共價(jià)修飾調(diào)節(jié)。共價(jià)修飾調(diào)節(jié)也是體內(nèi)快速調(diào)節(jié)代謝活動的一種重要的方式?？赡娴墓矁r(jià)修飾，使酶處于活性/非活性的互變狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)酶的活性。最常見的共價(jià)修飾方式有：磷酸化-脫磷酸化，-SH--S-S-，乙?；?脫乙?；?，腺苷化-脫腺苷化等。

118主要是SerThr磷酸化酶磷酸酶磷酸化酶激酶119119共價(jià)修飾調(diào)節(jié)的特點(diǎn)：⑴酶以兩種不同修飾和不同活性的形式存在；⑵有共價(jià)鍵的變化；⑶受其他調(diào)節(jié)因素（如激素）的影響；⑷一般為耗能過程；⑸

存在放大效應(yīng)。

120在同一種屬中，催化活性相同而酶蛋白的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及免疫學(xué)性質(zhì)不同的一組酶稱為同工酶(isoenzyme)。同工酶在體內(nèi)的生理意義主要在于適應(yīng)不同組織或不同細(xì)胞器在代謝上的不同需要。

同工酶121乳酸脫氫酶同工酶（LDHs）為四聚體，在體內(nèi)共有五種分子形式:即LD1（H4），LD2（H3M），LD3（H2M2），LD4（HM3）和LD5（M4）。

122123心肌中以LD1含量最多，在骨骼肌中含量最多的是LD5123生理及臨床意義在代謝調(diào)節(jié)上起著重要的作用；用于解釋發(fā)育過程中階段特有的代謝特征；同工酶譜的改變有助于對疾病的診斷；同工酶可以作為遺傳標(biāo)志，用于遺傳分析研究。心肌梗死和肝病病人血清LDH同工酶譜的變化1酶活性心肌梗死酶譜正常酶譜肝病酶譜2345124124六、酶的制備及活力測定

目的：研究酶的理化性質(zhì)。包括結(jié)構(gòu)與功能、生物學(xué)作用對酶鑒定。

純酶：作為生化試劑及用作藥物的酶(純度高)

125（一）酶活力與酶反應(yīng)速度

1.酶活力：也稱酶活性，指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。

其大小可用在一定條件下，它所催化的某一化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速度來表示，兩者呈線性關(guān)系。所以測定酶的活力就是測定酶的反應(yīng)速率。

酶反應(yīng)速度：用單位時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來表示。單位：濃度/單位時(shí)間49126產(chǎn)物濃度酶反應(yīng)速度曲線時(shí)間用初速度來測定制劑中酶的含量。斜率=濃度/時(shí)間=

酶活力的測定測定酶活力時(shí)應(yīng)注意幾點(diǎn)（1）測定酶反應(yīng)速度時(shí)，應(yīng)使[S]>>[E]。（2）酶的反應(yīng)速度一般用單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的增加量來表示。（3）應(yīng)測反應(yīng)初速度,底物濃度變化在起始濃度5%以內(nèi)。（4）測酶活力時(shí)應(yīng)使反應(yīng)溫度、pH、離子強(qiáng)度和底物濃度等因素保持恒定。50127酶反應(yīng)的速度不停在變

)初速度酶促反應(yīng)速度逐漸降低

酶反應(yīng)進(jìn)程曲線隨著酶催化的反應(yīng)進(jìn)行，反應(yīng)速度會變慢，這是由于產(chǎn)物的反饋?zhàn)饔?、酶的熱變性或副反?yīng)引起的。但是，在反應(yīng)起始不久，在酶促反應(yīng)的速度曲線上通?？梢钥匆娨欢涡甭什蛔兊牟糠?，這就是初速度。51128酶活力單位（U）：在一定條件下，一定時(shí)間內(nèi)將一定量的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量（U/g，U/ml）。習(xí)慣單位（U）:底物(或產(chǎn)物)變化量/單位時(shí)間國際上對酶活力單位的規(guī)定在最適的反應(yīng)條件（25℃）下，每分鐘內(nèi)催化一微摩爾底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量定為一個(gè)酶活力單位，即

1IU=1μmol/min在最適條件下，每秒鐘內(nèi)使一摩爾底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量定為1kat單位，即

1kat=1mol/s1Kat=60×106IU

2、酶的活力單位52129

3.酶的比活力：

代表酶的純度，比活力用每mg蛋白質(zhì)所含的酶活力單位數(shù)表示，對同一酶來說，比活力愈大，表示酶的純度愈高。用IU/mg蛋白、Kat/mg蛋白表示。比活力大小可用來比較每單位質(zhì)量蛋白質(zhì)的催化能力。

比活力=活力IU/mg蛋白=總活力IU/總蛋白mg53130該法要求酶的底物或產(chǎn)物在紫外或可見光部分光吸收不同。優(yōu)點(diǎn)：簡便、迅速、準(zhǔn)確；一個(gè)樣品可多次測定；可檢測到10-9mol/L水平的變化。例:人血清乳酸脫氫酶活力的測定L-乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+

乳酸脫氫酶4.酶活力的測定方