公共場(chǎng)所衛(wèi)生檢驗(yàn)方法

Q/LB.□XXXXX-XXXXGB/T18204.4—2022目次TOC\o"1-1"\h前言 II1范圍 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語(yǔ)和定義 14菌落總數(shù)平皿計(jì)數(shù)法 25大腸菌群發(fā)酵法 46金黃色葡萄球菌平皿鑒定法 77真菌總數(shù)平皿計(jì)數(shù)法 108β-溶血性鏈球菌培養(yǎng)法 13附錄A（規(guī)范性）質(zhì)量控制和生物安全 17附錄B（規(guī)范性）公共場(chǎng)所公共用品用具微生物采樣方法 18前言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。GB/T18204《公共場(chǎng)所衛(wèi)生檢驗(yàn)方法》分為六個(gè)部分：——第1部分：物理因素；——第2部分：化學(xué)污染物；——第3部分：空氣微生物；——第4部分：公共用品用具微生物；——第5部分：集中空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)；——第6部分：衛(wèi)生監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范。本文件為GB/T18204的第4部分。本文件替代GB/T18204.4—2013《公共場(chǎng)所衛(wèi)生檢驗(yàn)方法第4部分：公共用品用具微生物》。本文件與GB/18204.4—2013相比，主要技術(shù)變化如下：——增加了“規(guī)范性引用文件”；——修改了部分培養(yǎng)基和試劑；——修改了部分材料和儀器設(shè)備；——完善了樣品稀釋和培養(yǎng)的描述；——修改了計(jì)算規(guī)則和結(jié)果報(bào)告的描述；——完善了金黃色葡萄球菌的鑒定步驟，增加了血漿凝固酶試驗(yàn)；——完善了β-溶血性鏈球菌的鑒定步驟，增加了觸酶試驗(yàn)、鏈激酶試驗(yàn)及其他檢驗(yàn)方法；——增加了質(zhì)量控制和生物安全的措施?！薷牧烁戒汢的表述請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)提出。本文件由中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)歸口。本文件起草單位：江蘇省疾病預(yù)防控制中心、常州市疾病預(yù)防控制中心、南京市疾病預(yù)防控制中心、蘇州市疾病預(yù)防控制中心、中國(guó)疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所本文件主要起草人：丁震、周連、馬愷、馬小瑩、徐斌、王鳳鳴、沈強(qiáng)、雍瑋、周志榮、張付剛、趙瑩、范華鋒公共場(chǎng)所衛(wèi)生檢驗(yàn)方法第4部分:公共用品用具微生物范圍GB/T18204的本部分規(guī)定了公共場(chǎng)所公共用品用具菌落總數(shù)、真菌總數(shù)、大腸菌群、金黃色葡萄球菌和β-溶血性鏈球菌的采樣與檢驗(yàn)方法。本部分適用于公共場(chǎng)所內(nèi)公共用品用具中菌落總數(shù)、真菌總數(shù)、大腸菌群、金黃色葡萄球菌和β-溶血性鏈球菌的檢驗(yàn)，其他場(chǎng)所可參照?qǐng)?zhí)行。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4789.28食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。菌落總數(shù)totalbacterialcount公共用品用具經(jīng)過(guò)采樣處理，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上經(jīng)36℃±1℃、48h培養(yǎng)所生長(zhǎng)發(fā)育的嗜中溫性需氧和兼性厭氧菌落的總數(shù)。大腸菌群coliforms一群在37℃、24h培養(yǎng)能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。金黃色葡萄球菌staphylococcusaureus在Baird-Parker平板或血平板上生長(zhǎng)良好，分解甘露醇產(chǎn)酸，血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性的革蘭氏陽(yáng)性葡萄狀球菌。真菌總數(shù)totalfungicount在孟加拉紅或沙氏瓊脂培養(yǎng)基上經(jīng)25℃～28℃、3d～7d培養(yǎng)所形成菌落的總數(shù)。β-溶血性鏈球菌β-streptococcushemolyticus

屬于鏈球菌屬，為革蘭氏陽(yáng)性菌，分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，在血平板上其菌落周圍形成一個(gè)2～4mm寬的透明溶血環(huán)。菌落總數(shù)平皿計(jì)數(shù)法培養(yǎng)基與試劑無(wú)菌生理鹽水成分：氯化鈉8.5g蒸餾水1000mL制法：稱取8.5g氯化鈉溶于1000mL蒸餾水中，分裝到試管內(nèi)，每管10mL，121℃高壓滅菌15min。4.1.2平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基4.1.2.1成分：胰蛋白胨5g酵母浸膏 2.5g葡萄糖1.0g瓊脂15.0g蒸餾水1000mL4.1.2.2制法：將上述成分加于蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH至7.0±0.2。分裝試管或錐形瓶，121℃高壓滅菌15min。儀器和設(shè)備4.2.1高壓蒸汽滅菌器。4.2.2干熱滅菌箱。4.2.3恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。4.2.4恒溫水浴箱：46℃±1℃4.2.5冰箱：2℃-5℃。4.2.6電爐或微波爐。4.2.7天平：感量0.1g。4.2.8渦旋混合器。4.2.9無(wú)菌試管：18mm×150mm。4.2.10無(wú)菌平皿：直徑90mm。4.2.11無(wú)菌刻度吸管：1mL（0.01mL刻度）。4.2.12微量移液器：1000μL。4.2.13滅菌棉拭子。4.2.14滅菌剪刀。4.2.15pH計(jì)或精密pH試紙。4.2.16放大鏡或（和）菌落計(jì)數(shù)器。檢驗(yàn)步驟采樣方法見附錄B。樣品的稀釋：將放有采樣后棉拭子的生理鹽水試管在渦旋混合器上充分振搖，此液為1：10的樣品勻液。用1mL無(wú)菌吸管或微量移液器吸取1：10樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注于盛有9mL生理鹽水稀釋液的無(wú)菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支無(wú)菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1：100的樣品勻液。按同法制備10倍系列稀釋樣品勻液，每遞增稀釋1次，換用1次1mL無(wú)菌吸管或吸頭。樣品的接種：根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選擇1個(gè)～2個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液，在進(jìn)行10倍遞增稀釋時(shí)，每個(gè)稀釋度分別吸取1mL樣品勻液于2個(gè)無(wú)菌平皿內(nèi)。同時(shí)分別取1mL生理鹽水稀釋液加入兩個(gè)無(wú)菌平血作空白對(duì)照。樣品的培養(yǎng)：及時(shí)將15mL～20mL冷卻至45℃～50℃的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（可放置于46℃±1℃恒溫水浴箱中保溫）傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻，瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h。菌落計(jì)數(shù)可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量（CFU）。選取菌落數(shù)在30CFU～300CFU之間、無(wú)蔓延菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)，低于30CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300CFU的可記錄為多不可計(jì)，每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2，代表一個(gè)平板菌落數(shù)。平板內(nèi)如有鏈狀菌落生長(zhǎng)時(shí)（菌落之間無(wú)明顯界限），應(yīng)將每條鏈（不同來(lái)源）作為一個(gè)菌落計(jì)。不同稀釋度菌落計(jì)數(shù)計(jì)算規(guī)則若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平均菌落數(shù)乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為樣本中菌落總數(shù)。若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，則樣本中菌落總數(shù)按式（1）計(jì)算，示例見表1。N=式中：N——樣本中菌落總數(shù)，單位為CFU；ΣC——平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和，單位為CFU；n1——適宜范圍菌落數(shù)的第一稀釋度（低）平板個(gè)數(shù)；n2——適宜范圍菌落數(shù)的第二稀釋度（高）平板個(gè)數(shù)；d——稀釋因子（第一稀釋度）。兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)稀釋度1：100（第一稀釋度）1：1000（第二稀釋度）菌落數(shù)232，24433，35N=232+244+33+352+0.1x2x10?2上述數(shù)據(jù)經(jīng)“四舍五入”后，表示為25000或2.5×104。若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300CFU，對(duì)稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，其他平板可記錄為多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算。若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30CFU，應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。若所有稀釋度平板均無(wú)菌落生長(zhǎng)，以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30CFU～300CFU之間，其中一部分大于300CFU或小于30CFU時(shí)，則以最接近30CFU或300CFU的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。結(jié)果報(bào)告公共用品用具菌落總數(shù)的測(cè)定結(jié)果按式（2）得出。A=T×bk式中:A——一定面積的菌落總數(shù)測(cè)定結(jié)果（杯具以CFU/cm2為單位報(bào)告，其它公共用品用具以CFU/25cm2為單位報(bào)告。結(jié)果非整數(shù)時(shí)，四舍五入保留整數(shù)）；T——平板平均菌落數(shù)，單位為CFU；b——稀釋倍數(shù)；k——根據(jù)采樣面積、標(biāo)準(zhǔn)限值單位得出的系數(shù)（杯具的系數(shù)k為實(shí)際采樣面積，其它公共用品用具的系數(shù)k為1）。（若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，則4.5.2中的N值為公式2中的T×b值）如果一件用品采兩份樣品，若兩份樣品檢測(cè)結(jié)果不一致，采用檢測(cè)值高的結(jié)果報(bào)告。大腸菌群發(fā)酵法培養(yǎng)基和試劑乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)液成分蛋白胨20g豬膽鹽（或牛、羊膽鹽）5g乳糖10g溴甲酚紫水溶液（質(zhì)量濃度＝0.04％）25mL蒸餾水1000mL制法將蛋白胨、膽鹽及乳糖溶于蒸餾水中，調(diào)pH至7.4，加溴甲酚紫溶液，混勻，分裝到帶有倒管的試管中，每管10mL，經(jīng)115℃高壓滅菌20min。雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管除蒸餾水外，其他成分加倍。伊紅美藍(lán)瓊脂成分蛋白胨10g乳糖10g磷酸氫二鉀2g瓊脂17g伊紅水溶液（質(zhì)量濃度＝2％）20mL美藍(lán)水溶液（質(zhì)量濃度-0.5％）10mL蒸餾水1000mL制法將蛋白胨、磷酸鹽和瓊脂溶解于蒸餾水中，調(diào)整pH至7.2．分裝到燒瓶?jī)?nèi)。經(jīng)115℃高壓滅菌20min，臨用時(shí)加入乳糖并加熱熔化瓊酯，冷至50℃～55℃，加入伊紅和美藍(lán)溶液，搖勻，傾注平皿。乳糖發(fā)酵管成分蛋白胨 20g乳糖 10g溴甲酚紫水溶液（質(zhì)量濃度＝0.04％）25mL蒸餾水 1000mL制法將蛋白胨及乳糖溶于蒸餾水中，調(diào)pH至7.4，加入指示劑，分裝到帶有倒管的試管中，每管3mL，經(jīng)115℃高壓滅菌20min。革蘭氏染色液。結(jié)晶紫染色液成分結(jié)晶紫1g乙醇（95%，體積分?jǐn)?shù)）20mL草酸銨水溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)=1%）80mL制法將結(jié)晶紫完全溶解于乙醇中,然后與草酸銨溶液混合。革蘭氏碘液成分碘1g碘化鉀2g蒸餾水300mL制法將碘與碘化鉀先行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水。脫色劑乙醇（95%，體積分?jǐn)?shù)）。沙黃復(fù)染液成分沙黃0.25g乙醇（95%，體積分?jǐn)?shù)）10mL蒸餾水90mL制法將沙黃溶解于乙醇中,待完全溶解后加入蒸餾水。儀器和設(shè)備5.2.1高壓蒸汽滅菌器。5.2.2干熱滅菌箱。5.2.3恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。5.2.4冰箱：2℃-5℃。5.2.5電爐或微波爐。5.2.6天平：感量0.1g。5.2.7渦旋混合器。5.2.8無(wú)菌接種環(huán)：直徑3mm。5.2.9無(wú)菌試管:18mm×150mm。5.2.10無(wú)菌平皿：直徑90mm。5.2.11無(wú)菌刻度吸管：10mL（0.1mL刻度）。5.2.12滅菌棉拭子。5.2.13滅菌剪刀。5.2.14pH計(jì)或精密pH試紙。5.2.15顯微鏡。檢驗(yàn)步驟采樣方法見附錄B．乳糖膽鹽發(fā)酵試驗(yàn)：將檢樣（多于1mL）倒入雙料乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)液中。置36℃±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h±2h，觀察是否產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，如不產(chǎn)酸、不產(chǎn)氣則為大腸菌群陰性。若有產(chǎn)氣產(chǎn)酸者，則按下列步驟進(jìn)行。分離培養(yǎng)：自產(chǎn)酸、產(chǎn)氣發(fā)酵管中取一接種環(huán)培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)種伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置36℃±1℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h～24h，然后取出，觀察菌落形態(tài)，典型菌落形態(tài)為深紫黑色、具有金屬光澤；紫黑色、不帶或略帶金屬光澤；淡紫紅色、中心較深。在上述平板上，挑取典型菌落1個(gè)～2個(gè)做革蘭氏染色。（1）將培養(yǎng)18h～24h的培養(yǎng)物涂片．（2）將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染1min，水洗。（3）滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗。（4）滴加乙醇脫劑，搖動(dòng)玻片，直至無(wú)紫色脫落為止，約30s，水洗。（5）滴加復(fù)染液，復(fù)染1min，水洗，待干，鏡檢。挑取典型菌落接種乳糖發(fā)酵管，置36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h。結(jié)果報(bào)告凡乳糖發(fā)酵管最終產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，革蘭氏染色為陰性的無(wú)芽孢桿菌，即可報(bào)告檢出大腸菌群。如果一件用品采兩份樣品，若兩份樣品檢測(cè)結(jié)果不一致，采用陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果報(bào)告。金黃色葡萄球菌平皿鑒定法培養(yǎng)基和試劑胰酪胨大豆肉湯成分胰酪胨（或胰蛋白胨）17g植物蛋白胨（或大豆蛋白胨）3g氯化鈉100g磷酸氫二鉀2.5g葡萄糖2.5g蒸餾水1000mL制法將上述成分混合后，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH至7.3±0.2，分裝，每支9mL，121℃高壓滅菌15min。7.5%氯化鈉肉湯成分蛋白胨10g牛肉膏3g氯化鈉75g蒸餾水1000mL制法將上述成分加熱溶解，調(diào)節(jié)pH至7.4±0.2，分裝，每支9mL，121℃高壓滅菌15min。Baird-Parker平板成分胰蛋白胨10g牛肉膏5g酵母浸液1g丙酮酸鈉10g甘氨酸12g氯化鋰（LiCl·6H2O）5g瓊脂20g蒸餾水950mL增菌劑的配制30%卵黃鹽水50mL與過(guò)濾除菌后的1%亞碲酸鉀溶液10mL混合，保存于4℃冰箱內(nèi)。制法將6.1.3.1中各成分混合，加熱煮沸至完全溶解，冷卻至25℃，調(diào)節(jié)pH至7.0±0.2。分裝，每瓶95mL，121℃高壓滅菌15min。臨用時(shí)加熱熔化瓊脂，冷卻至50℃，每95mL加入預(yù)熱至50℃的卵黃亞碲酸鉀增菌劑5mL，搖勻后傾注平板。培養(yǎng)基應(yīng)是致密不透明的。使用前在4℃冰箱儲(chǔ)存，不得超過(guò)48h。血瓊脂平板成分營(yíng)養(yǎng)瓊脂100mL脫纖維羊血（或兔血）10mL制法將營(yíng)養(yǎng)瓊脂加熱熔化，待冷卻至50℃左右以無(wú)菌操作加入滅菌脫纖維羊血（或兔血），搖勻，傾注平板，置于4℃冰箱備用。腦心浸出液肉湯成分胰蛋白胨10g氯化鈉5g磷酸氫二鈉（12H2O）2.5g葡萄糖2g牛心浸出液500mL制法加熱溶解，調(diào)節(jié)pH至7.4±0.2，分裝，每支5mL，121℃高壓滅菌15min。營(yíng)養(yǎng)瓊脂小斜面成分蛋白胨10g牛肉膏3g氯化鈉5g瓊脂15~20g蒸餾水1000mL制法將除瓊脂以外的各成分溶解于蒸餾水內(nèi)，加入15%氫氧化鈉溶液約2mL調(diào)節(jié)pH至7.3±0.2。然后加入瓊脂，加熱煮沸，使瓊脂熔化，分裝至13mm×130mm試管，121℃高壓滅菌15min。兔血漿成分檸檬酸鈉3.8g蒸餾水100mL兔全血4份制法將檸檬酸鈉溶于蒸餾水后過(guò)濾，裝瓶，121℃高壓滅菌15min。取滅菌后3.8%檸檬酸鈉溶液1份，加兔全血4份，混勻靜置（或以3000rpm/min離心30min），使血細(xì)胞下沉，取上面血漿。革蘭氏染色液見5.1.4。儀器和設(shè)備6.2.1高壓蒸汽滅菌器。6.2.2恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。6.2.3恒溫水浴箱：36℃±1℃。6.2.4電爐或微波爐6.2.5天平：感量0.1g。6.2.6無(wú)菌接種環(huán)：直徑3mm。6.2.7無(wú)菌試管：18mm×150mm，13mm×130mm。6.2.8無(wú)菌平皿：直徑90mm。6.2.9無(wú)菌刻度吸管：1mL（0.01mL刻度）、10mL（0.1mL刻度）。6.2.10微量移液器：1000μL。6.2.11pH計(jì)或精密pH試紙。6.2.12顯微鏡6.2.13載玻片。6.2.14酒精燈。6.2.15生物安全柜。6.2.16離心機(jī)。操作步驟采樣方法見附錄B。增菌：取1mL樣品接種到9mL7.5%氯化鈉肉湯或胰酪胨大豆肉湯中，于36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。金黃色葡萄球菌在上述培養(yǎng)基中呈混濁生長(zhǎng)。分離：自上述增菌培養(yǎng)基中，取1~2接種環(huán)培養(yǎng)物，劃線接種至Baird-Parker平板或血平板，于36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h，觀察記錄菌落特征，Baird-Parker平板必要時(shí)可將培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至45h~48h。在Baird-Parker平板上金黃色葡萄球菌菌落呈圓形、光滑、凸起、濕潤(rùn)，菌落直徑為2mm~3mm，顏色呈灰黑色至黑色，邊緣整齊、常為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明帶。偶有不分解脂肪的菌株，除沒有混濁帶和透明帶之外，其他外觀基本相同。在血平板上菌落較大，呈圓形、光滑、凸起、濕潤(rùn)，顏色呈金黃色（有時(shí)為白色），菌落周圍見完全透明的溶血環(huán)。革蘭氏染色鏡檢：挑取典型菌落，涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽(yáng)性球菌，排列呈葡萄狀，無(wú)芽胞，無(wú)莢膜。血漿凝固酶試驗(yàn)：挑取Baird-Parker平板或血平板上至少5個(gè)可疑菌落（小于5個(gè)全選），分別接種到5mL腦心浸出液肉湯和營(yíng)養(yǎng)瓊脂小斜面，36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。取新鮮配制的兔血漿0.5mL，放入小試管中，再加入腦心浸出液肉湯培養(yǎng)物0.2mL~0.3mL，振蕩搖勻，置于36℃±1℃培養(yǎng)箱或水浴箱內(nèi)，每30min觀察一次，在6h內(nèi)觀察結(jié)果。如呈現(xiàn)凝固（即將試管傾斜或倒置時(shí)，呈現(xiàn)凝塊）或凝固體積大于原體積的一半，則判定為陽(yáng)性結(jié)果。同時(shí)用已知血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性和陰性菌株的肉湯培養(yǎng)物作為對(duì)照。也可用商品化的試劑，按說(shuō)明書操作，進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)。如結(jié)果可疑，挑取營(yíng)養(yǎng)瓊脂小斜面的菌落接種到5mL腦心浸出液肉湯，于36℃±1℃培養(yǎng)18h~48h，重復(fù)試驗(yàn)。結(jié)果報(bào)告綜合以上試驗(yàn)結(jié)果，報(bào)告樣品中檢出或未檢出金黃色葡萄球菌。如果一件用品采兩份樣品，若兩份樣品檢測(cè)結(jié)果不一致，采用陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果報(bào)告。真菌總數(shù)平皿計(jì)數(shù)法培養(yǎng)基與試劑無(wú)菌生理鹽水見4.1.1。孟加拉紅培養(yǎng)基成分蛋白胨5g葡萄糖10g磷酸二氫鉀1g硫酸鎂(MgSO4·7H2O）0.5g瓊脂20g氯霉素0.1g蒸餾水1000mL孟加拉紅水溶液(質(zhì)量濃度=1:3000)100mL制法：將蛋白胨、葡萄糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂和瓊脂溶于蒸餾水中，再加人孟加拉紅溶液，分裝后121℃高壓滅菌20min，待冷至55℃左右加入氯霉素。沙氏瓊脂培養(yǎng)基成分蛋白胨10g葡萄糖40g瓊脂20g氯霉素0.1g蒸餾水1000mL制法：將蛋白胨、葡萄糖和瓊脂溶于蒸餾水中，分裝后121℃高壓滅菌15min，,待冷至55℃左右加入氯霉素。儀器和設(shè)備7.2.1高壓蒸汽滅菌器。7.2.2恒溫培養(yǎng)箱：25℃~28℃。7.2.3冰箱：2℃-5℃。7.2.4電爐或微波爐。7.2.5天平：感量0.1g。7.2.6渦旋混合器。7.2.7無(wú)菌試管：18mm×150mm。7.2.8無(wú)菌平皿：直徑90mm。7.2.9無(wú)菌刻度吸管：1mL（0.01mL刻度）。7.2.10pH計(jì)或精密pH試紙。7.2.11放大鏡或（和）菌落計(jì)數(shù)器。檢驗(yàn)步驟采樣方法見附錄B。樣品的稀釋：參照4.3.2。樣品的接種：根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的評(píng)估，選擇3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液。在進(jìn)行10倍遞增稀釋的同時(shí)，每個(gè)稀釋度分別吸取1mL樣品勻液于2個(gè)無(wú)菌平皿內(nèi)。同時(shí)分別取1mL無(wú)菌稀釋液加人2個(gè)無(wú)菌平皿作空白對(duì)照。樣品的培養(yǎng)：將溶化并冷卻至45℃左右的孟加拉紅培養(yǎng)基或沙氏瓊脂培養(yǎng)基傾注平皿約20mL?25mL，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻，待瓊脂凝固后，正置平皿于25℃～28℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)5天，3天后開始觀察，若真菌數(shù)量過(guò)多可于第3天計(jì)數(shù)結(jié)果，并記錄培養(yǎng)時(shí)間，否則于第5天記錄結(jié)果。菌落計(jì)數(shù)可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量（CFU）。通常選擇菌落數(shù)在5CFU～50CFU之間的平皿進(jìn)行計(jì)數(shù)。真菌蔓延生長(zhǎng)覆蓋整個(gè)平皿的可記錄為菌落蔓延。不同稀釋度菌落計(jì)數(shù)計(jì)算規(guī)則若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平均菌落數(shù)乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為樣本中真菌總數(shù)。若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，應(yīng)參照4.5.2的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行計(jì)算。若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于50CFU，對(duì)稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，其他平板可記錄為多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算。若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于5CFU，應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。若所有稀釋度平板均無(wú)菌落生長(zhǎng)，以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在5CFU～50CFU之間，其中一部分大于50CFU或小于5CFU時(shí)，則以最接近5CFU或50CFU的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。結(jié)果報(bào)告公共用品用具真菌總數(shù)的測(cè)定結(jié)果按式（3）得出。A=T×b式中:A——一定面積的真菌總數(shù)測(cè)定結(jié)果（以CFU/50cm2為單位報(bào)告。結(jié)果非整數(shù)時(shí)，四舍五入保留整數(shù)）；T——平板平均菌落數(shù)，單位為CFU；b——稀釋倍數(shù)；k——根據(jù)采樣面積、標(biāo)準(zhǔn)限值單位得出的系數(shù)（如采樣面積50cm2，則k=1；如采樣面積25cm2，則k=1/2）。（若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，則4.5.2中的N值為公式3中的T×b值）如果一件用品采兩份樣品，若兩份樣品檢測(cè)結(jié)果不一致，采用檢測(cè)值高的結(jié)果報(bào)告。β-溶血性鏈球菌培養(yǎng)法培養(yǎng)基和試劑8.1.1胰蛋白胨大豆肉湯（Tryptonesoybeanbroth,TSB）成分：胰蛋白胨17.0g大豆蛋白胨3.0g氯化鈉5.0g磷酸二氫鉀（無(wú)水）2.5g葡萄糖2.5g蒸餾水1000.0mL制法：將上述各成分溶于蒸餾水中，加熱溶解，校正pH至7.3±0.2，121℃滅菌15min，分裝備用。8.1.2改良胰蛋白胨大豆肉湯（Modifiedtryptonesoybeanbroth,mTSB）8.1.2.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基（胰蛋白胨大豆肉湯TSB）見8.1.18.1.2.2抗生素溶液多黏菌素溶液稱取10mg多黏菌素B于10mL滅菌蒸餾水中，振搖混勻，充分溶解后過(guò)濾除菌。萘啶酮酸鈉溶液稱取10mg萘啶酮酸于10mL0.05mol/L氫氧化鈉溶液中，振搖混勻，充分溶解后過(guò)濾除菌。8.1.2.3完全培養(yǎng)基成分：胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）1000.0mL多黏菌素溶液10.0mL萘啶酮酸鈉溶液10.0mL制法：無(wú)菌條件下，將上述各成分進(jìn)行混合，充分混勻，分裝備用。8.1.3哥倫比亞CNA血瓊脂（ColumbiaCNAbloodagar）8.1.3.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分：胰酪蛋白胨12.0g動(dòng)物組織蛋白消化液5.0g酵母提取物3.0g牛肉提取物3.0g玉米淀粉1.0g氯化鈉5.0g瓊脂13.5g多黏菌素0.01g萘啶酸0.01g蒸餾水1000.0mL制法：將上述各成分溶于蒸餾水中，加熱溶解，校正pH至7.3±0.2，121℃滅菌12min。8.1.3.2無(wú)菌脫纖維綿羊血無(wú)菌操作下條件下，將綿羊血加入到盛有滅菌玻璃珠的容器中，振搖約10min，靜置后除去附有血纖維的玻璃珠即可。8.1.3.3完全培養(yǎng)基成分：基礎(chǔ)培養(yǎng)基1000.0mL無(wú)菌脫纖維綿羊血50mL制法：當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時(shí)，無(wú)菌操作加入50mL脫纖維綿羊血，搖勻后傾注平板。8.1.4血瓊脂平板：見6.1.4。8.1.5革蘭氏染色液：見5.1.4。8.1.6草酸鉀血漿成分：草酸鉀0.01g人血5.0mL制法：草酸鉀0.01g放入滅菌小試管中，再加入5mL人血，混勻，經(jīng)離心沉淀，吸取上清液即為草酸鉀血漿。8.1.70.25％氯化鈣（CaCl2）溶液成分：氯化鈣（無(wú)水）22.2g蒸餾水1000.0mL制法：稱取22.2g氯化鈣（無(wú)水）溶于蒸餾水中，分裝備用。8.1.83％過(guò)氧化氫（H2O2）溶液成分：30％過(guò)氧化氫（H2O2）溶液100.0mL蒸餾水900.0mL制法：吸取100mL30％過(guò)氧化氫(H2O2)溶液，溶于蒸餾水中，混勻，分裝備用。8.1.9生化鑒定試劑盒或生化鑒定卡。設(shè)備和材料8.2.1高壓蒸汽滅菌器。8.2.2恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。8.2.3恒溫水浴箱：36℃±1℃。8.2.4厭氧培養(yǎng)裝置。8.2.5冰箱：2℃～5℃。8.2.6電爐或微波爐。8.2.7天平：感量0.1g8.2.8無(wú)菌試管：18mm×150mm。8.2.9無(wú)菌平皿：直徑90mm。8.2.10無(wú)菌刻度吸管：1mL（0.01mL刻度）、10mL（0.1mL刻度）。8.2.11微量移液器：1000μL。8.2.12無(wú)菌錐形瓶：容量200mL、500mL、1000mL、2000mL。8.2.13pH計(jì)或精密pH試紙。8.2.14顯微鏡8.2.16載玻片。8.2.16離心機(jī)8.2.17微生物生化鑒定系統(tǒng)。操作步驟采樣方法見附錄B。樣品增菌及分離培養(yǎng)，取1mL液體檢樣，加入9mL改良胰蛋白胨大豆肉湯，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。接種于哥倫比亞CNA血瓊脂平板，36℃±1℃厭氧培養(yǎng)18h～24h，觀察菌落形態(tài)。β-溶血性鏈球菌在哥倫比亞CNA血瓊脂平板上的典型菌落形態(tài)為直徑約2mm～4mm，灰白色、半透明、光滑、表面突起、圓形、邊緣整齊，在菌落周圍形成完全透明的溶血環(huán)，紅細(xì)胞完全溶解。鑒定分純培養(yǎng)：挑取哥倫比亞CNA血瓊脂平板上5個(gè)（如小于5個(gè)則全選）可疑菌落分別接種血瓊脂平板和TSB增菌液，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。革蘭氏染色鏡檢：挑取血瓊脂平板上可疑菌落染色鏡檢。β-溶血性鏈球菌為革蘭氏染色陽(yáng)性，呈球形或卵圓形，常排列成短鏈狀。觸酶試驗(yàn)：挑取血瓊脂平板上可疑菌落于潔凈的載玻片上，滴加適量3%過(guò)氧化氫溶液，于半分鐘內(nèi)有大量氣泡產(chǎn)生者為陽(yáng)性，不產(chǎn)生氣泡者為陰性，β-溶血性鏈球菌觸酶為陰性。鏈激酶試驗(yàn)：吸取草酸鉀血漿0.2mL于0.8mL滅菌生理鹽水中混勻，再加入經(jīng)36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h的可疑菌的TSB培養(yǎng)液0.5mL及0.25%氯化鈣溶液0.25mL，振蕩搖勻，置于36℃±1℃水浴中10min，血漿混合物自行凝固（凝固程度至試管倒置時(shí)內(nèi)容物不流動(dòng)）。繼續(xù)36℃±1℃培養(yǎng)24h，凝固塊重新完全溶解為陽(yáng)性，不溶解為陰性，β-溶血性鏈球菌為陽(yáng)性。其他檢驗(yàn)：使用商品化生化鑒定試劑盒或生化鑒定卡對(duì)可疑菌落進(jìn)行鑒定。結(jié)果報(bào)告綜合以上試驗(yàn)結(jié)果，報(bào)告樣品中檢出或未檢出β-溶血性鏈球菌。如果一件用品采兩份樣品，若兩份樣品檢測(cè)結(jié)果不一致，采用陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果報(bào)告。

（規(guī)范性）

質(zhì)量控制和生物安全培養(yǎng)基和試劑需符合《GB4789.28食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》，購(gòu)買國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的成品培養(yǎng)基需有中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的生產(chǎn)文號(hào)，對(duì)于購(gòu)買的成品培養(yǎng)基，應(yīng)在培養(yǎng)基有效期內(nèi)使用，嚴(yán)格按照培養(yǎng)基要求的貯存條件進(jìn)行保存。確保所用試劑和材料為無(wú)菌狀態(tài)，操作過(guò)程中避免人為污染。實(shí)驗(yàn)用水的電導(dǎo)率在25℃時(shí)不應(yīng)超過(guò)25μS/cm(相當(dāng)于電阻率≥0.4ΜΩcm)，除非另有規(guī)定要求。水的微生物污染不應(yīng)超過(guò)103CFU/mL。實(shí)驗(yàn)室生物安全應(yīng)符合《GB9489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》，實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)有二級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室工作的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)人員在處理或檢測(cè)可疑致病菌時(shí)應(yīng)采取適當(dāng)?shù)念A(yù)防措施，減少職業(yè)暴露，并保證符合國(guó)家有關(guān)法規(guī)規(guī)定的要求。

（規(guī)范性）

公共場(chǎng)所公共用品用具微生物采樣方法范圍本附錄規(guī)定了公共場(chǎng)所公共用品用具微生物采樣的基本要求。一般要求隨機(jī)抽取清洗消毒后準(zhǔn)備使用的公共用品