乳酸菌粘附實驗方案

乳酸菌粘附實驗方案乳酸菌定植在人類胃腸道的過程中，第一步是細(xì)菌對宿主組織的粘附。細(xì)胞疏水性決定了細(xì)菌粘附能力，這是益生菌能否在動物腸道繁殖的關(guān)鍵。此外，細(xì)菌的自聚集能力對細(xì)菌與腸道細(xì)胞的粘附有重要影響，而共聚集通過防止病原體附著在宿主組織上來消除胃腸道病原菌的定植。本文介紹了如何在體外通過疏水和凝集實驗初步檢測乳酸菌的表面粘附能力。材料與試劑1.離心管(1.5ml,

5ml)2.記號筆3.胰蛋白胨(生工，A505250)4.酵母提取物(生工，A515245)5.氯化鈉(上海滬試)6.瓊脂(生工，A505255)7.LB肉湯培養(yǎng)基(生工，A507002)8.MRS肉湯培養(yǎng)基(賽默飛，CM1175)9.十二烷(國藥，TD096801)10.二甲苯(國藥，10023418)11.氯仿(國藥，10006818)12.PBS緩沖液(國藥，HYSH3025601)13.LB固體培養(yǎng)基

(見溶液配方)14.MRS固體培養(yǎng)基

(見溶液配方)15.LB液體培養(yǎng)基

(見溶液配方)16.MRS液體培養(yǎng)基

(見溶液配方)儀器設(shè)備1.量筒2.玻璃棒3.離心機(jī)(艾本德5424)4.紫外分光光度計(北京普析)5.90mm塑料培養(yǎng)皿(biosharp,

BS-90-D)6.純水制備儀(ELGAPURELAB系列)7.移液槍8.吸頭(生工，F(xiàn)601227)9.烘箱(天津泰斯特101-0AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱)10.厭氧培養(yǎng)箱(Whitley，DG250)11.超凈工作臺(天津泰斯特，CJ-2D)12.接種環(huán)(生工，F(xiàn)619312)13.高壓滅菌鍋(上海慶開，GI54TW)14.冰箱(美菱)15.搖床(EppendorfThermoMixerC恒溫混勻儀)

軟件1.Excel

實驗步驟1.制備一定濃度的乳酸菌懸液1.1菌的復(fù)蘇將菌保從﹣80

°C冰箱取出置于冰上，用接種環(huán)以平板劃線的方式將菌種接種到MRS固體培養(yǎng)基，37

°C恒溫箱倒置培養(yǎng)過夜。注：菌保拿出后要及時放回去，以免損失菌的活性。1.2接種用滅菌的槍頭或牙簽挑取平板上由單個菌生長成的單菌落，置于裝有1mlMRS培養(yǎng)基的1.5ml或者2.0ml的微型離心管里，混勻并標(biāo)記。將離心管置于37

°C，搖床培18h。1.3菌種活化取100μl培養(yǎng)18h的菌液轉(zhuǎn)移至另一個含900μLMRS液體培養(yǎng)基的微型離心管中繼續(xù)培養(yǎng)18h，重復(fù)此操作兩次。目的是提高乳酸菌活性。1.4擴(kuò)大培養(yǎng)將在微型離心管中培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)入裝有50mlMRS液體培養(yǎng)基的滅菌小錐形瓶中，37

°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h。注：以上過程都要在超凈工作臺上進(jìn)行，需要嚴(yán)格無菌操作。1.5離心將培養(yǎng)了18h的乳酸菌菌液以3,000g的速度離心10分鐘，棄去上清液。1.6洗滌加入等量滅菌后的PBS緩沖液，重懸混勻，以3,000g的速度離心10min，重復(fù)此步驟2-3次。加入少量PBS緩沖液并重懸混勻。1.7調(diào)節(jié)濃度以一定比例將乳酸菌菌液與PBS緩沖液混合，使混合溶液在600nm的波長下OD值在0.8左右，記為A0。2.測定細(xì)胞疏水性2.1將1ml的疏水劑(十二烷、二甲苯或氯仿等)分別加入到3ml的乳酸菌懸液中，充分混勻。每種疏水劑至少設(shè)立三個平行組。2.2室溫下靜置20min，使有機(jī)相和水相分離。2.3去除有機(jī)相，以PBS緩沖液為對照在600nm下測定水相的OD值，記為At。2.4重復(fù)實驗至少三次并計算。Hydrophobicity(%)=[(A0－At)/A0

]×100%；(疏水性分為低：0~29%、中：30%~59%和高：60~100%)

(Niederle.

etal.,2019)3.測定細(xì)胞自凝集能力取4ml調(diào)節(jié)濃度后的乳酸菌懸液充分混勻，室溫孵育5h。吸取1ml菌懸液，以PBS緩沖液作為對照在600nm下測定OD值，記為At。實驗重復(fù)三次并計算：Auto-aggregation(%)=1-At

/A0×100%

(DelRe.

etal.,2000)注：孵育5h后取菌懸液時，取表面菌液，禁止吹打，保持菌液靜止。4.測定細(xì)胞共凝集能力4.1制備病原菌的菌懸液1)將病原菌(如S.aureus

ATCC25923,

S.typhimurium

ATCC14028，和L.monocytogenes

ATCC19113)在LB液體培養(yǎng)基中37

°C培養(yǎng)18h。2)離心將培養(yǎng)了18h的菌液以3,000g的速度離心十分鐘，棄去上清液。3)洗滌加入等量滅菌后的PBS緩沖液，重懸混勻，3,000

g離心10min，重復(fù)此步驟2-3次。加入少量PBS緩沖液并重懸混勻。4)調(diào)節(jié)濃度以一定比例將菌液與PBS緩沖液混合，使混合溶液在600nm的波長下OD值在0.8左右，記為A0。4.2將各乳酸菌懸浮液和致病菌懸浮液等體積(2ml)混合，在室溫下靜置孵育5h。在相同生長條件下培養(yǎng)含4ml單菌懸液的對照組，在600nm下測定OD值。實驗重復(fù)三次并計算：Co-aggregation(%)=[(Ax+Ay)/2

-

A

(x+y)

]/(Ax+Ay)×100%；(Ax和Ay代表兩個細(xì)菌懸液的吸光度，A

(x+y)

意味著混合細(xì)菌懸液的吸光度。)(Xu.

etal.,2009)

結(jié)果與分析1.疏水

表1.

4株乳酸菌疏水性質(zhì)的檢測

(Chen.

etal.,

2020)菌株名疏水劑十二烷氯仿二甲苯HSM-197.8±0.6%a82.5±5.5%b92.6±1.2%aHSM-1097.9±1.4%a84.5±4.0%b94.6±1.0%aHSM-1497.1±0.7%a75.0±7.1%b93.4±1.5%aHSM-1886.8±3.8%b97.1±0.7%a84.8±1.9%b注：數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)，同一行內(nèi)不同上標(biāo)字母的均值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。細(xì)胞疏水性是益生菌通過清除腸道病原體，粘附腸道上皮細(xì)胞，定植胃腸道發(fā)揮益生菌有益作用的前提。疏水性分析表明，四株菌株均具有高疏水性(表1)。HSM-1，HSM-10和HSM-14在十二烷和二甲苯的疏水性高于在氯仿中，但在氯仿中HSM-18的疏水性

(97.1±0.7%)高于十二烷

(86.8±3.8%)和二甲苯

(84.8±1.9%)。因此，實驗表明四株菌株均具有高疏水性，其中HSM-10具有最高的疏水性。2.自凝集和與病原菌的共凝集

表2.

4株乳酸菌自凝集與共凝集性質(zhì)的檢測

(Chen.etal.,2020)菌株名自凝集與共凝集自凝集金黃色葡萄球菌沙門氏菌李斯特菌HSM-159.9±4.9%a52.0±14.9%a17.1±6.3%a25.2±3.8%abHSM-1063.5±13.1%a35.7±2.3%a16.2±4.2%a37.6±8.1%abHSM-1416.5±4.1%b51.1±13.1%a28.0±3.0%a38.1±12.7%aHSM-1823.7±2.3%b52.1±2.9%a14.5±4.7%a22.7±5.0%b注：數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)，同一行內(nèi)不同上標(biāo)字母的均值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。潛在的益生菌應(yīng)具有在腸道定植和阻止致病菌的定植的能力。細(xì)胞的自聚集能力對腸細(xì)胞的粘附和避免病原體的定植做出了重要貢獻(xiàn)。而細(xì)菌的共聚集能力通過阻止它們粘附宿主組織來消除胃腸道病原體。在4株檢測的乳酸菌菌株中，HSM-1和HSM-10的自凝集能力最好，分別為59.9±4.9%和63.5±13.1%(表2)。相對而言HSM-14和HSM-18的自凝集能力較低

(分別為16.5±4.1%和23.7±2.3%)。四株菌株對金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)出較高的共凝集能力

(分別為52.0±14.9%，35.7±2.3%，51.1±13.1%，52.1±2.9%)。HSM-10和HSM-14對李斯特菌具有高共凝集能力，其次是HSM-1和HSM-18。而對于沙門氏菌，只有HSM-14表現(xiàn)出高的共凝集能力。HSM-1、HSM-10、HSM-18與金黃色葡萄球菌的共聚集均超過50%，效果優(yōu)于鼠傷寒和單核增生L.。溶液配方1.LB固體培養(yǎng)基1,000ml

序號試劑質(zhì)量/體積1LB培養(yǎng)基粉末25g2瓊脂粉12.5g

2.MR