pcr擴增實驗報告

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篇一：DNA提取及PCR擴增實驗報告

PCR擴增及DNA瓊脂糖凝膠電泳

劉琳1131428環(huán)境科學(xué)

一、實驗?zāi)康?/p>

1．學(xué)習(xí)并掌握PCR擴增的基本原理與實驗技術(shù)。

2．對擴增后的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳試驗，并分析相應(yīng)結(jié)果。

二、實驗原理

1.PCR擴增

多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)的原理類似于DNA的天然復(fù)制過程。在微量離心管中加入適量緩沖液，加入微量模板DNA、四種脫氧核苷酸（dNTP）、耐熱Taq聚合酶及兩個合成DNA的引物，而后加熱使模板DNA在高溫下（94℃）變性，雙鏈解鏈，這是所謂變性階段。降低溶液溫度，使合成引物在低溫（55℃）與模板DNA互補退火形成部分雙鏈，這是所謂退火階段。溶液反應(yīng)溫度升至中溫（72℃），在Tap酶作用下，用四種dNTP為原料，引物為復(fù)制起點，模板DNA的一條雙鏈在解鏈和退火之后延伸為兩條雙鏈，這是延伸階段。如此反復(fù)，在同一反應(yīng)體系中可重復(fù)高溫變性、低溫退火和DNA合成這一循環(huán)，使產(chǎn)物DNA重復(fù)合成，并在重復(fù)過程中，前一循環(huán)的產(chǎn)物DNA可作為后一循環(huán)的模板DNA而參與DNA的合成，使產(chǎn)物DNA的量按指數(shù)方式擴增。經(jīng)過30～40個循環(huán)，DNA擴增即可完成。

2.DNA瓊脂糖凝膠電泳實驗

DNA分子在高于其等電點的溶液中帶負(fù)電，在電場中向陽極移動。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即分子本身的大小和構(gòu)型是主要的影響因素。DNA分子的遷移速度與其相對分子量成反比。不同構(gòu)型的DNA分子的遷移速度不同。該電泳方法以瓊脂凝膠作為支持物，利用DNA分子在泳動時的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達到分離混合物的目的。

三、實驗材料

儀器：PCR擴增儀、薄壁管、離心管、移液槍、槍頭、微波爐、電泳儀、水平電泳槽、制膠版、紫外透射儀。

試劑：TapDNA聚合酶、dNTP、buffer、兩種引物、16S全長DNA樣本、無菌ddH2O、模板DNA、TBE、瓊脂糖、EB、顯色劑。

四、實驗步驟

1.PCR擴增

本次試驗選擇細(xì)菌16SrDNAV3區(qū)片段進行擴增。

根據(jù)計算，首先取離心管按照10×Buffer、1uldNTP、ul341GC、ul534、ulTaq、ddH2O的比例配置足量的PCR反應(yīng)體系。

分別向9個薄壁管中分別加入24ul的反應(yīng)體系，并分別添加8種不同的模版，并于第9個薄壁管中加入無菌ddH2O作為陰性對照。

將薄壁管放入PCR擴增儀中，按照預(yù)定程序進行PCR擴增。其中循環(huán)過程需要達到30~40次。程序如下：

預(yù)變性：94℃3min

循環(huán)：94℃變性30s

55℃退火30s

72℃延伸30s

末次延伸：72℃5min

PCR擴增完成后，將樣品取出并保存于15℃環(huán)境中。

2.DNA瓊脂糖凝膠電泳實驗

稱取瓊脂糖粉末，放到一錐形瓶中，加入適量的×TBE電泳緩沖液。然后置微波爐加熱至完全溶化，溶液透明。搖勻，待冷卻至60℃左右，在膠液內(nèi)加入適量的EB。

取有機玻璃制膠板槽，在一端插好梳子，在槽內(nèi)緩慢倒入已冷至60℃左右的膠液，使之形成均勻水平的膠面。

待膠凝固后，小心拔起梳子，使加樣孔端置陰極段放進電泳槽內(nèi)。

在槽內(nèi)加入×TBE電泳緩沖液，至液面覆蓋過膠面。取1μl緩沖液和5μl待測DNA樣品混合后，用移液槍滴加至凝膠的加樣孔中。

接通電泳儀和電泳槽，并接通電源，調(diào)節(jié)穩(wěn)壓輸出，電壓最高不超過5V/cm，開始電泳。點樣端放陰極端。根據(jù)經(jīng)驗調(diào)節(jié)電壓使分帶清晰。

觀察溴酚蘭的帶（藍色）的移動。當(dāng)其移動至距膠板前沿約1cm處，可停止電泳。

在紫外透視儀的樣品臺上重新鋪上一張保鮮膜，趕去氣泡平鋪，然后把凝膠放在上面。關(guān)上樣品室外門，打開紫外燈，通過觀察孔進行觀察。

五、實驗結(jié)果與討論

如圖所示：從左至右，分別是模版

1-8號，第9列為陰性對照。

前8列均有明顯的條帶出現(xiàn)，而陰

性對照無顯示，說明擴增整體效果很

好。圖中有上下兩條線，上面一條線所

覆蓋的條帶基本可以代表擴增的產(chǎn)生

的片段位置，參照圖可以看出擴增片段

在200bp左右。在第9個陰性對照的第

二條線處可以看到較為模糊的條帶，并

非是出現(xiàn)假陰性，而是由于二聚物而產(chǎn)

生的條帶。通過該條帶與最右側(cè)的

marker對比可知該片段出現(xiàn)在100bp左

右，并非由于實驗操作等問題而產(chǎn)生的

污染。

實驗的照片顯示實驗結(jié)果有拖尾

現(xiàn)象，但是并不影響后續(xù)實驗。在實驗

過程中由于有些試劑加到了管壁上面，

并沒有完全加入，可能會出現(xiàn)一些誤

差。另外在第1列條帶中出現(xiàn)了其他的亮帶，可能是由于在前期的擴增實驗中滴加試劑時由于量過少而進行的搖勻和融合等操作產(chǎn)生了非特異性擴增，也有可能是因為膠板制作過程中梳子的位置不合適或者膠板制作時邊緣處不夠均勻?qū)е庐a(chǎn)生污染。但總體而言，實驗結(jié)果較為滿意。

六、實驗注意事項

1.由于PCR技術(shù)非常敏感，可使一個DNA分子得以擴增，裝有PCR試劑的離心管打開之前，應(yīng)先在微量離心機上作瞬間離心使液體沉積于管底。PCR擴增反應(yīng)的條件，要控制好溫度、時間和循環(huán)次數(shù)。

2.最好在加完所有其它反應(yīng)成分后才加模板DNA。

3.配瓊脂糖時應(yīng)使其完全溶化后方可制膠。

具有致癌作用，配制及使用時應(yīng)帶一次性手套。并在專門的實驗室內(nèi)使用。

七、實驗收獲

1.通過本次實驗學(xué)習(xí)并掌握了PCR反應(yīng)的基本原理、實驗過程及技術(shù)。

2.通過本次實驗掌握了電泳實驗分離DNA的原理和方法。

八、思考題

1、如果你的研究中要擴增大腸桿菌某個酶的基因，你如何進行相關(guān)實驗？

通過PCR擴增出想要的片段，然后通過凝膠電泳實驗進行回收，并與合適的載體連接，轉(zhuǎn)化進感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)過培養(yǎng)提取質(zhì)粒，進行酶切或PCR驗證，測序最終驗證，保存菌種

2.一對引物序列為5‘-GACTCCAGTCGAATCTACCA-3’和

5‘-AACCGTGGCGACACCGCTAA請計算它們的Tm值及選擇合適的退火溫度，如果按你算的退火溫度做PCR時沒有得到相應(yīng)的產(chǎn)物，你怎么解決？

5‘-GACTCCAGTCGAATCTACCA-3’

Tm值=4（G+C）+2-

=4（3+7）+2（6+4）-

=60℃-

=50~55℃

5‘-AACCGTGGCGACACCGCTAA’

Tm值=4（G+C）+2-

=4+2-

=64℃-=54~59℃

因此退火溫度可以選擇在55℃

可以通過分析幾個逐步提高退火溫度的反應(yīng)以提高特異性。開始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。為獲得最佳結(jié)果，兩個引物應(yīng)具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5℃，就會令引物在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同，將退火溫度設(shè)定為比最低的Tm低5℃或者為了提高特異性，可以在根據(jù)較高Tm設(shè)計的退火溫度先進行5個循環(huán)，然后在根據(jù)較低Tm設(shè)計的退火溫度進行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。

篇二：PCR實驗報告

普通生物學(xué)實驗報告

實驗名稱：用PCR擴增的方法鑒別不同物種來源的肌肉

一、特異性目的片段DNA的擴增

（一）實驗原理

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction,PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，其基本原理為DNA的半保留復(fù)制。PCR技術(shù)由①高溫變性模板；②引物與模板退火；③引物沿模板延伸這3步反應(yīng)組成一個循環(huán)，通過多次循環(huán)反應(yīng)，目的DNA得以迅速擴增。其主要步驟是：將模板DNA置于高溫下（通常為93℃-94℃），使其變性解成單鏈；人工合成的兩個寡核苷酸引物在其合適的復(fù)性溫度下分別與目的基因的兩條單鏈互補結(jié)合；熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶)在72℃將單核苷酸從引物的3’端開始摻入，以目的基因為模板按5’→3’的方向延伸，合成互補鏈。

本實驗采用物種特異性引物擴增的方法來鑒定3種不同物種來源的肌肉。以不同物種來源的動物DNA為模板，用物種特異性的引物進行PCR擴增，只有在模板和引物的物種相對應(yīng)的情況下才會有特異性條帶的出現(xiàn)。應(yīng)用此方法，可以特異性地檢測樣品中痕量的特定DNA成分。

（二）實驗步驟

1.不同反應(yīng)體系的配制

按下表將各成分分別加入一做好標(biāo)記的無菌PCR管中，配制50μl的PCR反應(yīng)體系，注意酶要最后加，加完后將PCR管放置在冰上。

2.將上述混合液稍加離心，約10s左右。取下后立即置于PCR儀中，蓋緊熱蓋，定好PCR儀的反應(yīng)程序，執(zhí)行擴增程序。

反應(yīng)程序為：

預(yù)變性94℃5min

變性94℃5s

退火50℃5s

延伸72℃20s

后延伸72℃5min

3.反應(yīng)結(jié)束后，終止程序，將PCR管取出，放置于4℃，待電泳檢測。循環(huán)30次

二、水平式瓊脂糖凝膠電泳法鑒定PCR產(chǎn)物

（一）實驗原理

核酸分子是兩性解離分子，在高于其等電點的電泳緩沖液（pH)中，其堿基不解離，而磷酸集團全部解離，核酸分子因而帶負(fù)電荷，電泳時向正極遷移。瓊脂糖主要是從海洋植物瓊脂中提取而來并經(jīng)糖基化修飾，為一種聚合鏈線性分子。使用瓊脂糖凝膠作為電泳支持介質(zhì)，發(fā)揮分子篩功能，使得大小和構(gòu)象不同的核酸分子的遷移率出現(xiàn)較大差異，從而達到分離的目的。

（二）實驗步驟

1.制膠

稱取瓊脂糖，放入250ml的錐形瓶中，加入120ml1×TAE緩沖液，微波爐高火加熱約40s直至沸騰，搖動，使瓊脂糖分散，在重復(fù)煮沸2次，直至溶液澄清透明。待瓊脂糖溫度降到60℃左右時，按1:20000的濃度加入GoldenView,混勻后倒入已插上合適齒孔梳子的模具中，靜置，約30-45min后凝膠完全凝固。輕輕的垂直拔出梳子，將凝膠取出，放入電泳槽中，添加1×TAE緩沖液至剛好沒過凝膠（有樣品孔的一端靠近負(fù)極）。

2.加樣

取15μlPCR產(chǎn)物與3μl的6×上樣緩沖液混勻，加入到凝膠樣品孔中。每加完一個樣品應(yīng)更換一個吸頭。加樣前，要記下加樣的順序。在每排樣品孔中留出一個位置加入5μl的marker。

3.電泳

加樣后的凝膠板立即通電進行電泳，電壓100V，樣品由負(fù)極向正極移動。當(dāng)溴酚藍移動到距離凝膠下緣約1/3時，停止電泳。

4.拍照

電泳完畢后，取出凝膠，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

三、實驗小結(jié)

（一）實驗結(jié)果

PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

由上圖可以看出，樣品1和樣品6出現(xiàn)了目的條帶（大小約200bp），所以DNA模板1為豬肉DNA，DNA模板3為牛肉DNA,DNA模板2為兔肉DNA。

（二）實驗討論

1.在加入Taq酶時，應(yīng)始終保持酶在冰浴中，不可握在手中。

2.每加完一次酶，都應(yīng)更換吸頭。因為在加酶時，吸頭會插入液面以下，為防止污染，應(yīng)更換吸頭。

3.拔出梳子時，應(yīng)兩端一起用力，垂直，緩慢地拔出，以免破壞膠孔。

4.將樣品與上樣緩沖液混合時，要反復(fù)吸進，擠出溶液。為防止出現(xiàn)較多氣泡，在每次擠出溶液時，可在吸頭中殘留少量溶液。

5.在加樣時，吸頭要垂直于凝膠板且不要插入太深，以免破壞樣品孔。

6.我們組的電泳圖中，條帶不是很明顯，應(yīng)該是加樣時樣品的量不夠充足，以后應(yīng)注意。

篇三：PCR實驗報告

PCR實驗報告

實驗?zāi)康模毫私釶CR技術(shù)原理，掌握最基礎(chǔ)的PCR實驗步驟。

實驗試劑：模板DNA，Mg2+，buffer，dNTPs，TaqDNA聚合酶，引物，H2O。

實驗原理：

?PCR全稱聚合酶鏈反應(yīng)，是體外快速擴增特定基因或DNA序列最常用的方法。

?基本原理：首先將雙鏈DNA分子在臨近沸點的溫度下

加熱分離成2條單鏈DNA分子，DNA聚合酶以單鏈DNA為模板并利用反應(yīng)混合物中的四種脫氧核苷三磷酸合成新的DNA互補鏈。PCR反應(yīng)時，只要在試管內(nèi)加入模板DNA、PCR引物、四種核苷酸及適當(dāng)濃度的Mg2+，DNA聚合酶就能在數(shù)小時內(nèi)將目標(biāo)序列擴增100萬倍以上。

（1）雙鏈模板DNA分子首先在高溫下解開成長的單鏈，短鏈引物分子立即與該模板DNA

兩端的特定序列相結(jié)合，產(chǎn)生雙鏈區(qū)。

（2）DNA聚合酶從引物處開始復(fù)制其互補鏈，迅速產(chǎn)生與目標(biāo)序列完全相同的復(fù)制品。

（3）在后續(xù)反應(yīng)中，無論是起始模板DNA還是經(jīng)復(fù)制的雜合DNA雙鏈，都會在高溫下解

開成為單鏈，體系中的引物分子再次與其互補序列相結(jié)合，聚合酶也再度復(fù)制模板DNA。

（4）由于在PCR反應(yīng)中選用的一對引物，是按照與擴增區(qū)域兩端序列彼此互補的原則設(shè)計

的，因此每一條新生鏈的合成都是從引物的退火結(jié)合位點開始并朝反方向延伸的，每一條新合成的DNA鏈上都有新的引物結(jié)合位點。

（5）整個PCR的反應(yīng)全過程，即DNA解鏈（變性）、引物與模板DNA結(jié)合（退火）、DNA

合成（鏈的延伸）三步可以被不斷重復(fù)。經(jīng)多次循環(huán)之后，反應(yīng)混合物中所含有的雙鏈DNA分子數(shù)，即兩條引物結(jié)合位點之間的DNA區(qū)段的拷貝數(shù)，理論上的最高值應(yīng)該是2

，能進一步滿足遺傳分析的需要。

?試劑作用：

（1）引物：DNA復(fù)制的起始點，針對復(fù)制DNA片段的兩端，有5’引物和3’引物

（2）TaqDNA聚合酶：促進dNTPs與模板結(jié)合。

（3）Buffer：Tris-HCl反應(yīng)緩沖液，TaqDNA聚合酶提供一個最適酶催反應(yīng)條件。

（4）Mg2+：對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低則

影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。

（5）dNTPs：底物，在引物引導(dǎo)下合成與模板互補的DNA新鏈。

（6）石蠟油：防止PCR加熱過程中DNA蒸發(fā)。

?試劑配置體積：

（1）熱啟動：94℃，5~10min

（2）變性：94℃，45~60s。

（3）退火：50~65℃，1min。退火溫度計算：Tm-（5℃~10℃），Tm（解鏈溫度）=4