微生物學(xué)教學(xué)課件：第七章 微生物的遺傳變異和育種

第七章微生物的遺傳變異和育種1、遺傳：指上一代生物如何將自身的一整套遺傳基因穩(wěn)定地傳遞給下一代的行為或功能。2、遺傳型：即基因型，指某一生物個(gè)體所含有的全部遺傳因子即基因組所攜帶的遺傳信息。3、表型：指某一生物體所具有的一切外表特征和內(nèi)在特性的總和，是其遺傳型在合適環(huán)境條件下通過(guò)代謝和發(fā)育而得到的具體體現(xiàn)。4、變異：指生物體在某種外因或內(nèi)因的作用下所引起的遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)或數(shù)量的改變，即遺傳型的改變。5、飾變：指外表的修飾性改變，即一種不涉及遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變而只發(fā)生在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯水平上的表型變化。微生物的遺傳和變異的特點(diǎn)：①、微生物的代謝作用旺盛，有極高的繁殖速度；生活史周轉(zhuǎn)快；環(huán)境因素可在短期內(nèi)重復(fù)影響其生長(zhǎng)和繁殖，易發(fā)生變異，又能迅速產(chǎn)生大量后代，有利于自然選擇和人工選擇。②、微生物細(xì)胞體積小，面積大，與外界環(huán)境能直接接觸。當(dāng)環(huán)境條件變化劇烈時(shí)，大多數(shù)個(gè)體易死亡而淘汰，個(gè)別細(xì)胞則發(fā)生變異而適應(yīng)新環(huán)境。③、大多數(shù)微生物均進(jìn)行無(wú)性繁殖，而且營(yíng)養(yǎng)體多為單倍體，因而便于建立純系及長(zhǎng)期保存大量品系。如果一旦發(fā)生變異，也能夠迅速在性狀上反映出來(lái)。第一節(jié)遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)第二節(jié)基因突變和誘變育種

第三節(jié)基因重組和雜交育種第四節(jié)基因工程第五節(jié)菌種的衰退、復(fù)壯和保藏第一節(jié)遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)一、證明遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)的三個(gè)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)1、經(jīng)典轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象：肺炎鏈球菌S型和R型。①動(dòng)物實(shí)驗(yàn)②細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn)③S型菌的無(wú)細(xì)胞抽提液試驗(yàn)

長(zhǎng)出大量R菌和少量S菌④離體轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)1)從活的S菌中抽提各種細(xì)胞成分（DNA,蛋白質(zhì)，莢膜多糖等）；2)對(duì)各組分進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)：2、噬菌體感染實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象：噬菌體過(guò)程：3、植物病毒的重建實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象：TMVANDHRV過(guò)程：（一）核酸存在的七個(gè)水平細(xì)胞水平：存在于細(xì)胞核或核質(zhì)體，單核或多核細(xì)胞核水平:原核與真核生物的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)不同，核外DNA染色體水平:倍性(真核)和染色體數(shù)核酸水平：DNA或RNA，復(fù)合或裸露，雙鏈或單鏈基因水平：具自主復(fù)制能力的遺傳功能單位，長(zhǎng)度與信息量，轉(zhuǎn)錄——翻譯密碼子水平：信息單位，起始和終止,核苷酸水平：突變或交換單位，四種堿基二、遺傳物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的存在部位和方式（二）原核生物的質(zhì)粒定義：是一類(lèi)小型閉合環(huán)狀核外雙螺旋DNA分子，能獨(dú)立于細(xì)胞核進(jìn)行自主復(fù)制，上面攜帶有數(shù)個(gè)到數(shù)十個(gè)甚至上百個(gè)基因。性質(zhì)：①可以在細(xì)胞質(zhì)中獨(dú)立于染色體之外獨(dú)立存在（游離態(tài)），也可以通過(guò)交換摻入染色體上，以附加體的形式存在；②質(zhì)粒是一種復(fù)制子，根據(jù)自我復(fù)制能力的不同，可把質(zhì)粒復(fù)制的控制形式分為嚴(yán)緊型和松弛型兩種，嚴(yán)緊型質(zhì)粒的復(fù)制受細(xì)胞核控制，與染色體DNA復(fù)制相伴隨,一般一個(gè)寄主細(xì)胞內(nèi)只有少數(shù)幾個(gè)拷貝；松弛型質(zhì)粒的復(fù)制不受細(xì)胞核控制，在染色體DNA復(fù)制停止的情況下仍可以進(jìn)行復(fù)制，在細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量可以達(dá)到10-200個(gè)或更多。③可以通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或接合作用而由一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)菌細(xì)胞中，使兩個(gè)細(xì)胞都成為帶有質(zhì)粒的細(xì)胞；質(zhì)粒轉(zhuǎn)移時(shí)，它可以單獨(dú)轉(zhuǎn)移，也可以攜帶著染色體（片段）一起進(jìn)行轉(zhuǎn)移，所以它可成為基因工程的載體。④功能多樣化功能：進(jìn)行細(xì)胞間接合，并帶有一些基因，如產(chǎn)生毒素、抗藥性、固氮、產(chǎn)生酶類(lèi)、降解功能等。重組：在質(zhì)粒之間、質(zhì)粒與染色體之間菌可發(fā)生。存在范圍：很多細(xì)菌制備：包括增殖、裂解細(xì)胞、分離質(zhì)粒與染色體和蛋白質(zhì)等成分、去除RNA和蛋白質(zhì)等步驟。鑒定：電鏡觀察、電泳、密度梯度離心、限制性酶切圖譜等方法典型質(zhì)粒簡(jiǎn)介1)F因子(fertilityfactor)：又稱致育因子或性因子。功能：決定細(xì)菌的性別，同時(shí)還具有轉(zhuǎn)移能力。tra轉(zhuǎn)移區(qū)：與質(zhì)粒轉(zhuǎn)移和性菌毛合成有關(guān)。轉(zhuǎn)座因子：可整合到宿主染色體的一定部位，導(dǎo)致基因重組。2)R因子(resistancefactor)：又稱R質(zhì)粒

結(jié)構(gòu)：由兩個(gè)相連的DNA片段組成——RTF和r決定因子。

RTF功能：RTF即抗性轉(zhuǎn)移因子。含調(diào)節(jié)DNA復(fù)制和拷貝數(shù)的基因以及轉(zhuǎn)移基因，具有轉(zhuǎn)移功能。r決定因子功能：r決定因子即抗性決定因子。無(wú)轉(zhuǎn)移功能，含各種抗性因子。作用：引起致病菌對(duì)多種抗生素的抗性，對(duì)傳染病的防治造成危害；R質(zhì)?？捎米鼍旰Y選時(shí)的選擇性標(biāo)記或改造成外源基因的克隆載體。3)Col因子(colicinogenicfactors):即產(chǎn)大腸桿菌素因子。4)Ti質(zhì)粒(tumorinducingplasmid)：即誘癌質(zhì)粒。是植物遺傳工程的主要載體。5)巨大質(zhì)粒(mega質(zhì)粒)：發(fā)現(xiàn)于根瘤菌屬中，上面有一系列固氮基因。

第二節(jié)基因突變和誘變育種一、基因突變簡(jiǎn)稱突變，指細(xì)胞內(nèi)（或病毒粒內(nèi)）遺傳物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)或數(shù)量突然發(fā)生的可遺傳的變化。（一）類(lèi)型1、根據(jù)表型劃分選擇性突變—具有選擇性標(biāo)記，可通過(guò)某種環(huán)境條件使它們得到優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)，從而取代原始菌株。非選擇性突變—無(wú)選擇性標(biāo)記，而只有一些性狀的數(shù)量差別，如菌落大小、顏色深淺、代謝物產(chǎn)量等。(1)營(yíng)養(yǎng)缺陷型：某一野生型菌株由于發(fā)生基因突變而喪失合成一種或幾種生長(zhǎng)因子的能力，因而無(wú)法在基本培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)繁殖的變異類(lèi)型，稱為營(yíng)養(yǎng)缺陷型。它們可在加有某生長(zhǎng)因子的基本培養(yǎng)基平板上選出。(2)抗性突變型：由于基因突變而使原始菌株產(chǎn)生了對(duì)某種化學(xué)藥物或致死物理因子抗性的變異類(lèi)型。它們可在加有相應(yīng)藥物或用相應(yīng)物理因子處理的培養(yǎng)基平板上選出。

(3)條件致死突變型：某菌株或病毒經(jīng)基因突變后，在某種條件下可正常地生長(zhǎng)、繁殖并實(shí)現(xiàn)其表型，而在另一種條件下卻無(wú)法生長(zhǎng)、繁殖的突變類(lèi)型，稱為條件致死突變型。Ts突變株(溫度敏感突變株)：是一類(lèi)典型的條件致死突變株，指可在某一溫度下生長(zhǎng)而在另一溫度下不生長(zhǎng)的突變株。(4)形態(tài)突變型：指由于突變而產(chǎn)生的個(gè)體或菌落形態(tài)所發(fā)生改變。(5)抗原突變型：指由于基因突變而引起的抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生突變的變異類(lèi)型。(6)產(chǎn)量突變型：通過(guò)基因突變而獲得的在有用代謝產(chǎn)物產(chǎn)量上明顯有別于原始菌株的突變株，稱為產(chǎn)量突變型。若產(chǎn)量高于原始菌株者，稱為正變株，反之則稱負(fù)變株。

（二）突變率1、概念：指某一個(gè)細(xì)胞（或病毒粒）每一個(gè)世代中發(fā)生某一性狀突變的概率。也是突變?cè)诿總€(gè)細(xì)胞生存的單位生物學(xué)時(shí)間（世代）內(nèi)發(fā)生的概率。2、測(cè)定：應(yīng)用選擇培養(yǎng)法來(lái)直接測(cè)定突變率。（三）基因突變的特點(diǎn)1、自發(fā)性：各種性狀的突變，可以在沒(méi)有人為的誘變因素處理下自發(fā)地產(chǎn)生。2、不對(duì)應(yīng)性：指突變的性狀與引起突變的原因間無(wú)直接的對(duì)應(yīng)關(guān)系。3、稀有性：自發(fā)突變雖可隨時(shí)發(fā)生，但其突變率卻是極低和穩(wěn)定的。4、獨(dú)立性：突變的發(fā)生一般是獨(dú)立的，某一基因的突變率不受它種基因突變率的影響。5、可誘變性：自發(fā)突變的頻率可因誘變劑的影響而大為提高。6、穩(wěn)定性：基因突變后的新性狀是穩(wěn)定的。7、可逆性：由原始的野生型基因變異為突變型基因的過(guò)程，稱為正向突變，相反的過(guò)程則稱為回復(fù)突變或回變。任何性狀都可發(fā)生正向突變，也都可發(fā)生回復(fù)突變。（四）基因突變的自發(fā)性和不對(duì)應(yīng)性的證明突變是通過(guò)適應(yīng)而產(chǎn)生的，突變的原因與性狀間是相對(duì)應(yīng)的。

突變是自發(fā)的，與環(huán)境是不相對(duì)應(yīng)的。

PK1、變量實(shí)驗(yàn)（1）實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：E.coli對(duì)于phageT1的抗性變異波動(dòng)實(shí)驗(yàn)。（2）原理：通過(guò)小試管中抗性細(xì)菌數(shù)的波動(dòng)情況證明細(xì)菌抗性的來(lái)歷。如果抗藥性的出現(xiàn)是由于細(xì)菌對(duì)于藥物所發(fā)生的適應(yīng)性的反應(yīng)，那么分裝在許多小試管中的樣品將出現(xiàn)大致相等數(shù)目的細(xì)菌；如果抗藥性的出現(xiàn)是由于基因突變，由于突變?cè)跁r(shí)間上的隨機(jī)性，不同試管中的抗性細(xì)菌數(shù)將會(huì)表現(xiàn)高度波動(dòng)。（3）結(jié)果：從來(lái)自同一個(gè)培養(yǎng)物的大試管取樣測(cè)定的抗性菌落數(shù)比較接近，而來(lái)自不同培養(yǎng)物(20支小試管)的樣品的抗性菌落數(shù)的數(shù)值卻相差很大。（4）結(jié)論：E.coli抗噬菌體性狀的突變，不是由環(huán)境因素——噬菌體誘導(dǎo)出來(lái)的，而是在它接觸到噬菌體前，在某一次細(xì)胞分裂過(guò)程中隨機(jī)地自發(fā)產(chǎn)生的。這種自發(fā)突變發(fā)生得越早，則抗性菌落出現(xiàn)得越多，反之則越少。噬菌體在這里僅起著淘汰原始的未突變的敏感菌和甄別抗噬菌體突變型的作用。2、涂布實(shí)驗(yàn)（1）實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：（2）實(shí)驗(yàn)原理：若抗性是在接觸噬菌體以后產(chǎn)生的，那么噴噬菌體以前的重新涂布無(wú)非使細(xì)菌所處的位置發(fā)生改變，而不會(huì)因?yàn)橥坎即蟠蟮馗淖兗?xì)菌對(duì)于噬菌體的反應(yīng)，因此兩組培養(yǎng)皿上出現(xiàn)的抗性菌落數(shù)應(yīng)相等；若抗性發(fā)生在接觸噬菌體以前，那么在噴上噬菌體以前某些菌落中的抗性突變型細(xì)菌已經(jīng)分裂若干次，在不經(jīng)重新涂布的培養(yǎng)皿上形成一個(gè)菌落，在重新涂布的培養(yǎng)皿上出現(xiàn)若干菌落。（3）結(jié)果：重新涂布的培養(yǎng)皿上出現(xiàn)的抗性菌落多于未經(jīng)重新涂布的。（4）結(jié)論：抗性突變的發(fā)生在接觸噬菌體之前。3、影印培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)（1）實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：（2）實(shí)驗(yàn)原理：通過(guò)蓋印章的方式，在未接觸抗性因素的條件下篩選出的抗性突變株。由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中沒(méi)有接觸過(guò)抗性因素，所以直接證明了基因突變的自發(fā)性。（3）結(jié)果：得到越來(lái)越多的抗性菌落，最終甚至可以得到純的抗性菌株細(xì)胞群。。（4）結(jié)論：基因突變的自發(fā)性。（五）突變機(jī)制1、誘發(fā)突變的機(jī)制（1）點(diǎn)突變：即狹義的基因突變，指DNA的單個(gè)堿基發(fā)生替換所引起的突變。1）堿基置換：一對(duì)堿基被另一對(duì)堿基所置換。轉(zhuǎn)換：即DNA鏈中的一個(gè)嘌呤被另一個(gè)嘌呤或是一個(gè)嘧啶被另一個(gè)嘧啶所置換顛換：即DNA鏈中的一個(gè)嘌呤被另一個(gè)嘧啶或是一個(gè)嘧啶被另一個(gè)嘌呤所置換。2)移碼突變：指DNA分子中的一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)核苷酸的增添(插入)或缺失，從而使該部位后面的全部遺傳密碼發(fā)生轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯錯(cuò)誤的一類(lèi)突變。由移碼突變所產(chǎn)生的突變株，稱為移碼突變株。a.由于在DNA分子的編碼區(qū)插入或缺失非3的整數(shù)倍個(gè)(1個(gè)、2個(gè)或4個(gè))核苷酸而導(dǎo)致閱讀框架位移，導(dǎo)致翻譯出來(lái)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列與野生型完全不同。b.如果插入或缺失的堿基正好是3個(gè)或其整倍數(shù)，那么在翻譯出的多肽上可能是多一個(gè)、幾個(gè)或少一個(gè)、幾個(gè)氨基酸，而不完全打亂整個(gè)氨基酸序列。（2）染色體畸變指染色體的結(jié)構(gòu)和數(shù)目的改變。是DNA分子大范圍的損傷。1）染色體結(jié)構(gòu)變異缺失指染色體丟失了一個(gè)片段，使之位于這個(gè)片段上的基因也隨之丟失。重復(fù)：一個(gè)染色體上某一片段出現(xiàn)兩份或兩份以上，使位于這些片段上的基因多了一份或幾份。缺失和重復(fù)都起因于染色體上基因數(shù)目的變化。倒位在同一染色體上某一個(gè)片段作180°的顛倒，造成染色體上基因順序的重排。如果顛倒的片段包括著絲粒在內(nèi)的倒位稱為臂間倒位，不包括著絲粒的倒位稱為臂內(nèi)倒位。易位一個(gè)染色體臂的一段移接到另一非同源染色體的臂上的結(jié)構(gòu)變異。最常見(jiàn)的是相互易位，非同源染色體間相互交換染色體片段，造成染色體間基因的重排。倒位和易位都起因于染色體上基因排列位置的變化。2

自發(fā)突變：無(wú)人為因素下的低頻率（約10－9～10－6）（1）背景輻射

（2）有害產(chǎn)物積累

（3）堿基錯(cuò)配:其中堿基本身的互變異構(gòu)是導(dǎo)致堿基對(duì)置換的原因之一。（六）紫外線對(duì)DNA的損傷及機(jī)體對(duì)損傷DNA的修復(fù)紫外線作用：同鏈DNA的相鄰T間形成共價(jià)T二聚體，阻礙堿基間正常配對(duì)，從而引起突變或死亡。(1)光復(fù)活(2)切除修復(fù)(3)重組修復(fù)(4)SOS修復(fù)（1）光復(fù)活作用把經(jīng)紫外線照射后的微生物立即暴露于可見(jiàn)光下時(shí)，可明顯降低其死亡率的現(xiàn)象，稱為光復(fù)活作用。光復(fù)活機(jī)理：經(jīng)紫外線照射所形成的帶有胸腺嘧啶二聚體的DNA分子，在黑暗中與光激活酶（photoreactivatingenzyme）結(jié)合，形成的復(fù)合物暴露在可見(jiàn)光（300-500nm）下時(shí)，此酶會(huì)因獲得光能而發(fā)生解離，從而使二聚體重新分解成單體。由于在一般的微生物中都存在著光復(fù)活作用，所以在進(jìn)行紫外線誘變育種時(shí)，只能在紅光下進(jìn)行照射及處理照射后的菌液。（2）暗修復(fù)作用暗修復(fù)作用又稱切除修復(fù)（excisionrepair），是細(xì)胞內(nèi)的主要修復(fù)系統(tǒng)，用于修復(fù)被誘變劑（包括紫外線、烷化劑、X射線和γ射線等）損傷后的DNA的機(jī)制。全部修復(fù)過(guò)程由四種酶完成，即①內(nèi)切核酸酶在胸腺嘧啶二聚體的5’一側(cè)切開(kāi)一個(gè)3’-OH和5’-P的單鏈缺口；②外切核酸酶從5’-P至3’-OH方向切除二聚體，并擴(kuò)大缺口；③DNA聚合酶修補(bǔ)缺口④連接酶連接裂口1、由核酸內(nèi)切酶切開(kāi)二聚體的5’末端，形成3’-OH和5’-P的單鏈缺口2、核酸外切酶從5’-P到3’-OH方向切除二聚體，并擴(kuò)大缺口。3、DNA聚合酶以另一條互補(bǔ)鏈為模板，從原有鏈上暴露的3’-OH端起合成缺失片段。4、連接酶將新合成的3’-OH與原有的5’-P相連接。二、突變與育種菌種工作包括三方面：選種、育種、復(fù)壯和保藏。選種—從自然界和生產(chǎn)中選擇符合需要菌種。育種—進(jìn)一步提高已有菌種某種性能，使更符合要求。選育新菌種可從幾方面著手：1）從原有菌株入手進(jìn)行各種遺傳改造工作。2）根據(jù)文獻(xiàn)資料報(bào)導(dǎo)的微生物種屬，向國(guó)內(nèi)外菌種保藏機(jī)構(gòu)索取同種或同屬菌株，從中尋求符合要求者。3）根據(jù)所需菌種特性、嗜好或工藝要求，從特定的生態(tài)環(huán)境中以特定方法重新分離自然菌株。（一）自發(fā)突變與育種1、生產(chǎn)育種在利用微生物進(jìn)行大生產(chǎn)的過(guò)程中由于微生物會(huì)以10-6左右的突變率進(jìn)行自發(fā)突變，從而分離出生產(chǎn)性狀優(yōu)于原菌株的優(yōu)良菌株。2、定向育種

用某一特定環(huán)境長(zhǎng)期處理某一微生物群體，同時(shí)不斷地進(jìn)行移種傳代，以達(dá)到積累和選擇合適的自發(fā)突變體的一種古老育種方法。

（二）誘變育種利用物理或化學(xué)誘變劑處理均勻分散的微生物細(xì)胞群，促進(jìn)其突變率大幅度提高，然后設(shè)法采用簡(jiǎn)便、快速、高效的篩選方法，從中挑選少數(shù)符合目的的突變株，以供生產(chǎn)科研之用。

基本步驟：原種（出發(fā)菌株）→純化→斜面→同步培養(yǎng)→離心洗滌→振蕩打散→過(guò)濾→菌懸液→誘變處理→平板分離→斜面→

（活菌計(jì)數(shù)）（計(jì)數(shù)）（變異率）斜面→斜面→保藏及擴(kuò)大試驗(yàn)（初篩）（復(fù)篩）（再?gòu)?fù)篩）誘變育種基本步驟1、出發(fā)菌株的選擇(1)對(duì)出發(fā)菌株的要求生長(zhǎng)快，營(yíng)養(yǎng)要求粗放，發(fā)育早，產(chǎn)孢子多，對(duì)誘變劑敏感性高，已能積累少量產(chǎn)品或前體物的菌株。(2)出發(fā)菌株的選擇1)選取自然界新分離的野生型菌株，它們對(duì)誘變因素敏感，容易發(fā)生變異；2)選取生產(chǎn)中由于自發(fā)突變或長(zhǎng)期在生產(chǎn)條件下馴化而篩選得到的菌株，與野生型菌株較相象，容易達(dá)到較好的誘變效果；3)選取每次誘變處理都有一定提高的菌株，往往多次誘變可能效果迭加，積累更多的提高。2、出發(fā)菌株的純化(1)目的：獲得遺傳性狀基本一致的，并且穩(wěn)定的變種。(2)原因：遺傳背景復(fù)雜的菌種誘變后負(fù)變率將增加；誘變史長(zhǎng)的菌株，采用強(qiáng)烈誘變劑處理，又不進(jìn)行純化分離，誘變效果差。(3)純種分離方法：常用劃線分離法和稀釋分離法。3、同步培養(yǎng)（前培養(yǎng)）(1)目的：獲得生理狀態(tài)一致的培養(yǎng)物。(2)原因：突變率高，重現(xiàn)性也好。(3)方法：1)細(xì)菌一般要求培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；2)霉菌處理使用分生孢子，應(yīng)該將分生孢子在液體培養(yǎng)基中短時(shí)間培養(yǎng)，使孢子孵化，處于活化狀態(tài)，并恰好未形成菌絲體。4、單細(xì)胞(或單孢子)懸液的制備(1)目的：獲得單細(xì)胞(或單孢子)、均勻的懸液。(2)原因：一方面分散狀態(tài)的細(xì)胞可以均勻地接觸誘變劑，還可減少分離現(xiàn)象發(fā)生。另一方面又可避免長(zhǎng)出不純菌落。(3)方法：1)菌齡：對(duì)數(shù)期細(xì)胞、剛成熟的孢子或活化的孢子。2)菌懸液濃度：一般真菌孢子或酵母菌細(xì)胞懸浮液的濃度為106個(gè)/mL、放線菌或細(xì)菌的濃度為108個(gè)／mL左右。3)菌懸液的配制方法：離心洗滌前培養(yǎng)物，用冷生理鹽水或緩沖液制備菌懸液，放在盛有玻璃珠的三角瓶?jī)?nèi)振蕩10min，令其分散，用無(wú)菌脫脂棉或?yàn)V紙過(guò)濾。通過(guò)菌體計(jì)數(shù)，調(diào)整菌懸液的濃度供誘變處理。5、誘變處理(1)誘變劑種類(lèi)的選擇常用誘變劑有兩大類(lèi)：物理誘變劑和化學(xué)誘變劑。

常用的物理誘變劑：紫外線、x射線、γ射線(如Co60等)、等離子、快中子、α射線、β射線、超聲波等。常用的化學(xué)誘變劑：堿基類(lèi)似物、烷化劑、羥胺、吖定類(lèi)化合物等。(2)最適誘變劑量的選擇1)誘變劑劑量的表示方式a.UV的劑量指強(qiáng)度與作用時(shí)間的乘積。b.化學(xué)誘變劑常以在一定外界條件下誘變劑的濃度和作用時(shí)間的乘積來(lái)表示。c.在育種實(shí)踐中，常以殺菌率來(lái)作誘變劑的相對(duì)劑量。2)最適誘變劑量的確定a.確定依據(jù)誘變的最適劑量，應(yīng)該使所希望得到的突變株在存活群體中占有最大的比例。b.確定方法通過(guò)比較劑量—存活率曲線和劑量—誘變率曲線，找到某誘變劑的劑量—存活率—誘變率三者的最佳結(jié)合點(diǎn)，即為誘變劑的最適劑量。①劑量—存活率曲線以誘變劑的劑量為橫坐標(biāo)，以細(xì)胞存活率的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)繪制的曲線。②劑量—誘變率曲線以誘變劑的劑量為橫坐標(biāo)，以誘變后獲得的突變細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)繪制的曲線。

c.紫外誘變的方法①紫外燈應(yīng)先預(yù)熱20~30min②將10m1菌懸液放在直徑為9cm的培養(yǎng)皿中，液層厚度約為2mm，啟動(dòng)磁力攪拌器，使用15w功率紫外燈管，照射距離為30cm左右，照射時(shí)間以幾秒至數(shù)十分鐘為宜，具芽孢的菌株需處理10min左右。③設(shè)計(jì)一個(gè)照射不同時(shí)間梯度的實(shí)驗(yàn)，根據(jù)不同時(shí)間照射的死亡率，作出照射時(shí)間與死亡率的曲線，這樣就可以選擇適當(dāng)?shù)恼丈鋭┝?。?shí)驗(yàn)中避免光復(fù)活現(xiàn)象：實(shí)驗(yàn)時(shí)，為了避免光復(fù)活現(xiàn)象，處理過(guò)程應(yīng)在暗室的紅光下操作，處理完畢后，將盛菌懸液的器皿用黑布包起來(lái)培養(yǎng)，然后再進(jìn)行分離篩選。(3)誘變劑的處理方式1)單因子處理采用單一誘變劑處理出發(fā)菌株。2)復(fù)合因子處理指兩種以上誘變因子共同誘發(fā)菌體突變。①兩種或多種誘變劑先后使用。②同一種誘變劑的重復(fù)使用。③兩種或多種誘變劑的同時(shí)使用。(4)誘變劑的處理方法1)直接處理方法將菌懸液用物理、化學(xué)因子處理，然后涂平板分離突變株。2)生長(zhǎng)過(guò)程處理適用于誘變作用強(qiáng)的而殺菌率較低的誘變劑，或在分裂過(guò)程中只對(duì)DNA起作用的誘變劑，如NTG、LiCl、秋水仙堿等。①將誘變劑加入培養(yǎng)基涂平板。②先把培養(yǎng)基制成平板，將一定濃度的誘變劑和菌體加入平板。③搖瓶振蕩培養(yǎng)處理Ames實(shí)驗(yàn)利用細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)缺陷型的回復(fù)突變檢出環(huán)境或食品中是否存在化學(xué)致癌劑的一種簡(jiǎn)便有效方法。1、誘變的生物化學(xué)統(tǒng)一性任何能改變核酸結(jié)構(gòu)的因素，都可引起核酸生物學(xué)功能的改變

2、篩選簡(jiǎn)單模型研究高等生物的突變（癌癥）(1)化學(xué)物質(zhì)對(duì)核酸結(jié)構(gòu)的改變和對(duì)生物的三致作用(2)致突變因素，一般都有致突致癌致畸效應(yīng)（三致作用），反之亦然(3)對(duì)原核生物有效的因素，則對(duì)非細(xì)胞生物和真核生物也有效(4)能引起易鑒出的選擇性突變的因素，也能引起難以檢出的非選擇性突變(5)凡能引起負(fù)變的因素，也可引起正變(6)凡能引起回復(fù)突變的因素，一般也能引起正向突變3、Ames實(shí)驗(yàn)原理：根據(jù)誘變劑的共性原則，即：化學(xué)試劑對(duì)細(xì)菌的誘變率與其對(duì)動(dòng)物的致癌性成正比，利用細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)缺陷型的回復(fù)突變來(lái)檢測(cè)食品或環(huán)境中是否存在致癌劑。鼠傷寒沙門(mén)氏菌的組氨酸缺陷型(his-)菌株在基本培養(yǎng)基[-]的平板上不能生長(zhǎng)，如發(fā)生回復(fù)突變則能生長(zhǎng)。4、方法第三節(jié)基因重組和雜交育種基因重組：凡把兩個(gè)不同性狀個(gè)體內(nèi)的遺傳基因轉(zhuǎn)移到起，經(jīng)過(guò)遺傳分子間的重新組合，形成新遺傳型個(gè)體的方式，稱為基因重組或遺傳重組。雜交：兩個(gè)性狀不同的菌株或變種之間進(jìn)行細(xì)胞結(jié)合，遺傳物質(zhì)交換重新組合成新的性狀。一、原核生物的基因重組特點(diǎn)：（1）片段性（2）單向性（3）轉(zhuǎn)移機(jī)制獨(dú)特而多樣（一）轉(zhuǎn)化1、定義受體菌直接吸收了來(lái)自供體菌的DNA片段，通過(guò)交換，把它組合到自己的基因組中，從而獲得供體菌部分遺傳性狀的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)化后的受體菌，稱轉(zhuǎn)化子，供體菌的DNA片段稱為轉(zhuǎn)化因子。2、感受態(tài)（1）定義感受態(tài)即受體菌最易接收外源DNA片段并實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的生理狀態(tài)。（2）特點(diǎn)1）表示細(xì)胞具有攝取外源DNA的能力；2）自然轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞受感受態(tài)因子調(diào)節(jié)；

是調(diào)節(jié)感受態(tài)的一類(lèi)特異蛋白，它可以催化外來(lái)DNA片段的吸收或降解細(xì)胞表面某種成分，讓細(xì)胞表面的DNA受體顯露出來(lái)。它包括三種主要成分：與膜相關(guān)的DNA結(jié)合蛋白、細(xì)胞壁自溶素和幾種核酸酶。

3)是細(xì)胞群體在某個(gè)生長(zhǎng)階段的一種特性，大多與生長(zhǎng)周期有關(guān)。4)是反映細(xì)胞個(gè)體之間遺傳信息交流的一種程度。3、轉(zhuǎn)化機(jī)制（1）轉(zhuǎn)化發(fā)生的條件1)受體細(xì)胞處于感受態(tài)。2)受體細(xì)胞吸附的轉(zhuǎn)化因子，必須是雙鏈的DNA，且DNA分子的相對(duì)分子質(zhì)量不小于3×105

。轉(zhuǎn)化不需兩個(gè)細(xì)胞直接接觸（2）轉(zhuǎn)化的過(guò)程1)感受態(tài)的出現(xiàn)2)DNA的結(jié)合與進(jìn)入①G+②G-3)DNA的整合（重組）進(jìn)入細(xì)胞的外源DNA通過(guò)同源重組以置換的方式整合進(jìn)受體染色體DNA，經(jīng)復(fù)制和細(xì)胞分裂后形成重組體。（3）影響轉(zhuǎn)化效率的因素：1)受體細(xì)胞的感受態(tài)——決定轉(zhuǎn)化因子能否被吸收進(jìn)入受體細(xì)胞；2)受體細(xì)胞的限制酶系統(tǒng)和其他核酸酶——決定轉(zhuǎn)化因子在整合前是否被分解；3)受體和供體染色體的同源性——決定轉(zhuǎn)化因子的整合。

4、轉(zhuǎn)染(1)定義：把噬菌體或其他病毒DNA（RNA）提取出來(lái)，用它去感染感受態(tài)的宿主細(xì)胞，并產(chǎn)生正常噬菌體或病毒后代。(2)轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)化：作為轉(zhuǎn)染的病毒核酸，并不是作為供體基因的功能，被感染的宿主也決不是能形成轉(zhuǎn)化子的受體菌。（二）轉(zhuǎn)導(dǎo)1、定義：通過(guò)缺陷噬菌體的媒介，把供體細(xì)胞的小片段DNA攜帶到受體細(xì)胞中，通過(guò)交換與整合，使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)。由轉(zhuǎn)導(dǎo)作用而獲得部分新性狀的重組細(xì)胞，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)子。2、轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程（種類(lèi)）(1)普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)1）定義：通過(guò)極少數(shù)完全缺陷噬菌體對(duì)供體菌基因組上任何小片段DNA進(jìn)行“誤包”，而將其遺傳性狀傳遞給受體菌的現(xiàn)象，稱為普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)。2）普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)中外源DNA的三種后果①進(jìn)入受體的外源DNA通過(guò)與細(xì)胞染色體的重組交換而形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子——完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)。②流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)③外源DNA被降解，轉(zhuǎn)導(dǎo)失敗，在選擇平板上無(wú)菌落形成①進(jìn)入受體的外源DNA通過(guò)與細(xì)胞染色體的重組交換而形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子——完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)。a.定義：經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)而獲得了供體菌DNA片段的受體菌，導(dǎo)入的外源DNA若與受體細(xì)胞核染色體組上的同源區(qū)段配對(duì)，再經(jīng)過(guò)雙交換而整合到染色體組上，從而使后者成為一個(gè)遺傳性狀穩(wěn)定的重組體的現(xiàn)象稱為完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)。形成的轉(zhuǎn)導(dǎo)子稱為普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)子。②流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)

a.定義：經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)而獲得了供體菌DNA片段的受體菌，如果外源DNA在其內(nèi)既不進(jìn)行交換、整合和復(fù)制，也不迅速消失，而僅進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯和性狀表達(dá)，這種現(xiàn)象就稱流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)。b.過(guò)程(2)局限轉(zhuǎn)導(dǎo)1）定義：指通過(guò)部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因攜帶到受體菌中，并與后者的基因組整合、重組，形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子的現(xiàn)象。2）特點(diǎn)①只能轉(zhuǎn)導(dǎo)供體菌的個(gè)別特定基因；②該特定基因由部分缺陷的噬菌體攜帶；③缺陷噬菌體是由于其在形成過(guò)程中所發(fā)生的低頻率“誤切”，或由于雙重溶源菌的裂解而形成；④局限轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的產(chǎn)生要通過(guò)UV等因素對(duì)溶源菌的誘導(dǎo)并引起裂解后才產(chǎn)生。3）局限轉(zhuǎn)導(dǎo)類(lèi)型：a.

低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)：指通過(guò)一般溶源菌釋放的噬菌體所進(jìn)行的轉(zhuǎn)導(dǎo)，因其只能形成極少數(shù)（10-4-10-6）轉(zhuǎn)導(dǎo)子，故稱低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)。b.

高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)：指通過(guò)雙重溶源菌所產(chǎn)生的裂解物所進(jìn)行的轉(zhuǎn)導(dǎo)，因其含有等量的正常噬菌體和缺陷噬菌體，具有高頻率的轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，故稱高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)。（3）局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)與普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要區(qū)別：1）局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)中，被轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因共價(jià)地與噬菌體DNA連接，與噬菌體DNA一起進(jìn)行復(fù)制、包裝以及被導(dǎo)入受體細(xì)胞中。而完全轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝的可能全部是宿主菌的基因；2）局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒攜帶特定的染色體片段并將固定的個(gè)別基因?qū)胧荏w，故稱為局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)。3、轉(zhuǎn)導(dǎo)和溶源轉(zhuǎn)變（1）溶源轉(zhuǎn)變：當(dāng)正常的溫和噬菌體感染其宿主而使其發(fā)生溶源化時(shí)，因噬菌體的基因整合到宿主的核基因組上，而使后者獲得了除免疫性以外的新性狀的現(xiàn)象，稱為溶源轉(zhuǎn)變。（2）溶源轉(zhuǎn)變與轉(zhuǎn)導(dǎo)有著本質(zhì)的不同。首先，這種溫和噬菌體并不攜帶任何來(lái)自供體菌的外源基因，使宿主帶來(lái)新性狀的正是噬菌體本身的基因；其次，這種溫和噬菌體是完整的，而不是缺陷的；第三，獲得新性狀的是溶源化的宿主細(xì)胞，而不是什么轉(zhuǎn)導(dǎo)子；第四，獲得的性狀可隨噬菌體的消失而同時(shí)消失。

（三）接合通過(guò)細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸而產(chǎn)生的遺傳信息的轉(zhuǎn)移和重組過(guò)程。1946年，JoshuaLederberg等認(rèn)為細(xì)菌的轉(zhuǎn)化有些與高等動(dòng)物、植物的接合相類(lèi)似。因此他們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)實(shí)驗(yàn)來(lái)觀察細(xì)菌是否存在接合現(xiàn)象。

中間平板上長(zhǎng)出的原養(yǎng)型菌落是兩菌株之間發(fā)生了遺傳交換和重組所致。用E.coliK12的兩類(lèi)營(yíng)養(yǎng)缺陷型作為實(shí)驗(yàn)材料：E.coliK12的蘇氨酸（thr－）、亮氨酸（leu－）的營(yíng)養(yǎng)缺陷型和E.coliK12的生物素（bio－）、甲硫氨酸（met－）的營(yíng)養(yǎng)缺陷型。為了簡(jiǎn)化起見(jiàn)，這里分別用ABCD來(lái)表示這兩種營(yíng)養(yǎng)缺陷型所需的共同的四種生長(zhǎng)因素。由于這兩種營(yíng)養(yǎng)缺陷型通過(guò)接合，相互進(jìn)行遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移和重組，從而使雙方的遺傳特性發(fā)生改變。

為了排除這是由于轉(zhuǎn)化的可能性，有人設(shè)計(jì)了U形管實(shí)驗(yàn)。

經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)，從U形管的兩端取出的細(xì)菌都不能在基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。U形管實(shí)驗(yàn)充分說(shuō)明了不讓細(xì)菌接觸，遺傳物質(zhì)就無(wú)法轉(zhuǎn)移，因而否定了這是轉(zhuǎn)化的結(jié)果。

后來(lái)，隨著電子顯微鏡的廣泛應(yīng)用，科學(xué)工作者得到了E.coli接合的電子顯微鏡攝影圖像，從而更進(jìn)一步證實(shí)了細(xì)菌接合的客觀存在。

從電子顯微攝影圖像上可以看到E.coli的接合與性纖毛有關(guān)。性纖毛是中空的，遺傳物質(zhì)可以通過(guò)性纖毛進(jìn)行轉(zhuǎn)移。不久又發(fā)現(xiàn)能進(jìn)行結(jié)合的E.coli有♀和♂之分，而這些又取決于是否有F因子的存在。

凡有F因子的菌株，其細(xì)胞表面就產(chǎn)生1～4條中空而細(xì)長(zhǎng)的絲狀物，即性纖毛。有F因子的為♂性，即供體菌株，無(wú)F因子的為♀，即為受體菌株。

胞質(zhì)橋↑F因子和接合

F因子又稱為致育因子,這是一種存在于細(xì)菌染色體外的小型的獨(dú)立的環(huán)狀DNA單位，它具有控制本身復(fù)制和轉(zhuǎn)移的到其它細(xì)胞中去的能力。此外，在其上還帶有一些對(duì)生命活動(dòng)來(lái)說(shuō)不是很重要的基因，能編碼40～60種蛋白質(zhì)。一般每個(gè)細(xì)胞具有1～4個(gè)F因子。

F因子既可以脫離染色體在細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立存在，也可插入（整合）到染色體上F因子的四種細(xì)胞形式

a）F-菌株(“雌性”菌株)，不含F(xiàn)因子，沒(méi)有性菌毛，但可以通過(guò)接合作用接收F因子而變成F+菌株；b）F+菌株(“雄性”菌株)，F(xiàn)因子獨(dú)立存在，細(xì)胞表面有性菌毛。c）Hfr菌株，F(xiàn)因子插入到染色體DNA上，細(xì)胞表面有性菌毛。d）F′菌株，Hfr菌株內(nèi)的F因子因不正常切割而脫離染色體時(shí)，形成游離的但攜帶一小段染色體基因的F因子，特稱為F′因子。細(xì)胞表面同樣有性菌毛。1）F+×F-雜交理化因子的處理可將F因子消除而使F+菌株變成F-菌株a）F+細(xì)菌通過(guò)性毛與F-細(xì)菌接觸并發(fā)生相互作用；b）F+細(xì)菌的F因子出現(xiàn)缺口，雙鏈之一被切斷，從斷端轉(zhuǎn)移F因子的一條鏈到F-細(xì)菌中。c）F因子的一條鏈一進(jìn)入F-細(xì)菌中，就在F-細(xì)菌中復(fù)制新的F因子。d）復(fù)制完成后，F(xiàn)-細(xì)菌變成F+

，同時(shí)原有F+細(xì)胞也完成F因子另一條鏈的復(fù)制，所以轉(zhuǎn)移是F+的拷貝。所以最終雜交的結(jié)果是F-細(xì)菌變成F+細(xì)菌，而原有的F+細(xì)菌則不變。Hfr菌株的F因子插入到染色體DNA上，因此只要發(fā)生接合轉(zhuǎn)移過(guò)程，就可以把部分甚至全部細(xì)菌染色體傳遞給F-細(xì)胞并發(fā)生重組，由此而得名為高頻重組菌株。2）Hfr×F-Hfr菌株仍然保持著F+細(xì)胞的特征，具有F性菌毛，并象F+一樣與F-細(xì)胞進(jìn)行接合。所不同的是，當(dāng)OriT序列被缺刻螺旋酶識(shí)別而產(chǎn)生缺口后，F(xiàn)因子的先導(dǎo)區(qū)(leadingregion)結(jié)合著染色體DNA向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移。F因子除先導(dǎo)區(qū)以外，其余絕大部分是處于轉(zhuǎn)移染色體的末端，由于轉(zhuǎn)移過(guò)程常被中斷，因此F因子不易轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞中。Hfr×F-雜交后的受體細(xì)胞(或接合子)大多數(shù)仍然是F-。染色體上越靠近F因子的先導(dǎo)區(qū)的基因，進(jìn)入的機(jī)會(huì)就越多，在F-中出現(xiàn)重組子的的時(shí)間就越早，頻率高。中斷雜交（interruptedmating）技術(shù)利用Hfr×F-的接合過(guò)程，在不同時(shí)間取樣，并把樣品猛烈攪拌以分散接合中的細(xì)菌，然后分析受體細(xì)菌基因型，以時(shí)間(分鐘)為單位繪制遺傳圖譜，該圖譜是細(xì)菌染色體上基因順序的直接反映。大腸桿菌基因組很大（全部轉(zhuǎn)移需要100分鐘），其遺傳圖譜須用多株F因子整合在不同位置的Hfr菌才能完成3）F′×F-雜交Hfr菌株內(nèi)的F因子因不正常切割而脫離染色體時(shí)，形成游離的但攜帶一小段細(xì)菌染色體基因的F因子，特稱為F′因子。F′×F-與F+×F-的不同：供體的部分染色體基因隨F′一起轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞a）與染色體發(fā)生重組；b）繼續(xù)存在于F′因子上（四）原生質(zhì)體融合1、定義通過(guò)人為方法，使遺傳性狀不同的兩細(xì)胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合，并產(chǎn)生重組子的過(guò)程，又稱細(xì)胞融合。2、原生質(zhì)體融合的主要步驟（1）原生質(zhì)體制備：親本菌株須：①具有良好生產(chǎn)性狀；②具有一些穩(wěn)定的明顯的遺傳標(biāo)記。離心收集對(duì)數(shù)后期菌體，破壁，使用滲透壓穩(wěn)定劑（甘露醇、山梨醇、蔗糖、氯化鉀、氯化鈉等）進(jìn)行保護(hù)，離心收集原生質(zhì)體。（2）原生質(zhì)體融合：加入促融合劑-聚乙二醇（PEG）及Ca2+、Mg2+，使原生質(zhì)體表面形成電極性，相互易于吸引，形成聚集物。UV、電場(chǎng)、激光等技術(shù)可應(yīng)用。（3）再生成正常細(xì)胞：融合后的原生質(zhì)體不具細(xì)胞壁，不能在普通培養(yǎng)基上增殖，無(wú)法表現(xiàn)，必須使其重新形成壁。再生培養(yǎng)基必須具有與原生質(zhì)體體內(nèi)相同滲透壓，常用含Ca2+、Mg2+及滲透壓穩(wěn)定劑的完全培養(yǎng)基。（4）檢出融合細(xì)胞；通過(guò)選擇性培養(yǎng)基（5）篩選優(yōu)良性狀的融合子。進(jìn)行生物測(cè)定一、菌種的退化與復(fù)壯（一