不同磷源條件下利瑪原甲藻的生長及堿性磷酸酶活性

不同磷源條件下利瑪原甲藻的生長及堿性磷酸酶活性

磷是海洋、湖泊和其他水生生態(tài)系統(tǒng)初級生產(chǎn)力的重要限制因素，對藻類的生長起著重要作用。由于可直接吸收和利用藻類，而無機磷是藻類中最重要的磷來源。然而，如果沒有無產(chǎn)階級磷，浮游生物可以通過堿性磷酸酶維持藻類的生長。利瑪原甲藻屬甲藻門(Pyrrophyta)原甲藻科(ProrocentraceaeStein)原甲藻屬(ProrocentrumEhrenberg),為海洋底棲甲藻之一,是最常見的腹瀉性貝毒(diarrheticshellfishpoison,DSP)產(chǎn)毒藻,被認為是DSP標準的可靠來源.DSP是一類結構獨特的多醚類化合物,其成分主要為大田軟海綿酸(okadaicacid,OA)和鰭藻毒素(dinophysistoxin,DTX).DSP是蛋白磷酸酶1、2A的特異抑制劑,同時又是促癌劑,可在貽貝肝、脾中積累,從而引起食用者腹瀉性中毒.盡管到目前為止,尚未見有DSP中毒引起人類死亡的報道.但近年來的調查顯示,世界范圍內DSP污染和中毒事件非常廣泛,致病率極高,幾乎所有發(fā)達國家都在本國海域發(fā)現(xiàn)和檢出此類毒素.在我國,遼東灣、膠州灣、萊州灣、秦皇島、福建等海域及天津、煙臺、連云港、舟山、深圳、香港等沿海城市均發(fā)現(xiàn)DSP,黃海、渤海和南海水域則發(fā)現(xiàn)有DSP產(chǎn)毒藻.為揭示和闡明底棲甲藻的磷營養(yǎng)利用機制,明確利瑪原甲藻的產(chǎn)毒機制,本研究觀察了不同磷源條件下利瑪原甲藻的生長情況,探討了堿性磷酸酶在營養(yǎng)鹽利用方面的作用,比較和分析了不同營養(yǎng)鹽條件下DSP的合成情況.1材料和方法1.1ccmp簡介利瑪原甲藻(Prorocentrumlima),由美國CCMP(Provasoli-GuillardNationalCenterforCultureofMarinePhytoplankton)提供,編號2579.1.2ndsp4.3.3DiarrheticShellfishPoison(DSP)QuickTestKit(PanapharmLaboratoriesCo.,Ltd.,Japan)購自北京必發(fā)分析系統(tǒng)銷售有限公司.1.3實驗方法1.3.1生長曲線的測定藻種培養(yǎng)選用f/2培養(yǎng)基改良配方,實驗組以NaH2PO4、β-甘油磷酸鈉或者ATP作為唯一磷源,其他元素按照f/2培養(yǎng)液配方添加.設置5個磷濃度:0.5、1、2、5和10μmol/L.取對數(shù)生長期利瑪原甲藻接種于培養(yǎng)基中,接種密度約為1.0×106cells/L.置于溫度(22±1)℃、光照強度4000lx、光暗循環(huán)為L∶D=12h∶12h的人工氣候箱中進行培養(yǎng).實驗每組設置3個平行,隔天于固定時間取樣,在倒置顯微鏡下觀察、計數(shù),繪制藻生長曲線,計算比生長速率(μ)、最大比生長速率(μmax)和半飽和常數(shù)(KS).最大比生長速率(μmax)和半飽和常數(shù)(KS)的計算采用Monod方程.1.3.2堿性磷酸酶活性測定取藻液30mL,以10000r/min離心15min,棄去上清液,加入1mLTris-鹽酸緩沖液(pH=8.8),搖勻,放入含冰水混合物的燒杯中.細胞經(jīng)超聲破碎后,置于4℃冰箱中過夜.然后12000r/min離心10min,保留上清液,即為堿性磷酸酶的粗提液.堿性磷酸酶活性的測定參照文獻進行.取0.1mL酶粗提液加入3.0mL復合基質液,在37℃水浴中保溫30min后,立即加入0.5%鐵氰化鉀2.1mL,迅速混勻,靜置10min,在510nm波長下測D值,用Tris-鹽酸緩沖液(pH=8.8)作為空白對照.活力單位定義為:1mL待測酶液1h釋放1μg對硝基苯酚為一個活力單位(U).1.3.3藻細胞抗氧化活性測定取處于平臺期的利瑪原甲藻培養(yǎng)物10mL,3500r/min離心5min收集藻細胞.棄上清,藻細胞沉淀煮沸5min.在收集有藻細胞的離心管中加入500μL90%的甲醇和少量二氧化硅,在旋渦混合器上振蕩,利用二氧化硅使細胞破壁,7500r/min離心5min,取上清液,加入500μL雙蒸水,混合均勻后進行毒素測定.DSP的檢測使用DiarrheticShellfishPoisonQuickTestKit,該試劑盒采用抗OA的單克隆抗體,通過酶聯(lián)免疫分析方法對OA進行特異性檢測.測定按照試劑盒說明進行.2結果與分析2.1利瑪原甲藻生長速率隨組織質量的變化在相同的起始密度下(1.0×106cells/L),以3種不同形態(tài)的磷鹽分別作為磷源時利瑪原甲藻的生長狀況如圖1所示.NaH2PO4作為唯一磷源時,各濃度條件下的利瑪原甲藻在接種后10d均開始快速分裂,進入對數(shù)生長期,藻細胞密度明顯增大,第46～49d陸續(xù)進入生長穩(wěn)定期,比生長速率和最大生物量隨著NaH2PO4濃度的增加逐漸升高.0.5μmol/L時比生長速率最小,為0.051d-1;最大生物量也最低,為1.2×107cells/L.10μmol/L時比生長速率最大,達0.061d-1;最大生物量也最大,為1.6×107cells/L.以β-甘油磷酸鈉為磷源時,各濃度組在接種7d后進入對數(shù)生長期,細胞數(shù)目明顯增多,第46～52d陸續(xù)進入生長穩(wěn)定期.隨著β-甘油磷酸鈉濃度的增加,利瑪原甲藻比生長速率有所降低,但最大藻細胞密度逐漸升高.0.5μmol/L時比生長速率最大,為0.067d-1;最大生物量最低,為1.1×107cells/L.10μmol/L時比生長速率最小,為0.051d-1;最大生物量最大,為1.6×107cells/L.以ATP為磷源時,接種10～13d后各濃度下利瑪原甲藻藻密度開始增高,第49d左右各濃度組進入平臺期,比生長速率和最大生物量隨著ATP濃度的增加逐漸升高.0.5μmol/L時比生長速率最小,為0.047d-1;最大生物量也最低,為1.3×107cells/L.10μmol/L時比生長速率最大,達0.054d-1;最大生物量最大,為1.9×107cells/L.綜合分析,NaH2PO4最大比生長速率最大,為0.059d-1;β-甘油磷酸鈉最大比生長速率最小,為0.048d-1.最大生物量均值ATP組明顯高于NaH2PO4和β-甘油磷酸鈉組(見表1和表2),為1.6×107cells/L(p<0.05).2.2nah2po4和atp對瑪原甲藻堿性磷酸酶活性的影響圖2為不同磷源條件下利瑪原甲藻堿性磷酸酶活力的變化情況.可以看出,以NaH2PO4作為唯一磷源時,堿性磷酸酶活性隨著利瑪原甲藻的生長呈逐漸增高后降低的趨勢.NaH2PO4濃度<2μmol/L時,堿性磷酸酶活性最大值隨著NaH2PO4濃度的增高而降低,而當>2μmol/L時,堿性磷酸酶活性變化不大,但均比較低.以β-甘油磷酸鈉為磷源時,在實驗濃度范圍內堿性磷酸酶的活性都比較低.ATP為唯一磷源時,堿性磷酸酶活性整體上呈先升高后降低的趨勢,隨著ATP濃度的增高逐漸增強.2.3不同ph對藻細胞毒素含量的影響從圖3和圖4中可以看出,無論是OA總含量還是單位藻細胞OA含量,3組之間均存在顯著性差異,β-甘油磷酸鈉組最高,NaH2PO4次之,ATP組最低(p<0.05).NaH2PO4和β-甘油磷酸鈉組單位藻細胞毒素含量隨磷鹽濃度的增加有所下降,ATP組單位藻細胞毒素含量則差別不大.3對磷源利用的效果磷是藻類生長的主要限制因子之一,在海洋環(huán)境中對初級生產(chǎn)力有著重要的調控作用.在自然海水中除了存在無機的磷酸鹽外,還有大量的溶解有機磷.不少研究表明,大部分藻類既可以直接吸收利用無機磷酸鹽,又可以直接或間接地利用多種溶解有機磷.而且,藻類對不同形態(tài)磷的利用特性又隨著藻種類的不同而有著明顯的區(qū)別.本研究選取產(chǎn)毒海洋底棲甲藻——利瑪原甲藻為對象,探討了不同形態(tài)和濃度的磷鹽對利瑪原甲藻產(chǎn)毒和生長的影響,并分析了藻體中堿性磷酸酶的活性,以期為進一步明確利瑪原甲藻的營養(yǎng)鹽利用特征和產(chǎn)毒規(guī)律提供參考.研究發(fā)現(xiàn),不同磷源都能促進利瑪原甲藻的生長.在經(jīng)歷較短的潛伏期后,進入對數(shù)生長期,藻細胞密度都有顯著增加,并保持了較長時間的生長穩(wěn)定期.說明利瑪原甲藻可以利用NaH2PO4、β-甘油磷酸鈉和ATP維持生長,這與浮游藻類的情況類似.實驗還發(fā)現(xiàn),在磷濃度比較低的條件下,利瑪原甲藻仍能保持良好的生長,表明利瑪原甲藻對磷的適應濃度范圍較寬.最大比生長速率表示細胞最大分裂速度的大小,可考察細胞的生長分裂能力.KS反應則可反映藻類對某種營養(yǎng)鹽的適應程度.μmax越大,KS越小,說明該營養(yǎng)鹽越適合藻類的生長.本研究發(fā)現(xiàn),實驗組最大比生長速率(μmax)從大到小的順序為:NaH2PO4組>ATP組>β-甘油磷酸鈉組,NaH2PO4組和ATP組相差不大,β-甘油磷酸鈉組較低.半飽和常數(shù)(KS)從小到大排序為:ATP組<NaH2PO4組<β-甘油磷酸鈉組.表明利瑪原甲藻對3種磷源的利用情況不同.NaH2PO4和ATP對利瑪原甲藻的營養(yǎng)價值基本相等,β-甘油磷酸鈉的營養(yǎng)價值則比較低.這與李英等對東海原甲藻的研究結果基本相似.對東海原甲藻而言,NaH2PO4、ATP、D-葡萄糖-6-磷酸鈉和甘油磷酸鈉中,甘油磷酸鈉的營養(yǎng)價值最低,對最大生物量的貢獻也最小.但張民等研究發(fā)現(xiàn),甘油磷酸鈉比KH2PO4更有利于對數(shù)期銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)的生長.這可能是不同藻種對磷的利用方式不同所致.研究同時發(fā)現(xiàn),不同磷鹽條件下藻類生長所能達到的最大藻密度不同.ATP組明顯大于NaH2PO4組和β-甘油磷酸鈉組(p<0.05),NaH2PO4組和β-甘油磷酸鈉組之間差別不明顯;實驗組中最大生物量均隨磷鹽濃度的升高而升高,ATP比NaH2PO4和β-甘油磷酸鈉更有利于維持利瑪原甲藻的生長.藻類必須從外界攝取磷酸鹽來滿足生長的需要,所以藻體內通常具有一套應急的磷供應體系以及相應的調節(jié)過程,以適應環(huán)境的變化.當可利用的磷酸鹽數(shù)量受到限制時,有機體為了存活,就必須有一種水解酶,能夠水解磷酸酯提供的磷酸基團,而堿性磷酸酶就是其中的關鍵酶.在缺磷脅迫下,一般來說,最直接的方法就是分解體內的有機磷,釋放磷酸根來滿足藻生長的需要,在分解有機磷的過程中堿性磷酸酶起著關鍵性的作用.堿性磷酸酶是一種最佳活性出現(xiàn)在堿性條件下的正磷酸單酯水解酶.已有的研究表明,堿性磷酸酶在浮游植物吸收利用有機溶解磷(dissolvedorganicphosphorus,DOP)的過程中起重要作用,水體中堿性磷酸酶活性作為磷限制參數(shù)正逐步得到應用.本研究發(fā)現(xiàn),NaH2PO4濃度<2μmol/L時,利瑪原甲藻的堿性磷酸酶活性比較高,隨NaH2PO4濃度的增高而降低;>2μmol/L時,堿性磷酸酶活性變化不大,都處于較低的水平.這與報道中浮游藻類的情況相似.Yamaguchi等指出,正磷酸鹽的濃度低于0.2～0.25μmol/L時,Kareniamikimotoi、Skeletonemacostatum和Helerosigmaakashiwo均會激活堿性磷酸酶的活性.王艷等研究發(fā)現(xiàn),缺磷脅迫會導致球形棕囊藻堿性磷酸酶活性增強,且酶活力隨磷限制程度的增加而增高.與之比較,以β-甘油磷酸鈉為磷源時,在實驗濃度范圍內堿性磷酸酶的活性均比較低,各濃度組之間并無明顯差異.ATP作為唯一磷源時,堿性磷酸酶的活性隨ATP濃度的增高而增高.洪華生等提出藻類可能存在2條DOP利用途徑,一條是直接被藻類吸收利用,另一條是被諸如堿性磷酸酶等水解后吸收.實驗中ATP組利瑪原甲藻表現(xiàn)出較高的堿性磷酸酶活性,并隨ATP濃度的增高而顯著升高,提示對于分子量相對較大的ATP不能被藻細胞直接利用,需要經(jīng)堿性磷酸酶水解轉化成無機磷后才能被吸收利用.有機磷可通過誘導作用提高堿性磷酸酶的活性,因此造成其活性隨ATP濃度的增加而增加.由于β-甘油磷酸鈉組堿性磷酸酶活性始終保持較低的水平,因此推測,與浮游藻類Amphidiniumsp.和Isochrysisgalbana類似,利瑪原甲藻可以不通過酶解作用直接吸收利用β-甘油磷酸鈉.有研究證實,某些底棲甲藻能直接吸收水生生物分泌的DOP,或者重新利用其自身新陳代謝的DOP作為營養(yǎng)源.但是唐洪杰等對中肋骨條藻等5種藻的研究中證實,堿性磷酸酶活性隨底物濃度的增加而升高,并在一定的濃度范圍內表現(xiàn)出線性關系,但當?shù)孜餄舛仍黾拥揭欢ǔ潭葧r,堿性磷酸酶活性不再隨底物濃度的增加而升高,趨于一個極值,此時濃度為酶的底物飽和濃度.本實驗中ATP濃度可能并未達到堿性磷酸酶的最大飽和濃度,因此酶活性隨著ATP的濃度的增高而升高.由于OA的合成主要在S期和G2期,毒素水平在生長穩(wěn)定期達到最大.因此,本研究測定了不同磷鹽條件下生長穩(wěn)定期毒素的水平,以了解利瑪原甲藻在不同磷鹽條件下毒素的合成情況.結果顯示,不同磷鹽條件下毒素的生成有明顯差異,其中以β-甘油磷酸鈉組最高,NaH2PO4組次之,ATP組毒素水平最低(p<0.05).與不同磷鹽條件下利瑪原甲藻的生長狀況相對照,可以發(fā)現(xiàn),以NaH2PO4和ATP作為磷源時,利瑪原甲藻的生長情況較好,產(chǎn)毒較少;以β-甘油磷酸鈉作為磷源時,藻的生長相對較差,毒素含量顯著增加.這與McLachlan等的研究結果相似.他們認為,利瑪原甲藻的生長、細胞分裂速度和毒素的產(chǎn)生受溫度、光照和