基于rapd技術的18個三色堇自交系的遺傳多樣性分析

基于rapd技術的18個三色堇自交系的遺傳多樣性分析

三色堇，又名蝴蝶花和鬼臉花，是早春的一種重要花卉。目前三色堇品種十分繁多,各品種類群間的遺傳關系十分復雜,要進一步培育新品種,弄清各品種類群間的遺傳關系是十分必要的。傳統(tǒng)上常通過外部形態(tài)特征來研究品種間的遺傳關系,但形態(tài)特征易受環(huán)境的影響而使結果出現(xiàn)偏差。RAPD(randomamplifiedpolymorphicDNA),即隨機擴增多態(tài)性DNA技術,能從DNA水平上分析不同個體之間的差異,不受栽培環(huán)境等因素的影響,目前已在園林植物的親緣關系研究方面有了一些應用。在堇菜屬RAPD研究方面,Lee用RAPD技術標記了韓國堇菜屬的3個亞屬,Oh曾用RAPD技術來區(qū)分堇菜屬中的不同種;但用RAPD研究不同三色堇品種或自交系間的遺傳關系則尚未見報道?；诜肿訕擞浀倪z傳距離用于雜種優(yōu)勢的預測在園藝作物上已有了較多的應用。本試驗擬采用RAPD技術,研究18個三色堇自交系的遺傳關系,為雜交新品種的培育提供必要的遺傳資料。同時研究三色堇RAPD遺傳距離與多個觀賞性狀的雜種優(yōu)勢、性狀值和配合力之間的相關關系,以期為三色堇雜種優(yōu)勢預測提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1交系的主要特點RAPD擴增試驗用的三色堇(Violawittrockiana)18份自交系均由本實驗室2000~2004年自交得到,其編號、來源與主要觀賞特點見表1。田間試驗選用其中5個性狀已比較穩(wěn)定的F4或F5代自交系3、8、9、12、18,來源分別是歐洲(3、8、9)、中國(12)與美國(18),具有一定的代表性。1.2調查與統(tǒng)計方法采用Griffing雙列雜交方法2進行雜交試驗,自交系于2004年3月雜交得到F1代種子,2004年9月將親本與F1播種于穴盤,10月中旬定植于直徑17cm的瓦盆,隨機區(qū)組設計,3次重復。2005年3月16日(盛花期)進行10個性狀的測量與統(tǒng)計。這10個性狀分別是:花徑,以花心為中心,分別測花的橫徑與縱徑,取二者平均值;花數(shù),每植株所具有已開放的花朵總數(shù);花葶長,從花葶基部到花朵基部的長度;分枝數(shù),每植株所具有的長度大于5cm的分枝總數(shù);株高,自植株基部至頂端的自然高度;株幅,植株最寬幅度與最窄幅度的平均值;高/幅,即株高與株幅之比;葉型指數(shù),葉長與葉寬之比;開花指數(shù),由公式:花數(shù)×(花徑/株幅)2計算而來;葉面積,由橢圓葉片計算公式:(1/4)π(葉長×葉寬)計算而來。1.3pcr反應動力學三色堇總DNA提取參照項艷等的方法。RAPD反應在PTC-100基因擴增儀上進行。所用引物為Operon、Sangon及Bioasia公司產(chǎn)品,均為10堿基隨機引物。擴增反應體系為:10mmol·L-1Tris-HCl(pH9.0),50mmol·L-1KCl,每種0.2mmol·L-1dNTP,2.5mmol·L-1MgCl2,0.4μmol·L-1引物,40ng模板DNA,1.2UTaqDNA聚合酶(大連寶生),反應體積為20μL。擴增反應程序為:94℃預變性2min,然后按程序:94℃30s,36℃30s,72℃1.5min擴增40個循環(huán),最后在72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物在1.4%瓊脂糖凝膠中電泳1.5~2.0h,電泳液為1×TAE,在凝膠中加入0.5μg·mL-1EB。電泳后在紫外燈下觀察照相。1.4rapd擴增回復突變試驗pcrRAPD擴增譜帶按有(1)和無(0)記錄,根據(jù)Nei相似系數(shù)計算任意兩樣品間的相似系數(shù)F=2NXY/(NX+NY),NXY為品種X和Y經(jīng)RAPD擴增反應分子量相同的譜帶總和,NX、NY分別代表品種X、品種Y經(jīng)RAPD擴增反應的譜帶總數(shù),遺傳距離GD=1-F,再根據(jù)遺傳距離利用UPGMA法構建遺傳聚類圖,bootstrap自展500次,計算運用FREETREE軟件進行。雙列雜交資料按劉來福等的方法進行方差分析,并估算一般配合力與特殊配合力效應值。雜種優(yōu)勢根據(jù)下列公式計算:中親優(yōu)勢HP=F1/MP-1;超親優(yōu)勢MP=F1/BP-1。其中F1為F1代雜種性狀值,MP為中親值,且MP=(P1+P2)/2,P1、P2分別為親本1與2的性狀值,BP為優(yōu)親值。用SAS軟件計算RAPD遺傳距離與雜種表型值、雜種優(yōu)勢和特殊配合力的相關系數(shù)。2結果與分析2.1rapd擴增圖譜的建立及聚類分析21個引物共擴增出167條帶,多態(tài)性帶127條,多態(tài)性比例為76.05%,說明不同的自交系間有豐富的遺傳多樣性。引物與基因組DNA隨機結合,最多擴增出13條帶,最少有2條帶,21個引物平均擴增的條帶數(shù)為7.95,擴增產(chǎn)物的分子量集中在0.2~2.0kb之間。圖1是引物M14的RAPD擴增圖譜。根據(jù)Nei的計算公式,計算出18個自交系間的遺傳距離矩陣,其中自交系間最大的遺傳距離是0.32,最小的僅有0.02,說明這些自交系間的遺傳差異變化范圍較大。根據(jù)遺傳距離值,用系統(tǒng)聚類法對18個自交系進行聚類分析,得到UPGMA樹狀聚類圖(圖2)。從圖中可以看出,18個自交系可以分為5大類,自交系1、14較為特殊,是與其它材料有明顯區(qū)別的小花類型,分別列為一類,且自交系1得到了100%的bootstrap自展值支持,說明這一分類是相當可靠的;C類群基本都由來自歐洲的品系組成,而D類群則由來自美國的品系組成,但它們的bootstrap值都不高;自交系3與13單獨聚為一類,但未得到高度的bootstrap值支持。從自交系的自交來源來看,來自同一原始材料的自交系往往聚在一起,而且有高的自展值支持,如自交系6和7,自交系10和11,自交系15、16和17,說明RAPD在鑒別三色堇的親緣關系時是比較可靠的。2.2營養(yǎng)性狀表現(xiàn)為10個性狀的雜種優(yōu)勢值見表2?；ú啃誀钪?花徑各雜交組合均呈正向優(yōu)勢,其中組合12×18雜種優(yōu)勢值最大,優(yōu)勢最為顯著,其次8×12,9×18也有較大的優(yōu)勢,而3×8、3×12的優(yōu)勢則較小;花數(shù)從總體來看,雜種花數(shù)相對于優(yōu)親是下降的,但不同組合雜交優(yōu)勢表現(xiàn)差異很大,如12×18高達1.10(MP),顯示了強烈的優(yōu)勢,而3×12則為-0.23,有較強的負向優(yōu)勢;花瓣厚多數(shù)雜交組合呈正值,表現(xiàn)出一定的雜種優(yōu)勢;開花指數(shù)多數(shù)雜交組合呈負值,但組合8×12、12×18有較大的優(yōu)勢,說明這兩個組合的觀賞性有較大的提高。營養(yǎng)性狀中,株幅的中親優(yōu)勢均為正值,且優(yōu)勢較大,但具有親本12的雜交組合其超親優(yōu)勢較小或為負值,如3×12,8×12,是因為自交系12本身具有較大的株幅;株高的超親優(yōu)勢很小,說明雜種后代株高趨向高親。不同雜交組合葉面積的雜種優(yōu)勢一般較小或為微弱負值,而分枝數(shù)則普遍有大的優(yōu)勢。總體來看,多數(shù)性狀都有正向的雜種優(yōu)勢,而且株幅、分枝數(shù)等營養(yǎng)性狀都有較大的優(yōu)勢,表明在三色堇的雜種后代中雜種優(yōu)勢是一個較為普遍的現(xiàn)象,這與齊鳴的研究結果類似。雜交組合8×12、12×18在花徑、花數(shù)、開花指數(shù)、花瓣厚等主要觀賞性狀上都有較大正向優(yōu)勢,可作為優(yōu)良的雜交組合擴大繁殖。2.3rapd遺傳距離對三色抗雜性能的影響對雙列雜交后資料進行配合力方差分析。由于雜交組合9×18缺失,因此在分析中剔除了自交系9及其雜交后代。結果顯示在調查的性狀中,株幅與花數(shù)的一般配合力方差達到顯著水平,而其余的均未達顯著水平;花徑與花數(shù)的特殊配合力方差達到顯著水平,而其余的均未達顯著水平(數(shù)據(jù)未列出)。因此在相關分析中只分析了株幅與花數(shù)的一般配合力和花徑與花數(shù)的特殊配合力與RAPD遺傳距離及雜種優(yōu)勢的相關性。根據(jù)RAPD數(shù)據(jù)計算Griffing試驗中5個自交系親本的遺傳距離矩陣,5個自交系之間的遺傳距離都較小(平均0.223),其中3與12的距離最大(0.255),8與9或9與12的距離最小(0.191)。自交系UPGMA聚類樹見圖3,可見8與9遺傳距離最小,而3與其它自交系親緣關系較遠。遺傳距離與雜種表型值、雜種中親優(yōu)勢、雜種超親優(yōu)勢、一般配合力和特殊配合力的相關系數(shù)見表3,其中親本的平均遺傳距離用該親本的所有組合雙親間遺傳距離平均值表示,用于與親本的一般配合力的分析。由表3可知,由RAPD計算得到的遺傳距離與絕大多數(shù)性狀的相關性不顯著,表明不能用RAPD遺傳距離可靠地預測三色堇的雜種優(yōu)勢。但是值得注意的是,RAPD距離與花數(shù)的F1代表現(xiàn)值、中親優(yōu)勢、超親優(yōu)勢的相關系數(shù)均達到0.1的顯著水平(p值分別為0.092、0.069、0.058),且決定系數(shù)分別為0.55、0.40、0.42,說明RAPD遺傳距離在花數(shù)的形成中占有較大的比例,因而用RAPD遺傳距離預測花數(shù)的雜種優(yōu)勢具有一定的可靠性。特殊配合力與中親優(yōu)勢、超親優(yōu)勢的相關關系達到極顯著的水平,而且決定系數(shù)也較高(表4),說明三色堇中用特殊配合力預測雜種優(yōu)勢的可靠性很高。但RAPD距離與一般配合力、特殊配合力的相關關系不顯著,說明用RAPD距離也不能有效的預測配合力。3討論3.1聚類分析結果三色堇傳統(tǒng)上一般按花徑大小分為巨大花系、大花系、中花系與小花系,又可按花色斑的有無分為純色類、雜色類,還可按用途分為盆花類和切花類。從本試驗的結果來看,這18個三色堇自交系的分類與花徑的關系較大,小花與大花的類型基本上被分開,與地理來源也較一致,因此可根據(jù)這兩方面的資料初步判斷三色堇的遺傳差異,這與上述花徑的分類標準較為一致。但色斑有無與RAPD分類不太吻合,如無色斑的自交系10、11沒有與自交系9聚為一類,它們與其它有色斑的自交系也沒有孑然分開,可能是因為這一性狀只由少數(shù)的基因或主效基因控制,在RAPD數(shù)據(jù)中難以起到主要的作用。聚類結果與各自交系的來源也有一些差異,如自交系3來自品種‘SwissGiantEveningGlow’,卻與其它‘SwissGiant’系列的自交系劃分開來;自交系2來自‘SwissGiantRedWing’,卻與來自‘JokerOrange’的自交系4聚為一類。造成這一現(xiàn)象的原因則可能是因為三色堇育種時期較長,育種地區(qū)也很廣泛,它的異交習性和長期的人工雜交選育使不同品種間的血緣關系甚為復雜,因而有可能出現(xiàn)品系內的遺傳距離反而比品系外大的現(xiàn)象。但值得注意的是它們都是來自歐洲的品種,與美國親緣的自交系明顯分開,顯示了地理差距在親緣關系分化中的作用。3.2rapd標記的局部雜合性分子標記用于雜種優(yōu)勢的預測已有了較多的研究,但多數(shù)研究的預測效果因實驗材料、研究手段的變化而不同甚至相反,表明用分子標記的遺傳距離預測雜種優(yōu)勢離實際應用還很遠。Bernado從理論上分析了分子標記預測雜種優(yōu)勢的效果,認為要有效地預測雜種優(yōu)勢必須滿足以下條件:①顯性作用較強;②親本自交系間位點雜合;③性狀遺傳力高;④平均親本所有位點的頻率變化范圍窄;⑤至少30%~50%的QTL與分子標記連鎖;⑥不超過20%~30%的分子標記隨機分布或與QTL無關?？梢?用分子標記準確地預測雜種優(yōu)勢較困難。從本實驗結果來看,三色堇的RAPD遺傳距離與各性狀的雜種優(yōu)勢相關性很弱,僅與花數(shù)有達到0.1水平的相關性,說明簡單地用RAPD遺傳距離預測三色堇的雜種優(yōu)勢是不適當?shù)?。可能的原因?①擴增的RAPD位點偏少,不足以覆蓋全部基因組,降低了遺傳距離計算的精度;②RAPD標記包含了與相應