家畜繁殖學(xué)第八章 配子與胚胎生物工程

第八章配子與胚胎生物工程Chapter8BiotechnologiesofGametesandEmbryos第一節(jié)胚胎移植技術(shù)Section1Embryotransfer第二節(jié)體外受精Section２

Invitrofertilization第三節(jié)克隆技術(shù)Section３

Animalcloning本章內(nèi)容第四節(jié)轉(zhuǎn)基因技術(shù)Section４TransgenicAnimal第五節(jié)性別控制技術(shù)Section５Sexcontrol第六節(jié)胚胎干細(xì)胞的別離培養(yǎng)技術(shù)Section６Embryonicstemcellstechnique第七節(jié)哺乳動(dòng)物嵌合體的生產(chǎn)Section７Chimera第一節(jié)胚胎移植技術(shù)

胚胎移植技術(shù)概述1胚胎移植技術(shù)的原理2胚胎移植的技術(shù)程序3本節(jié)重點(diǎn)胚胎移植的生物學(xué)根底與原那么；供體超數(shù)排卵程序的制定；胚胎采集的方法。一、概述〔一〕概念胚胎移植〔embryotransfer，ET〕：又稱(chēng)受精卵移植，是將體內(nèi)或體外生產(chǎn)的哺乳動(dòng)物早期胚胎移植到同種的生理狀態(tài)相同的雌性動(dòng)物生殖道內(nèi)，使之繼續(xù)妊娠發(fā)育為新個(gè)體的技術(shù)，也稱(chēng)借腹懷胎。提供胚胎的個(gè)體——供體〔donor〕接受胚胎的個(gè)體——受體〔recipient〕為了使供體♀多排卵，通常采用超排〔superovulation〕；國(guó)外將常規(guī)的胚胎移植稱(chēng)為超數(shù)排卵胚胎移植或稱(chēng)為多排卵胚胎移植〔multipleovulationandembryotransfer，MOET〕；目前，用體外生產(chǎn)胚胎〔invitroproduction,IVP〕技術(shù)或克隆〔cloning〕技術(shù)等方法也可以生產(chǎn)胚胎，擴(kuò)大了優(yōu)質(zhì)胚胎的來(lái)源，降低了ET的本錢(qián)?！捕抽_(kāi)展歷史 1890年劍橋大學(xué)WalterHeape從一頭純種安哥拉母兔取出2個(gè)4細(xì)胞胚胎，移植到一頭純種比利時(shí)母兔輸卵管上端(用同種公兔交配后3h),結(jié)果生出了4只比利時(shí)種仔兔和2只純種安哥拉仔兔。

這一結(jié)果說(shuō)明早期發(fā)育的胚胎更換到另一個(gè)體的輸卵管(或子宮角)內(nèi)，如果胚胎的發(fā)育階段和所處的環(huán)境條件相適應(yīng)，它完全可以繼續(xù)正常發(fā)育，并成長(zhǎng)為一個(gè)新個(gè)體。國(guó)外胚胎移植技術(shù)的開(kāi)展歷史作者及年代事例動(dòng)物Heape,1890Nicholas,1933Warwick,1949Kvansnickii,1951Willett,1951Marden和Chang,1952Whittingham,1972國(guó)際胚胎移植學(xué)會(huì)成立,1975Steptoe，1978Newcomb和Elsden，1979首次胚胎移植成功胚胎移植成功胚胎移植成功胚胎移植成功胚胎移植成功首次胚胎洲際運(yùn)輸(保存在100C)經(jīng)長(zhǎng)期冷凍,胚胎移植并產(chǎn)仔胚胎移植成功使用卡蘇輸精器兔大鼠綿羊和山羊豬牛兔牛人牛我國(guó)胚胎移植技術(shù)的開(kāi)展歷史作者及年代事例動(dòng)物陳玉琦,1973中科院遺傳所,1974中科院遺傳所,1976譚麗玲,郭志勤等,1976中科院遺傳所,1979王建辰等,1980王運(yùn)京等,1980中國(guó)農(nóng)科院畜牧所,1980張涌等,1987譚麗玲,馬世援等,1989郭志勤等,1989胚胎移植成功胚胎移植成功胚胎低溫保存(100C)產(chǎn)仔胚胎低溫保存(100C)產(chǎn)犢-1960C保存胚胎產(chǎn)仔胚胎移植成功非手術(shù)法胚胎移植成功-1960C保存胚胎產(chǎn)羔胚胎分割移植成功鮮胚分割移植成功凍胚分割移植成功兔綿羊兔綿羊兔奶山羊奶牛綿羊奶山羊奶牛奶牛充分發(fā)揮優(yōu)良母畜的繁殖潛力。加速品種改良，擴(kuò)大良種畜群。

節(jié)省引種費(fèi)用，便于品種資源保存。防止疫病傳播與不孕。誘發(fā)肉畜產(chǎn)雙胎，提高生產(chǎn)效率。

胚胎移植的意義為其它胚胎生物技術(shù)提供研究手段?！踩扯⑴咛ヒ浦驳纳韺W(xué)根底與根本原那么〔一〕生理學(xué)根底〔二〕胚胎移植遵循的根本原那么〔三〕開(kāi)展胚胎移植的條件母畜發(fā)情后生殖器官的孕向發(fā)育1早期胚胎處于游離狀態(tài)2移植的胚胎具有免疫耐受性3妊娠信號(hào)是由胚胎發(fā)出的4胚胎的遺傳特性不受受體母畜的影響51.胚胎移植的生理學(xué)根底2.胚胎移植的根本原那么胚胎移植前后所處的環(huán)境的同一性同一解剖位置：空間環(huán)境的一致性同一生理階段：受體和供體在發(fā)情時(shí)間上的同期性

同一物種：供體和受體在分類(lèi)學(xué)上的相同屬性胚胎的發(fā)育期限必須處于周期黃體期內(nèi)。胚胎的質(zhì)量胚胎必須是正常的，并在處理過(guò)程中不受不良因素的影響。實(shí)驗(yàn)室條件

溫度恒定、空氣潔凈、布局合理；技術(shù)條件胚胎來(lái)源包括人員的技術(shù)水平及所需的設(shè)備；

從良種母畜獲得大量胚胎。3.開(kāi)展胚胎移植的條件三、胚胎移植的技術(shù)程序

供體良種母畜良種公畜分娩良種后代妊娠

受體移植發(fā)情不配種

受體母畜

超數(shù)排卵發(fā)情配種采集胚胎發(fā)情配種或再作供體胚胎檢查和保存同期發(fā)情分娩良種后代妊娠

受體移植發(fā)情不配種

受體母畜

超數(shù)排卵發(fā)情配種采集胚胎發(fā)情配種或再作供體胚胎檢查和保存同期發(fā)情牛胚胎移植技術(shù)路線示意圖〔一〕ET的實(shí)際效果1、胚胎來(lái)源1〕排卵率2〕回收率3〕受精率2、胚胎冷凍和胚胎分割的應(yīng)用四、ET的實(shí)際效果和影響妊娠率的因素〔二〕影響妊娠率的因素胚胎因素母體因素其他因素

五、ET存在的主要問(wèn)題胚胎來(lái)源有限缺乏熟練的技術(shù)人員胚胎冷凍技術(shù)不完善費(fèi)用高、要求高手術(shù)法容易出現(xiàn)粘連的問(wèn)題1、牛胚胎移植技術(shù)應(yīng)用前景因?yàn)榕５慕?jīng)濟(jì)價(jià)值高、單胎、繁殖周期長(zhǎng)、常年發(fā)情，所以采用胚胎移植技術(shù)生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)奶牛、肉牛，正適于當(dāng)今國(guó)內(nèi)奶牛、肉牛生產(chǎn)旺盛需求，其更具廣闊開(kāi)展空間和持續(xù)開(kāi)展前景。

2、羊胚胎移植技術(shù)應(yīng)用前景相比之下，羊的經(jīng)濟(jì)價(jià)值不及牛，繁殖率較牛高，繁殖周期較牛短，且移植術(shù)目前僅限于手術(shù)法，供體可利用次數(shù)少等因素制約。但從近期開(kāi)展態(tài)勢(shì)看，又強(qiáng)于牛，其主要原因是：優(yōu)質(zhì)羊價(jià)位高，公母羊都有一個(gè)良好市場(chǎng)。六、胚胎移植的開(kāi)展前景〔以牛、羊?yàn)槔掣拍?、意義及開(kāi)展歷史IVF的根本程序IVF的應(yīng)用前景第二節(jié)體外受精1、概念：在自然條件下，哺乳動(dòng)物精子和卵子的受精過(guò)程是在體內(nèi)完成的。如將精子和卵子分別從公、母畜體內(nèi)取出并經(jīng)過(guò)一系列的處理，使精卵在體外條件下結(jié)合的過(guò)程，稱(chēng)為體外受精(invitrofertilization，IVF)。由于卵子和精子的受精過(guò)程是在實(shí)驗(yàn)室中完成，故通過(guò)這一技術(shù)而產(chǎn)下的動(dòng)物又稱(chēng)為“試管動(dòng)物〞，如“試管牛〞、“試管豬〞、“試管嬰兒〞等。一、概念、意義及開(kāi)展歷史

2、開(kāi)展歷史

早在1878年，德國(guó)人Scnenk就以家兔和豚鼠為材料，開(kāi)始探索哺乳動(dòng)物的體外受精技術(shù)，但一直沒(méi)有獲得成功。直到1951年，美籍華人張明覺(jué)和澳大利亞人Austin同時(shí)發(fā)現(xiàn)了哺乳動(dòng)物的精子獲能現(xiàn)象，這一領(lǐng)域的研究才獲得突破性進(jìn)展。1959年，張明覺(jué)以家兔為實(shí)驗(yàn)材料，從一只交配后12h的母兔子宮中沖取精子(即體內(nèi)獲能的精子)，從另外兩只超數(shù)排卵處理母兔的輸卵管中收集卵子，精子和卵子在體外人工配制的溶液中完成受精過(guò)程，然后，正常卵裂的36枚胚胎被移植到6只受體的輸卵管中，其中4只妊娠，并產(chǎn)下15只健康仔兔，這是世界上首批試管動(dòng)物，它們的正常發(fā)育標(biāo)志著體外受精技術(shù)的建立。

20世紀(jì)60年代初至20世紀(jì)80年代中期，人們以家兔、小鼠和大鼠等為實(shí)驗(yàn)材料，進(jìn)行了大量根底研究，在精子獲能機(jī)理和獲能方法方面取得很大進(jìn)展。精子由最初在同種或異種雌性生殖道孵育獲能，開(kāi)展到用子宮液、卵泡液、子宮內(nèi)膜提取液或血清等在體外培養(yǎng)獲能，最后用化學(xué)成清楚確的溶液培養(yǎng)獲能。同時(shí)，通過(guò)射出精子和附睪精子獲能效果的比較研究，人們發(fā)現(xiàn)射出精液中含有去能因子，并認(rèn)識(shí)到獲能的實(shí)質(zhì)是去除精子外表的去能因子。這些理論和方法上的成就，推動(dòng)了體外受精技術(shù)的開(kāi)展，試管小鼠(Whittingham，1968)、大鼠(Toyoda和Chang，1974)、嬰兒(Steptoe和Edwards，1978)、牛(Brackett等，1982)、山羊(Hamda，1985)、綿羊(Hanada，1985)和豬(Chang等，1986)等相繼出生。

20世紀(jì)80年代中期以后，以牛為代表的家畜IVF技術(shù)開(kāi)展迅速，1986年P(guān)arrish等用含肝素的介質(zhì)處理牛的冷凍精液，然后與體外成熟的卵母細(xì)胞體外受精獲得成功。這對(duì)牛IVF的研究和應(yīng)用具有重要意義，因?yàn)檫@種方法可利用屠宰場(chǎng)廢棄的卵巢和冷凍精液進(jìn)行胚胎體外生產(chǎn)，不僅本錢(qián)低廉，而且效果穩(wěn)定。此后，牛的卵母細(xì)胞體外成熟和胚胎培養(yǎng)體系逐步趨于成熟，胚胎體外生產(chǎn)效率得到很大提高。目前，采用IVF-ET技術(shù)，每對(duì)廢棄的牛卵巢可獲得3頭左右的犢牛。為充分利用良種母牛的遺傳資源，20世紀(jì)80年代后期，牛的活體取卵技術(shù)〔OvumpickUP.OPU〕開(kāi)展迅速?；铙w取卵和IVF-ET結(jié)合已成為歐、美和大洋洲等畜牧業(yè)興旺國(guó)家的農(nóng)場(chǎng)主為擴(kuò)大良種母牛群選擇的重要繁殖技術(shù)。

牛的體外受精技術(shù)不僅應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)，同時(shí)，也成為研究其他胚胎生物技術(shù)，如克隆、轉(zhuǎn)基因、胚胎干細(xì)胞別離培養(yǎng)和性別控制等的重要輔助手段。

體外受精技術(shù)的開(kāi)展簡(jiǎn)史

動(dòng)物報(bào)道時(shí)間報(bào)道者兔小鼠大鼠人牛豬恒河猴狒狒綿羊山羊狨猴馬貓犬19591968197419781982198619841984198519851988199019701976ChangWhittinghamToyodaSteptoeBrackettChengBavisterBamaceda花田章花田章LopataZhangHammerMahi〔1〕研究哺乳動(dòng)物配子發(fā)生、受精和胚胎早期發(fā)育機(jī)理?！?〕在家畜品種改進(jìn)中，體外受精技術(shù)為胚胎生產(chǎn)提供了廉價(jià)而高效的手段，對(duì)充分利用優(yōu)良品種資源，縮短家畜繁殖周期，加快品種改進(jìn)速度等有重要價(jià)值。〔3〕在人類(lèi)，IVF技術(shù)是治療某些不孕癥和克服性連鎖病的重要措施之一?！?〕體外受精技術(shù)還是哺乳動(dòng)物胚胎移植、克隆、轉(zhuǎn)基因和性別控制等現(xiàn)代生物技術(shù)不可缺少的組成局部。

3、意義二、體外受精的根本操作程序卵母細(xì)胞的體外成熟〔invitromaturation,IVM〕卵子和精子的體外受精〔invitrofertilization,IVF〕受精卵的體外培養(yǎng)〔invitroculture,IVC〕1、離體卵巢采卵：從屠宰母畜的卵巢上采集卵母細(xì)胞

〔一〕卵母細(xì)胞的采集和成熟培養(yǎng)〔1〕卵泡抽吸法〔2〕卵巢切割法2、活體采卵：從活母畜的卵巢上采集卵母細(xì)胞〔優(yōu)良品種〕

B超引導(dǎo)法：借助超聲波(B超)探頭和屏幕的引導(dǎo)，從活母畜卵巢采集卵母細(xì)胞。操作員先將帶有B超探頭和采卵針的采卵器通過(guò)陰道插入子宮，同時(shí)通過(guò)將卵巢貼在探頭上。根據(jù)B超屏幕所顯示的卵泡位置，利用采卵針穿刺卵泡并同時(shí)抽吸卵母細(xì)胞。

1〕培養(yǎng)液：用于卵母細(xì)胞體外成熟的最為廣泛根底培養(yǎng)液是M199。培養(yǎng)時(shí)尚要參加一定的血清和激素。2〕溫度和氣相：牛、豬、羊和馬等家畜的卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的溫度一般為38～39℃。所有哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的氣相一般要求在含5％C02的空氣和最大濕度的環(huán)境。3〕培養(yǎng)時(shí)間：牛和羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的時(shí)間一般為22～24h，而馬為30～36h，豬為40～44h。4〕培養(yǎng)方法：卵母細(xì)胞體外成熟的培養(yǎng)方法一般采用微滴法、封閉法和開(kāi)放法三種。3、卵母細(xì)胞的體外成熟〔IVC〕1、精子的制備：懸浮法〔swimup〕、直接離心法、哌可〔Percoll〕密度梯度離心法2、精子獲能處理：肝素處理法、鈣離子載體法、高滲溶液處理法3、受精液：通常使用Tyrode’s改進(jìn)液和BO液4、受精方法：微滴法、四孔培養(yǎng)板法5、精卵共培養(yǎng)的時(shí)間、溫度和氣相：受精后，卵母細(xì)胞應(yīng)立即放入溫度39℃，含5％CO2的空氣和最大相對(duì)濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～44h，其中牛22～24h，將假定的受精卵從受精液中取出，再在早期胚胎體外培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)18～33h。受精后40～44h檢查受精卵的分裂率〔二〕卵母細(xì)胞的體外受精〔IVF〕1、培養(yǎng)液：根本成分主要包括無(wú)機(jī)鹽、氨基酸、維生素、碳水化合物和蛋白質(zhì)等。2、胚胎體外培養(yǎng)系統(tǒng)：常規(guī)培養(yǎng)系統(tǒng)、輸卵管離體培養(yǎng)系統(tǒng)、與體細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)。3、培養(yǎng)方法：卵子在受精24h后，轉(zhuǎn)移到預(yù)先制備好的顆粒單層中繼續(xù)培養(yǎng)。一般使用微滴培養(yǎng)法。4、培養(yǎng)的溫度和氣相環(huán)境：和卵母細(xì)胞成熟的條件一樣。5、胚胎的回收及其質(zhì)量評(píng)定：以牛為例，整個(gè)體外受精程序，從卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)開(kāi)始，經(jīng)過(guò)體外受精和體外培養(yǎng)直至受精卵發(fā)育到囊胚階段，一共經(jīng)歷8d的時(shí)間。如定受精當(dāng)天為0d，那么受精后第5～6d即可回收桑椹胚，第7～8d回收囊胚。

〔三〕早期胚胎的體外培養(yǎng)〔IVC〕三、家畜體外受精技術(shù)的開(kāi)展現(xiàn)狀和存在的問(wèn)題

動(dòng)物卵裂率囊胚率冷凍后存活率鮮胚移植后的產(chǎn)仔率牛８０％－９０％４０％－５０％８０％３０％－４０％羊８０％－９０％３０％－４０％８０％５０％豬９０％６０％－７０％－５０％〔一〕開(kāi)展現(xiàn)狀〔二〕存在的問(wèn)題和開(kāi)展方向1、存在的問(wèn)題１〕囊胚發(fā)育率低，細(xì)胞數(shù)少。２〕產(chǎn)仔率低，胎兒初生重高。2、開(kāi)展的方向１〕深入研究卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育的分子機(jī)理；２〕加強(qiáng)腔前卵泡的培養(yǎng)研究，充分利用優(yōu)良母畜的遺傳資源；３〕加強(qiáng)體外受精與其他生物技術(shù)的結(jié)合。四、輔助受精技術(shù)(assistedfertilization)

通過(guò)對(duì)哺乳類(lèi)配子進(jìn)行顯微操作以協(xié)助其受精的技術(shù)稱(chēng)為顯微受精?；罹油该鲙伦⑸渫该鲙с@孔透明帶部分切口卵母細(xì)胞質(zhì)內(nèi)注射

精液的利用率可成百萬(wàn)倍的提高，可以使優(yōu)良種公畜得到最充分的應(yīng)用；精子的保存技術(shù)將大為簡(jiǎn)化，將來(lái)或許只要精子核物質(zhì)完整就可以到達(dá)受精的目的，這對(duì)世界珍稀動(dòng)物資源的保護(hù)將產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響；與其他技術(shù)結(jié)合，如將已經(jīng)過(guò)性別鑒定的精子注入卵子受精，可人為控制家畜后代的性別。顯微受精技術(shù)在動(dòng)物受精和發(fā)育機(jī)理研究、畜牧業(yè)生產(chǎn)及人醫(yī)臨床實(shí)踐中有著廣闊的應(yīng)用前景：第三節(jié)克隆技術(shù)Animalcloning一、概述二、胚胎分割三、單個(gè)卵裂球別離培養(yǎng)四、細(xì)胞核移植定義：是指由一個(gè)細(xì)胞或個(gè)體以無(wú)性繁殖〔asexualreproduction〕或孤雌生殖而產(chǎn)生方式產(chǎn)生遺傳物質(zhì)完全相同的一群細(xì)胞或一群個(gè)體。內(nèi)容：

一、概述克隆技術(shù)廣義狹義胚胎分割細(xì)胞核移植胚胎細(xì)胞核移植體細(xì)胞核移植一、胚胎分割胚胎分割：運(yùn)用顯微操作系統(tǒng)將哺乳動(dòng)物附植前胚胎分成假設(shè)干個(gè)具有繼續(xù)發(fā)育潛力局部的生物技術(shù)，從而可獲得同孿生后代?！惨弧抽_(kāi)展史年代胚胎細(xì)胞數(shù)動(dòng)物19042-細(xì)胞蛙類(lèi)19302-細(xì)胞家兔19702-細(xì)胞小鼠19804-細(xì)胞、8-細(xì)胞綿羊4-細(xì)胞?！捕撑咛シ指畹母境绦蚍指钇骶叩臏?zhǔn)備胚胎預(yù)處理胚胎分割分割胚的培養(yǎng)分割胚的保存和移植體視顯微鏡倒置顯微鏡顯微操作儀桑椹胚之前的胚胎分割桑椹胚和囊胚的分割卵裂球培養(yǎng)示意圖牛桑椹胚胎分割二、囊胚的分割〔續(xù)〕123牛囊胚的分割〔三〕技術(shù)進(jìn)展1、出生重低2、遺傳一致性3、異常與畸形4、同卵多胎的局限性二、單個(gè)卵裂球別離培養(yǎng)定義：把動(dòng)物早期胚胎別離成單個(gè)卵裂球，再把卵裂球單獨(dú)培養(yǎng)為正常胚胎，然后移植給受體得到克隆后代。機(jī)械切開(kāi)透明帶吸取卵裂球蛋白酶溶解透明帶再吸取卵裂球方法三、細(xì)胞核移植

細(xì)胞核移植：是指將一個(gè)供體核通過(guò)顯微操作方法移植到一個(gè)核受體中，組成核質(zhì)雜合細(xì)胞，這種核質(zhì)雜合細(xì)胞也叫作重構(gòu)胚。細(xì)胞核移植胚胎細(xì)胞核移植體細(xì)胞核移植〔一〕開(kāi)展史年代代表人物動(dòng)物1952Briggs和Kings非洲豹蛙1975Bromhall家兔1981Illmense和Hoppe小鼠1986Willadsen綿羊1987Prather

牛1988Stice和Robl家兔1989Prather等豬1991Yong等山羊1、胚胎細(xì)胞核移植2、體細(xì)胞核移植胚胎細(xì)胞核移植體細(xì)胞核移植細(xì)胞核移植的方法動(dòng)物核移植技術(shù)程序〔二〕細(xì)胞核移植的操作程序

1、核供體細(xì)胞的準(zhǔn)備1〕核供體細(xì)胞種類(lèi)①初期胚胎細(xì)胞②ES細(xì)胞③各種體細(xì)胞：如胎兒成纖維細(xì)胞，乳腺細(xì)胞，皮膚細(xì)胞〔耳、成體、胎兒〕，肌肉細(xì)胞，卵丘細(xì)胞，內(nèi)臟細(xì)胞〔肝、脾、心、肺、腸、舌〕④生殖系列細(xì)胞：PGCs、精母細(xì)胞、足細(xì)胞和精巢細(xì)胞①胚胎細(xì)胞作為核供體先用1%的鏈酶蛋白酶或pH2.5的臺(tái)氏液去掉透明帶，再用機(jī)械吹打或酶消化發(fā)使其分散為單個(gè)游離的卵裂球。一般選擇16～32-細(xì)胞期或晚期桑椹的胚胎細(xì)胞較為適宜。2〕核供體細(xì)胞的準(zhǔn)備②體細(xì)胞作為核供體經(jīng)0.25%胰蛋白酶+0.1%EDTA消化后，將細(xì)胞接種培養(yǎng)于DMEM。之后放入5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%時(shí)進(jìn)行傳代。傳代3～8代的細(xì)胞用于核移植。③胚胎干細(xì)胞作為核供體ES細(xì)胞既具有胚胎細(xì)胞所不具備的數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)，又具有體細(xì)胞所不能保持的低分化。ES細(xì)胞是全能的，在一定條件下，它可以分化成各種功能細(xì)胞。2、核受體細(xì)胞的準(zhǔn)備1〕核受體細(xì)胞的種類(lèi)①去核卵母細(xì)胞②去核合子③去核2-細(xì)胞期胚胎的卵裂球選擇細(xì)胞：采用去核的MII期卵母細(xì)胞作為受體胞質(zhì)。去核：受體MII期卵母細(xì)胞需要進(jìn)行去核。方法：盲吸法，熒光引導(dǎo)去核法，微分干預(yù)及極性顯微鏡去核法，離心去核法，化學(xué)試劑去核法，末期去核法，吸引法去核，擠壓法去核，點(diǎn)擊法去核2〕受體卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備熒光引導(dǎo)去核法用Hoechst33342〔2～8mg/ml〕染色10～15min，然后在熒光顯微鏡下確定核的位置離心去核法：根據(jù)細(xì)胞核的密度大于細(xì)胞質(zhì)，用離心的方法可使沒(méi)有透明帶的卵母細(xì)胞核被甩向一側(cè)而最后脫離卵母細(xì)胞?；瘜W(xué)試劑去核法：用化學(xué)試劑處理處于第一次減數(shù)分裂中期的小鼠卵母細(xì)胞，使染色體相互緊密結(jié)合，形成染色體復(fù)合體，在卵母細(xì)胞排出PB1時(shí)，染色體復(fù)合體隨PB1一起排出。末期去核法：激活處理成熟卵母細(xì)胞，使其排出PB2，然后吸取其周?chē)浇募?xì)胞質(zhì)。吸引法去核：在注入核供體的同時(shí)吸引除掉原有卵母細(xì)胞核。擠壓法去核在PB1附近，將透明帶切開(kāi)，調(diào)準(zhǔn)切口，固定卵母細(xì)胞，使切割針與其成垂直方向，向下擠壓除去PB1連同下面的一小局部細(xì)胞質(zhì)點(diǎn)擊法去核

在PB1附近，將卵母細(xì)胞透明帶切開(kāi)1/3，調(diào)準(zhǔn)切口，使其與切割針成垂直方向，固定卵母細(xì)胞，用顯微針點(diǎn)擊透明帶，除去PB1連同下面的一小局部細(xì)胞質(zhì)。1〕化學(xué)法2〕仙臺(tái)病毒法3〕電融合法4、細(xì)胞融合系統(tǒng)1〕化學(xué)激活 ⑴7%乙醇：處理時(shí)間5～7min ⑵離子霉素：4umol/L，5min ⑶鈣離子載體〔A23187〕：5umol/L，5min ⑷6-DMAP：1.9～2.0mmol/L；3～5h或更長(zhǎng) ⑸星形胞菌素：2umol/L；15～30min2〕電激活

5、激活系統(tǒng)6、核移植重構(gòu)胚的培養(yǎng)體內(nèi)培養(yǎng)：用瓊脂包埋，移入中間受體〔如羊、兔〕的輸卵管內(nèi)，培養(yǎng)4～5d后回收胚胎進(jìn)行移植。體外培養(yǎng)：重組胚激活后，在現(xiàn)有的胚胎體外培養(yǎng)系統(tǒng)中進(jìn)行培養(yǎng)。7、繼代細(xì)胞核移植又叫連續(xù)細(xì)胞核移植，即將核移植胚胎的卵裂球分開(kāi)，作為供核細(xì)胞，再進(jìn)行連續(xù)多代的核移植，以便從一枚胚胎得到更多的克隆胚胎。8、克隆胚胎的移植

先做同期發(fā)情處理，然后將胚胎移到受體動(dòng)物如牛和水牛的黃體側(cè)子宮角。結(jié)果不穩(wěn)定，效率低〔1～6%〕；克隆動(dòng)物懷孕期長(zhǎng)、出生體重異常偏大、生后對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性差；存活率低細(xì)胞質(zhì)的遺傳問(wèn)題〔三〕核移植技術(shù)存在的問(wèn)題1、擴(kuò)大優(yōu)良畜種和稀有動(dòng)物的數(shù)量2、提高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物效率3、核-質(zhì)間互作關(guān)系的研究4、克隆技術(shù)的醫(yī)學(xué)價(jià)值〔四〕核移植的應(yīng)用前景核移植產(chǎn)生的彌猴美國(guó)俄勒崗州靈長(zhǎng)類(lèi)研究中心通過(guò)早期胚胎卵裂球移植入卵母細(xì)胞后產(chǎn)生的幼猴。第四節(jié)轉(zhuǎn)基因技術(shù)動(dòng)物

TransgenicAnimal一、概述二、哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究意義三、哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的主要環(huán)節(jié)四、哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)存在的主要問(wèn)題轉(zhuǎn)基因技術(shù)：通過(guò)一定方法把人工重組的外源DNA導(dǎo)入受體動(dòng)物的基因組中或把受體基因組中的一段DNA切除，從而使受體動(dòng)物的遺傳信息發(fā)生人為改變，并且這種改變能穩(wěn)定地遺傳給后代的技術(shù)。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)誘導(dǎo)基因組改變的動(dòng)物稱(chēng)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(transgenicanimal〕。一、概述1976年Jaenisch等獲得含有SV40DNA的嵌合體小鼠。1980年，Gordon應(yīng)用顯微注射法首次成功地將重組的外源DNA直接注入小鼠受精卵雄原核中，獲得了攜帶外源基因小鼠。1982年，Palmiter將大鼠的生長(zhǎng)激素基因用微注射方法導(dǎo)入小鼠的受精卵中獲得巨型小鼠〔supermouse〕，從而在理論上和實(shí)踐意義上都將轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高一步，引起生物學(xué)界極大的關(guān)注，為基因工程育種提供誘人的前景。早期以提高生長(zhǎng)為主，以生產(chǎn)藥用蛋白和可移植的器官開(kāi)展史十大神奇轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

這些五彩斑斕的腦細(xì)胞是單個(gè)的神經(jīng)元，鮮艷的色彩幫助科學(xué)家將它們區(qū)分開(kāi)來(lái)。英國(guó)哈佛大學(xué)的杰夫-里奇曼為首的科研小組在實(shí)驗(yàn)鼠的基因組中導(dǎo)入水母的綠色熒光蛋白基因，使其在紫色光線的照射下呈現(xiàn)出綠色熒光。這種綠色熒光基因?qū)π∈鬅o(wú)害，只起到標(biāo)記作用。熒光鼠我們所有人都聽(tīng)說(shuō)過(guò)蜘蛛俠，但是你聽(tīng)過(guò)蜘蛛山羊嗎？這種轉(zhuǎn)基因山羊是獨(dú)一無(wú)二的，因?yàn)樗鼈兡墚a(chǎn)生普通的蜘蛛絲。這種構(gòu)成蜘蛛網(wǎng)的同樣物質(zhì)由它們的乳腺產(chǎn)生。很多科學(xué)家把蜘蛛絲叫做“生物鋼〞，有著超強(qiáng)的抗張強(qiáng)度。研究人員稱(chēng)，如果把很多蜘蛛絲擰成一股繩的話(huà)，它足夠強(qiáng)韌，可制成防彈背心、降落傘繩，或者從飛機(jī)到航母等設(shè)備。蜘蛛絲還可被制成人造韌帶和人造腱，支撐組織、骨骼和神經(jīng)細(xì)胞，讓它們?cè)谏L(zhǎng)期間保持穩(wěn)定。隨著細(xì)胞的逐漸生長(zhǎng)，這些人造絲局部會(huì)逐漸分解。但蜘蛛與蠶不同，把很多蜘蛛放在一起它們會(huì)彼此蠶食。因此，科學(xué)家始終致力于想出集中生產(chǎn)蜘蛛絲的方法。幫助“生產(chǎn)〞這些山羊的懷俄明大學(xué)分子生物學(xué)家蘭迪-劉易斯說(shuō)：“從概念上講，這個(gè)過(guò)程非常簡(jiǎn)單。用于絲蛋白的蜘蛛絲基因與控制蛋白質(zhì)構(gòu)成組織的山羊的DNA有關(guān)。在這種情況下，它是乳腺，只形成于哺乳期。然后，細(xì)胞與卵結(jié)合生成胚胎，胚胎有著合成其DNA的基因。當(dāng)母羊開(kāi)始分泌乳汁時(shí)絲蛋白就產(chǎn)生了。〞美國(guó)研究人員通過(guò)一項(xiàng)新技術(shù)，使得老鼠具有了抵抗各種癌癥的能力，而這個(gè)科學(xué)突破將使癌癥患者有望接受無(wú)副作用的治療。這些老鼠內(nèi)產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)是未來(lái)療法的關(guān)鍵，它能消滅腫瘤細(xì)胞，卻不會(huì)傷害體內(nèi)的健康組織。通常情況下，一般的癌癥治療會(huì)使患者出現(xiàn)疼痛、惡心和掉頭發(fā)等情況?？茖W(xué)家們希望有朝一日把這種蛋白質(zhì)用于癌癥患者身上，使他們擺脫這些痛苦。這個(gè)突破取決于一種叫Par-4的老鼠基因，它生產(chǎn)這種蛋白質(zhì)。研究人員讓一組老鼠擁有比正常情況下更多的蛋白質(zhì)。?癌癥研究?雜志報(bào)道，后來(lái)他們發(fā)現(xiàn)，這些老鼠對(duì)許多癌癥類(lèi)型產(chǎn)生免疫力，像肝癌和前列腺癌等。測(cè)試顯示，這種蛋白質(zhì)還能抵抗乳腺癌、胰腺癌和頭頸癌等。美國(guó)的這些科學(xué)家們表示，至關(guān)緊要的一點(diǎn)是這些老鼠沒(méi)有出現(xiàn)任何明顯的副作用。翡翠海參看起來(lái)更像一片樹(shù)葉，而不是黏滑的腹足軟體動(dòng)物，但它卻是第一種在自然演化過(guò)程中發(fā)生轉(zhuǎn)基因現(xiàn)象的物種。這種生物令很多科學(xué)家大惑不解。就像緬因大學(xué)的瑪麗-朗波發(fā)現(xiàn)，它們居然能夠利用水藻食物中的葉綠體進(jìn)行光合作用以產(chǎn)生能量。沒(méi)有任何其他動(dòng)物能夠這樣利用葉綠體。朗波研究發(fā)現(xiàn)海參中的一種基因與水藻中具有光合作用的基因類(lèi)似，這說(shuō)明在過(guò)去的漫長(zhǎng)歲月中，該基因或許通過(guò)自然進(jìn)化的方式從水藻轉(zhuǎn)移到海參的DNA中。雖然目前還很難證實(shí)海參身上的這種基因轉(zhuǎn)移，但朗波仍表示“我們正致力于探究這種轉(zhuǎn)移是如何發(fā)生的〞，這將有利于科學(xué)家探索動(dòng)植物間的基因轉(zhuǎn)移是否會(huì)發(fā)生在其他的物種上。2003年，美國(guó)得克薩斯的一家公司宣布，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)他們已經(jīng)研制出能發(fā)熒光的小型熱帶魚(yú)——“熒光魚(yú)〞。這種“光輝四射〞的紅色熒光魚(yú)，是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到商標(biāo)注冊(cè)的第一種商業(yè)性熒光寵物魚(yú)。改基因后的斑馬魚(yú)散發(fā)出粉紅色熒光，遠(yuǎn)看像金魚(yú)一樣。目前，公司以GloFish的商標(biāo)對(duì)紅色熒光魚(yú)進(jìn)行了注冊(cè)，這標(biāo)志著轉(zhuǎn)基因熒光魚(yú)可以被當(dāng)作家庭寵物出售。斑馬魚(yú)是一種常見(jiàn)的欣賞魚(yú)，身上有黑白相間的條紋。熒光斑馬魚(yú)被分別轉(zhuǎn)入了水母綠色熒光蛋白或者珊瑚蟲(chóng)紅色熒光蛋白的基因，在紫外線的照射下，能夠發(fā)出綠光或紅光。熒光魚(yú)作為欣賞魚(yú)在市場(chǎng)上銷(xiāo)售，是第一種上市的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。針對(duì)改基因熒光魚(yú)的研發(fā)，環(huán)保人士提出了擔(dān)憂(yōu)，認(rèn)為“異類(lèi)魚(yú)〞投放大自然后會(huì)給生態(tài)平衡帶來(lái)消滅的影響，也認(rèn)為轉(zhuǎn)基因魚(yú)可能會(huì)給人的身體健康帶來(lái)影響。蚊子屬于昆蟲(chóng)綱雙翅目蚊科，全球約有3000種，是一種具有刺吸式口器的纖小飛蟲(chóng)。通常雌性以血液作為食物，而雄性那么吸食植物的汁液。吸血的雌蚊是登革熱、瘧疾、黃熱病、絲蟲(chóng)病、日本腦炎等其他病原體的中間寄主，能傳播多種疾病，是人類(lèi)健康的“殺手〞之一。近年來(lái)，全世界科學(xué)家都在努力研究轉(zhuǎn)基因蚊子，以降低其對(duì)人類(lèi)的危害。倫敦帝國(guó)學(xué)院的科研小組培育了一種轉(zhuǎn)基因蚊子，其中的雄性具有熒光睪丸，很容易被識(shí)別，然后令其不育。研究者稱(chēng)，可以將大量這樣的轉(zhuǎn)基因蚊子放到野外與普通的雌蚊交配，減少瘧蚊的產(chǎn)卵量，從而慢慢減少瘧蚊的數(shù)目。這種轉(zhuǎn)基因蚊子沒(méi)有生育能力，所以不會(huì)將基因遺傳給野生蚊子。美國(guó)科學(xué)家通過(guò)基因改造，在實(shí)驗(yàn)室中培育出了一種蚊子，它具備了不再感染瘧疾的能力，將這些蚊子放入野外可以有效切斷人與蚊子之間的瘧疾傳播途徑。這些經(jīng)過(guò)基因改造的蚊子被飼以未感染瘧原蟲(chóng)的血液時(shí)并無(wú)明顯優(yōu)勢(shì)，不過(guò)在飼以含有瘧原蟲(chóng)的血液后，比普通蚊子更能適應(yīng)環(huán)境。這意味著，跟普通的蚊子相比，這種轉(zhuǎn)基因蚊子的繁殖能力和生存能力更強(qiáng)，死亡率更低。被瘧原蟲(chóng)感染不會(huì)殺死普通蚊子，但是會(huì)降低其繁殖率。一種超級(jí)老鼠可以不知疲倦地奔跑數(shù)小時(shí)、壽命更長(zhǎng)、擁有更強(qiáng)繁殖能力、吃得更多而不增加體重……美國(guó)科學(xué)家培育出的這種轉(zhuǎn)基因老鼠震撼了世界，引起人們的遐想：培育超級(jí)老鼠的技術(shù)手段能否應(yīng)用于人類(lèi)，改善人類(lèi)的能力？第一只超級(jí)老鼠誕生于大約4年前。如今，科學(xué)家已經(jīng)培育出500只超級(jí)老鼠。研究者將高度活潑的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK-C)基因注入老鼠胚胎?；蜣D(zhuǎn)化的老鼠在運(yùn)動(dòng)時(shí)有效利用身體脂肪產(chǎn)生能量，同時(shí)防止產(chǎn)生大量乳酸。乳酸可導(dǎo)致肌肉痙攣，即使耐力最強(qiáng)的運(yùn)發(fā)動(dòng)也會(huì)發(fā)生肌肉痙攣?？茖W(xué)家漢森教授說(shuō)，超級(jí)老鼠主要利用脂肪轉(zhuǎn)化能量，體內(nèi)只產(chǎn)生非常微量的乳酸，它們不吃不喝也能跑4到5個(gè)小時(shí)。這種老鼠最多能以每分鐘20米的速度奔跑6公里，也就是說(shuō)，它能連續(xù)不間斷奔跑5個(gè)小時(shí)甚至更多?？茖W(xué)家說(shuō)，這相當(dāng)于一個(gè)人不間斷地高速騎自行車(chē)翻越阿爾卑斯山，只有人類(lèi)頂級(jí)運(yùn)發(fā)動(dòng)可以做到，比方環(huán)法自行車(chē)賽七冠王蘭斯-阿姆斯特朗。曾培育出世界上第一只克隆羊“多利〞的英國(guó)羅斯林研究所，近日又取得了一項(xiàng)重大的科學(xué)突破：該研究所的科學(xué)家成功培育出世界上第一批能下“神奇雞蛋〞的小雞。這種經(jīng)過(guò)基因改造的小雞所下的蛋能用來(lái)制造治療癌癥和其他疾病的藥物。這一重大科學(xué)突破無(wú)疑為大規(guī)模生產(chǎn)藥物提供了非常廣闊的前景?？茖W(xué)家用于研究的小雞名為“依沙褐殼蛋雞〞，這種法國(guó)品種雞每年可下約300顆雞蛋。經(jīng)過(guò)基因改造后的“依沙褐殼蛋雞〞，其DNA中含有人為參加的人類(lèi)基因，當(dāng)母雞生下蛋后，科學(xué)家就能從雞蛋的蛋白中提取用來(lái)制造藥物的蛋白質(zhì)。牛津生物醫(yī)藥公司的研究人員安德魯-伍德表示：“從理論上來(lái)說(shuō)，這種技術(shù)適用于不同種類(lèi)的基因，因此這些母雞也可以被用于制造許多不同的蛋白質(zhì)。未來(lái)，這種技術(shù)有望用于治療包括帕金森癥、糖尿病和多種癌癥在內(nèi)的各種疾病。〞日本科學(xué)家最近通過(guò)改變老鼠的基因，培育出了一只不怕貓的老鼠。在科學(xué)家展示的照片中，一只褐色老鼠離一只貓不到一英寸，在貓的身邊嗅來(lái)嗅去。長(zhǎng)期以來(lái)，科學(xué)家們一直認(rèn)為，動(dòng)物的恐懼可能是由它們靈敏的嗅覺(jué)喚起的。老鼠擁有大約1000個(gè)嗅覺(jué)感受器基因，而人類(lèi)只有400個(gè)起作用的和大約800個(gè)不活潑的嗅覺(jué)感受器基因。在用老鼠所做的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，研究人員確認(rèn)并移除了老鼠大腦嗅球上的某些感受器，結(jié)果這些老鼠變成了一群無(wú)所畏懼的嚙齒動(dòng)物，在天敵面前轉(zhuǎn)來(lái)轉(zhuǎn)去，顯示出極強(qiáng)的好奇心，永遠(yuǎn)不知道危險(xiǎn)的存在。攜帶細(xì)菌基因的轉(zhuǎn)基因豬可產(chǎn)生更清潔，污染更少的綠肥。這些基因，可幫助豬除去食物中的磷酸鹽，從而有助減少豬畜牧業(yè)中產(chǎn)生的對(duì)農(nóng)業(yè)有害的廢物。在加拿大圭爾夫大學(xué)的豬研究小組成員SergeGolovan說(shuō)：“植物含有許多有機(jī)磷，而普通豬不能使用它。〞沒(méi)吸收的磷流散在環(huán)境中，危害溪流中的生物，產(chǎn)生溫室氣體。轉(zhuǎn)基因豬經(jīng)過(guò)遺傳修飾，在唾液中產(chǎn)生肌醇六磷酸酶，從而可以吸收植物中的磷，而普通豬是不能消化磷的。對(duì)轉(zhuǎn)基因豬產(chǎn)生的肥料進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，他們比普通豬的排磷量減少了75%。圭爾夫大學(xué)研究小組使用來(lái)自大腸桿菌的肌醇六磷酸酶基因，將該基因插入到豬基因組中，豬的唾液中產(chǎn)生這種酶。這種污染性小的豬所排泄的磷比食用肌醇六磷酸酶的豬要少得多二、哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究意義在根底生物學(xué)中在根底醫(yī)學(xué)研究中在畜牧業(yè)中研究真核細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)和調(diào)控規(guī)律以及個(gè)體發(fā)育的分子調(diào)控規(guī)律。遺傳疾病的DNA被克隆后，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)制備動(dòng)物疾病模型，可研究遺傳疾病的發(fā)生、開(kāi)展規(guī)律和治療方案的選擇。生長(zhǎng)激素或促生長(zhǎng)因子基因加快生長(zhǎng)速度，提高飼料報(bào)酬；病毒衣殼基因提高疾病抵抗力；藥用蛋白或營(yíng)養(yǎng)蛋白與組織特異性表達(dá)調(diào)控元件偶聯(lián)，用于家畜造血系統(tǒng)或泌乳系統(tǒng)生產(chǎn)藥用蛋白或營(yíng)養(yǎng)蛋白，提高畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)效益；轉(zhuǎn)基因豬的器官作為人類(lèi)器官移植的供體，解決器官移植過(guò)程中供體相對(duì)缺乏的問(wèn)題。1、目的基因克隆和體外重組1〕人工合成2〕互補(bǔ)DNA〔cDNA〕的克隆3〕DNA克隆2、外源基因的導(dǎo)入

三、制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的根本程序顯微注射法反轉(zhuǎn)錄病毒感染法胚胎肝細(xì)胞法精子載體法細(xì)胞核移植法生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)染法1〕顯微注射法-微注射法〔microinjection〕它是創(chuàng)造轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的有效途徑。2〕逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)法3〕胚胎干細(xì)胞法4〕精子載體法意大利Lavitrano等1989年首次報(bào)道利用精子作為載體獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠。5〕細(xì)胞核移植法6〕生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)染法3、外源DNA整合、轉(zhuǎn)錄及表達(dá)的分子檢測(cè)1〕外源基因的整合檢測(cè):檢測(cè)動(dòng)物基因組中是否攜帶外源DNA。方法是先擴(kuò)增目的基因，再通過(guò)電泳檢測(cè)是否含有目的基因，最后用Southern雜交檢測(cè)PCR陽(yáng)性個(gè)體是否含目的基因。2〕外源基因的轉(zhuǎn)錄檢測(cè)：用Northern雜交法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物某一組織的mRNA進(jìn)行分析檢測(cè)，出現(xiàn)陽(yáng)性說(shuō)明外源基因具有轉(zhuǎn)錄活性。3〕外源基因的表達(dá)檢測(cè)：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物組織中是否含有目的基因編碼的外源蛋白質(zhì)。常用酶聯(lián)免疫法、免疫熒光法和Western雜交法。四、哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)存在的主要問(wèn)題1、效率低，本錢(qián)高2、外源基因的隨機(jī)整合和異常表達(dá)3、轉(zhuǎn)基因與動(dòng)物保護(hù)的矛盾4、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物釋放及生物平安五、哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的開(kāi)展趨勢(shì)1、提高效率，降低本錢(qián)2、加強(qiáng)基因定點(diǎn)整合技術(shù)研究3、轉(zhuǎn)基因技術(shù)的開(kāi)展將對(duì)人類(lèi)產(chǎn)生深刻的影響第五節(jié)性別控制技術(shù)

SexControl

一、性別控制技術(shù)定義和意義二、性別控制技術(shù)的開(kāi)展概況三、哺乳動(dòng)物的性別控制技術(shù)四、性別控制技術(shù)的開(kāi)展前景三、性別控制技術(shù)

性別控制

早期胚胎性別鑒定。子宮環(huán)境控制；精子分離；〔一〕定義：指通過(guò)對(duì)動(dòng)物正常生殖過(guò)程進(jìn)行人為干預(yù)，使成年雌性動(dòng)物產(chǎn)出人們期望性別后代的一種繁殖新技術(shù)。

受精之前——通過(guò)在體外對(duì)精子進(jìn)行干預(yù)，使在受精之前便決定后代的性別。受精之后——通過(guò)對(duì)胚胎性別鑒定，從而獲得所需性別的后代。一、性別控制的定義和意義

1、可使受性別限制的生產(chǎn)性狀〔如泌乳性狀〕和受性別影響的生產(chǎn)性狀〔如肉用,毛用性狀等〕能獲得更大的經(jīng)濟(jì)效益。2、可增強(qiáng)良種選種中的強(qiáng)度和提高育種效率,以獲得最大的遺傳進(jìn)展。3、對(duì)人類(lèi)來(lái)說(shuō),通過(guò)精子性別的選擇,可以防止懷孕一個(gè)與X相關(guān)隱性疾病的嬰兒。而與X相關(guān)的隱性疾病至今已有370多種。〔二〕性別控制的意義二、性別控制技術(shù)的開(kāi)展概況1、1906年Stevens和Wilson，以昆蟲(chóng)為研究對(duì)象，首先發(fā)現(xiàn)精子中X染色體,Y染色體。2、1923年P(guān)ainter發(fā)現(xiàn)人精子中的X染色體,Y染色體。3、1959年Welshons和Jacobs等提出Y染色體決定雄性的理論。4、1966年Jacobs發(fā)現(xiàn)雄性性別決定因素位于Y染色體的短臂。5、1989年P(guān)almer等找到了Y染色體上的性別決定區(qū)〔sexdetermingregionoftheYchromosome,SRY)。6、1992年英國(guó)的劍橋Mastercalf公司利用別離的精子和體外受精技術(shù)得到性控犢牛?！惨弧砐和Y精子的別離1、X和Y精子的差異：X精子染色體含量高于Y精子Y染色體上有特異SRY序列2、X、Y精子別離：采用流式細(xì)胞器分類(lèi)法，根據(jù)兩類(lèi)精子頭部DNA含量的差異進(jìn)行別離。在家畜中，X精子的DNA含量比Y精子高出3%-4%。

三、哺乳動(dòng)物的性別控制技術(shù)各種動(dòng)物X、Y染色體DNA含量差異精子別離流程示意圖1、核型分析法1〕定義：分析局部胚胎細(xì)胞的染色體組成判斷胚胎性別的方法。2〕原理：取一局部細(xì)胞，先用秋水仙素處理，再固定染色，檢查性染色體，根據(jù)染色體中期的譜帶差異、Y染色體的大小及形態(tài)判斷性別。3〕優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確率可達(dá)100%4〕缺點(diǎn)：對(duì)胚胎損傷大，操作時(shí)間長(zhǎng)，獲得高質(zhì)量染色體中期分裂相難。5〕應(yīng)用：常采用切割胚，一半用于鑒定性別，一半用于冷凍或移植?！捕吃缙谂咛サ男詣e鑒定2、SRY—PCR鑒定法1〕定義：雄性特異性DNA探針和PCR擴(kuò)增技術(shù)對(duì)早期胚胎進(jìn)行性別鑒定的一種新方法。2〕原理：先從胚胎中取出局部卵裂球，提取DNA，然后用SRY基因一段堿基作引物，以胚胎DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再用SRY特異性探針對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)或?qū)U(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，通過(guò)檢測(cè)SRY基因條帶的有無(wú)判定雌雄。3〕優(yōu)點(diǎn)：取樣少，對(duì)胚胎損傷小，操作時(shí)間短，準(zhǔn)確率可達(dá)90%以上。4〕缺點(diǎn)：本錢(qián)高，偶爾出現(xiàn)假陽(yáng)性。1)定義：利用H-Y抗血清或H-Y單克隆抗體檢測(cè)胚胎上是否存在雄性特異性H-Y抗原，從而進(jìn)行胚胎性別鑒定的一種方法。2〕原理：雄性胚胎存在雄性特異性組織相容性抗原〔H-Y抗原〕。3〕方法：細(xì)胞毒性分析法、間接免疫熒光法和囊胚形成抑制法。①細(xì)胞毒性分析法：在補(bǔ)體〔豚鼠血清〕存在的情況下，H-Y抗體可以與H-Y陽(yáng)性雄性胚胎結(jié)合，使卵裂球溶解，破壞胚胎的發(fā)育。

3、免疫學(xué)方法②囊胚形成抑制法：H-Y抗體可以可逆性的抑制囊胚的形成。③間接免疫熒光法：間接免疫熒光法是以H-Y抗體作為第一抗體，以異硫氰酸熒光素〔FITC〕標(biāo)記的山羊抗鼠r-球蛋白作為第二抗體。將上述兩種抗體依次與胚胎共同培養(yǎng)，雄性胚胎上的抗原先與第一抗體結(jié)合，第一抗體再與第二抗體結(jié)合，通過(guò)洗滌，將沒(méi)有結(jié)合到胚胎上的第二抗體去除，由于第二抗體是熒光標(biāo)記的，所以在熒光顯微鏡下觀察，有熒光的為雄性胚胎，無(wú)熒光的為雌性胚胎。4〕缺點(diǎn)：弱抗原，結(jié)果不穩(wěn)定，準(zhǔn)確率低。提高精子別離的速度。提高SRY-PCR的靈敏度和可操作性。四、性別控制技術(shù)的開(kāi)展前景第六節(jié)動(dòng)物胚胎干細(xì)胞的別離培養(yǎng)技術(shù)

EmbryonicStemcells一、概述二、胚胎干細(xì)胞研究的意義三、胚胎干細(xì)胞研究的歷史四、胚胎干細(xì)胞別離培養(yǎng)的根本程序五、胚胎干細(xì)胞技術(shù)目前存在的問(wèn)題和開(kāi)展遠(yuǎn)景哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞〔embryonicstemcells,ES細(xì)胞〕一般是指從早期胚胎經(jīng)體外分化抑制培養(yǎng)別離出來(lái)的具有全能性的細(xì)胞系。ES細(xì)胞是由Evans和Kauf-man1981年首次從延遲小鼠囊胚中別離出來(lái)的多能性細(xì)胞，當(dāng)時(shí)稱(chēng)之為EK細(xì)胞。以后稱(chēng)之為胚胎干細(xì)胞。一、概述ES細(xì)胞的特點(diǎn)：ES細(xì)胞具有胚胎細(xì)胞的特性，在形態(tài)上表現(xiàn)為體積小、核大，核仁突出，培養(yǎng)時(shí)呈克隆狀生長(zhǎng)；在功能上，ES細(xì)胞具有發(fā)育的全能性，即具有分化為成年動(dòng)物體內(nèi)任何一種細(xì)胞類(lèi)型的能力。ES細(xì)胞具有細(xì)胞系的特征，在飼養(yǎng)層上能維持未分化狀態(tài)并實(shí)現(xiàn)自我更新。因?yàn)榭蔁o(wú)限增殖，也可冷凍保存。ES細(xì)胞在哺乳動(dòng)物個(gè)體發(fā)生發(fā)育規(guī)律的研究中極有價(jià)值的工具；ES細(xì)胞是研究細(xì)胞分化的理想手段；ES細(xì)胞是研究基因功能的首選細(xì)胞；ES細(xì)胞作為生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的主要途徑之一；ES細(xì)胞治療技術(shù)將引起一場(chǎng)醫(yī)學(xué)革命；ES細(xì)胞可用于研究細(xì)胞癌變機(jī)理和新藥物的篩選。二、胚胎干細(xì)胞研究的意義三、胚胎干細(xì)胞研究的歷史1981年Evans和Kaufman小鼠ES細(xì)胞系1988年Doetschman倉(cāng)鼠ES細(xì)胞系1994年Wheeler和Robert豬ES細(xì)胞系1998年Thomson人ES細(xì)胞系2007年Yamanaka和JamesThomson誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞〔inducedpluripotentstemcell，iPS細(xì)胞〕1、飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系：培養(yǎng)皿底部制備飼養(yǎng)層，然后把胚胎培養(yǎng)在飼養(yǎng)層上。飼養(yǎng)層細(xì)胞一般分裂緩慢，經(jīng)過(guò)射線或絲裂霉素C處理獲得。其特點(diǎn)是分泌白血病抑制因素或分化抑制因素。2、條件培養(yǎng)體系：胚胎直接培養(yǎng)在條件培養(yǎng)液中，不需要制備飼養(yǎng)層。條件培養(yǎng)液是把一些細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間后再回收的培養(yǎng)液。這些細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中分泌白血病抑制因素。3、培養(yǎng)液中添加分化抑制因子體系：將分化抑制因子直接按一定濃度參加細(xì)胞培養(yǎng)液中。這體系既能防止飼養(yǎng)層細(xì)胞的干擾，也能防止絲裂霉素C對(duì)胚胎的毒害作用。四、胚胎干細(xì)胞別離培養(yǎng)的根本程序(一)選擇抑制細(xì)胞分化的培養(yǎng)體系〔二〕早期胚胎的選擇動(dòng)物品種不同，胚胎的發(fā)育階段也不同。如小鼠的桑椹胚、囊胚和延遲著床的囊胚，人和豬的囊胚和原生生殖細(xì)胞中均可獲得ES細(xì)胞?！踩撑咛ジ杉?xì)胞的別離別離ES細(xì)胞的第一步是獲得胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，然后把它分成單個(gè)細(xì)胞，再放入分化抑制培養(yǎng)體系中繼續(xù)培養(yǎng)，以獲得ES細(xì)胞克隆?！菜摹撑咛ジ杉?xì)胞的保持別離得到ES細(xì)胞以后，為克服長(zhǎng)期培養(yǎng)對(duì)其遺傳物質(zhì)的影響，采取一定方法維持其未分化狀態(tài)。常規(guī)保持：不斷更換培養(yǎng)液，以傳代培養(yǎng)方式維持其快速繁殖和抑制分化狀態(tài)。冷凍保持：超低溫冷凍保存使細(xì)胞的代謝完全停止?！参濉撑咛ジ杉?xì)胞的鑒定包括細(xì)胞中有較高水平的端粒酶和堿性磷酸酶以及細(xì)胞外表出現(xiàn)的階段性胚胎抗原?！擦撑咛ジ杉?xì)胞的分化潛力驗(yàn)證ES細(xì)胞具有形態(tài)和生化特征外，還具有較高分化潛能。ES細(xì)胞注入囊胚腔后必須參與三個(gè)胚層的形成。體外培養(yǎng)時(shí)，分化誘導(dǎo)劑可誘導(dǎo)定向分化。1、根據(jù)細(xì)胞的分化特點(diǎn)建立更有效的培養(yǎng)體系2、加強(qiáng)胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化研究3、提高家畜胚胎干細(xì)胞的別離水平4、加速胚胎干細(xì)胞在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用五、胚胎干細(xì)胞技術(shù)目前存在的問(wèn)題和開(kāi)展遠(yuǎn)景第七節(jié)嵌合體〔Chimera〕

定義：指由2個(gè)以上不同的受精卵或3個(gè)以上的配子相結(jié)合，有不同基因型的細(xì)胞群所構(gòu)成的復(fù)合體。嵌合體動(dòng)物制作方法：1、集合〔凝集〕法：在卵裂階段使2個(gè)以上的胚胎發(fā)生粘著和結(jié)合。2、注入法：在臨近著床的胚泡期，用顯微操作方法將另一個(gè)體的細(xì)胞注入到囊胚腔中。

研究現(xiàn)狀：家畜的嵌合體不但已在個(gè)體間和品種間取得成功〔綿羊、牛和豬等〕，而且在異種間也得到了活的后代，如綿山羊人工嵌合體，該技術(shù)對(duì)遺傳學(xué)研究具有重要意義，塑造特異性狀的新奇物種，從而為動(dòng)物園展示了新的前景，嵌合體也被用來(lái)研究免疫學(xué)系統(tǒng)的機(jī)理?！惨弧彻w和受體母畜的選擇供體具有遺傳優(yōu)勢(shì)，在育種上有相當(dāng)高的育種價(jià)值；具有良好的繁殖能力，無(wú)生殖道疾病，產(chǎn)后60d以上；牛年齡3-5歲；體質(zhì)強(qiáng)健，健康無(wú)病，營(yíng)養(yǎng)良好的母畜作供體；受體應(yīng)繁殖性能好，對(duì)地方適應(yīng)性強(qiáng)，容易購(gòu)置，體型中上等的母畜，如本地牛羊及生產(chǎn)性能低的其它牛羊；牛年齡3-5歲；受體健康狀況良好，已進(jìn)入發(fā)情季節(jié)；供、受體發(fā)情時(shí)間應(yīng)接近或一致1、同期發(fā)情的定義定義：是對(duì)具有正常發(fā)情周期的群體母畜采取措施，使之在一定時(shí)期內(nèi)發(fā)情并排卵的技術(shù)。亦稱(chēng)發(fā)情同期化。實(shí)質(zhì)：是利用某些激素制劑人為地控制并調(diào)整一群母畜發(fā)情周期的進(jìn)程，使之在預(yù)定的時(shí)間內(nèi)集中發(fā)情和排卵，以便有方案地合理地組織配種或進(jìn)行其他工作?！捕惩诎l(fā)情2、同期發(fā)情的原理黃體期占整個(gè)發(fā)情周期的大局部長(zhǎng)度，也就是說(shuō)，隨機(jī)的一群母畜，大多數(shù)處于黃體期。黃體分泌P抑制卵泡發(fā)育成熟和母畜發(fā)情。要想使母畜發(fā)情，那么必須控制P的濃度，即控制黃體的“消〞，“長(zhǎng)〞——即是控制母畜發(fā)情的關(guān)鍵。消：縮短黃體期PG處理長(zhǎng)：人為延長(zhǎng)黃體期P處理卵泡的發(fā)育是在黃體退化，P分泌下降后開(kāi)始的，因此可以通過(guò)使用一定的激素，縮短黃體期或“人為延長(zhǎng)黃體期〞，然后使卵泡于同一時(shí)間開(kāi)始發(fā)育，最終使母畜于同一時(shí)期發(fā)情。通過(guò)縮短和延長(zhǎng)黃體期進(jìn)行同期發(fā)情縮短黃體期〔PGF2α〕延長(zhǎng)黃體期〔孕激素〕正常發(fā)情周期正常黃體期和卵泡期3、受體與供體的同期發(fā)情牛多在供體實(shí)施超排時(shí)用PG對(duì)受體進(jìn)行同期發(fā)情處理；在供體注射PG的前一天受體母畜肌注或子宮灌注氯前列烯醇0.4mg。如在灌注氯前列烯醇后24h配合注射FSH、PMSG，可明顯提高同期發(fā)情效果。羊多在供體超排前一起用孕激素陰道栓塞法同期發(fā)情。4、牛的同期發(fā)情

國(guó)外：普遍采用的是將3~6mg甲基炔諾酮〔norgestomet〕與硅橡膠混合后凝固成為直徑3~4mm，長(zhǎng)15~20mm的棒狀?！惨?jiàn)圖〕國(guó)內(nèi)：用18甲基炔諾酮20~40mg與等量或半量磺胺結(jié)晶粉混合，一道研磨成細(xì)微粉末，填入內(nèi)徑約2.5mm、長(zhǎng)25~30mm的管壁上燙有小孔的塑料管中，稱(chēng)為藥物埋植管?！惨?jiàn)圖〕1〕孕激素埋植法孕

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圖目前廣泛使用的陰道栓有兩種類(lèi)型。一種為鏍旋狀，稱(chēng)為PRID〔progesteronereleasingintravaginaldevice〕。另一種為發(fā)泡硅橡膠制的棒狀Y型，稱(chēng)為CIDR〔intravaginaldevice〕。孕激素陰道栓處理的時(shí)間多是9~12d，取出時(shí)手扯吊在母畜外陰部的繩索即可取出陰道栓，結(jié)束處理。孕激素處理結(jié)束后，大多數(shù)母畜可在第2－4d內(nèi)發(fā)情。2〕孕激素陰道栓法兩種陰道栓圖a、PG一次肌肉注射法PG肌肉注射是最簡(jiǎn)便的同期發(fā)情方法。PGF2α的用量為20~30mg〔以25mg最常用〕，氯前列烯醇為400~800μg,要根據(jù)牛和水牛的個(gè)體大小而定。b、PG二次肌肉注射法因PG不能影響牛和水牛排卵后5d以?xún)?nèi)的黃體的壽命。一次處理可能僅有約70%的母牛有反響，因此開(kāi)展了間隔11~12d的兩次用藥的方法。c、PG子宮注入法因肌注時(shí)經(jīng)全身循環(huán)到達(dá)卵巢時(shí)已大多被降解，而子宮內(nèi)給藥時(shí)PG可經(jīng)過(guò)子宮靜脈-卵巢動(dòng)脈局部循環(huán)到達(dá)卵巢而不被降解，因此用量可減少且效果好。d、P+PG處理先用P處理7-9d，結(jié)束處理前一日或結(jié)束時(shí)給予PG。3〕前列腺素(PG)法5.供體母畜發(fā)情配種受體發(fā)情不配種必須用優(yōu)秀的種公畜進(jìn)行屢次配種，一般隔8-12h進(jìn)行一次配種，直到發(fā)情結(jié)束。配種前應(yīng)對(duì)種公畜的精液進(jìn)行質(zhì)量檢查。優(yōu)秀種公畜缺乏時(shí)，可考慮首次采用本交，以后采用人工授精，也可以全部采用人工授精。受體母牛發(fā)情不輸精?！踩彻w母畜的超排1、概念及原理定義：在母畜發(fā)情周期的適當(dāng)時(shí)間，注射外源促性腺激素，使卵巢中比自然情況下有較多卵泡發(fā)育并排卵。 超排一般在進(jìn)行胚胎移植研究或胚胎生產(chǎn)工作中，為了充分發(fā)揮胚胎移植的實(shí)際作用，降低單個(gè)胚胎生產(chǎn)本錢(qián)而進(jìn)行，一般也僅用于牛和羊等單胎動(dòng)物。排卵數(shù)介于10~15個(gè)最為理想。原理一頭牛出生時(shí)有6~10萬(wàn)個(gè)卵母細(xì)胞，一生中存活15年，只發(fā)情不配種也僅有255個(gè)卵母細(xì)胞成熟，占0.2~0.4%，潛力很大；一個(gè)發(fā)情周期中有三個(gè)卵泡發(fā)生波，象接力賽一樣，大多數(shù)卵母細(xì)胞都在發(fā)育中途萎縮或黃體化，只有最后一個(gè)卵母細(xì)胞能成熟排卵；在發(fā)情周期的末期，使用適當(dāng)劑量的促性腺激素處理，以提高體內(nèi)促性腺激素水平，使卵巢上比自然狀況下數(shù)量多十幾倍的卵子，在同一發(fā)情期內(nèi)發(fā)育成熟以至集中排卵。2、超數(shù)排卵的方法與藥物PMSG法牛2000-3000IU，羊1000IU半衰期長(zhǎng)，一次注射發(fā)情時(shí)需注射抗孕馬血清FSH法牛40-50mg或400~500IU，羊20-25mg半衰期短，需屢次注射劑量遞減注射為提高超排效果，第一次促性腺激素后48、72h注射PG0.4~0.6mg為提高排卵率，發(fā)情輸精時(shí)注射促排類(lèi)激素；為提高群體超排同期化程度，在超排前用孕激素或PG預(yù)處理。發(fā)情FSHFSHFSH/PGFSH輸精采胚FSH超排模式圖0d10d11d12d13d14d21d牛卵巢卵泡波-2Wave牛卵巢卵泡波

-3Wave1210864LHProgestogenandestradiol-17

~4.daysWaveemergenceBoetal.,1994Folliculardiameter(mm)Days卵泡波的同期化處理FSH2004年九峰牧場(chǎng)供體超排及采胚程序9月19日供體牛肌注亞硒酸鈉維生素E30ml/頭；9月26日第一次注射PG三支/頭；9月28~29日觀察供體牛發(fā)情情況，做好記錄，沒(méi)發(fā)情的檢查黃體，并子宮灌注露它凈，觀察子宮炎癥情況；10月3日檢查供體牛，記錄供體牛情況，包括產(chǎn)犢時(shí)間、體膘、產(chǎn)奶量、發(fā)情時(shí)間、子宮卵巢狀況、左右兩側(cè)的大小、黃體大小，以便確定最后頭數(shù)和劑量；10月4日開(kāi)始注射FSH進(jìn)行供體牛超排；10月6日第二次注射PG三支/頭；10月8~9日觀察發(fā)情情況并輸精，第一次輸精時(shí)注射LRH三支；10月15日供體采集胚胎，采胚結(jié)束時(shí)向子宮灌注抗菌素及PG，胚胎進(jìn)行冷凍保存。3、超數(shù)排卵的效果發(fā)情率有局部暗發(fā)情，需適時(shí)直檢；排卵數(shù)牛10~15枚，過(guò)多受精率、可用胚下降；受精率低于自然發(fā)情排出的卵子，應(yīng)增加輸精次數(shù)；發(fā)情時(shí)間和胚胎回收率PG后48小時(shí)發(fā)情的供體牛輸卵管胚胎回收率高；發(fā)情周期超排后孕激素濃度高，需PG防持久黃體。4、影響超排效果的因素個(gè)體反響差異；泌乳；年齡和胎次；超排時(shí)間：有較小卵泡時(shí)敏感，大卵泡時(shí)反響差〔對(duì)PMSG〕；品種：對(duì)PMSG的反映黑白花為1，利木贊牛0.9，夏洛來(lái)2.5；季節(jié)；反復(fù)應(yīng)用反響性下降。5、提高超排效果的措施用孕激素預(yù)處理能提高母畜對(duì)促性腺激素的敏感性；控制激素劑量。過(guò)量排卵率降低，雌激素升高，使發(fā)育中的胚胎質(zhì)量下降；開(kāi)始超排時(shí)，已有優(yōu)勢(shì)卵泡的，由于處理時(shí)間和卵巢機(jī)能發(fā)育的步調(diào)不一致，效果常不佳；提高反復(fù)超排效果的措施：間隔一定時(shí)間處理：100~120天更換激素制劑。增加藥量〔四〕供體母畜的配種選擇適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，使用優(yōu)良種公畜的精液對(duì)供體母畜進(jìn)行輸精。為了得到較多的發(fā)育正常的胚胎，使用密度大、活率高的精液輸精，并且將輸精次數(shù)增加到2-3次，間隔8-10h。定義：利用沖冼液將胚胎從生殖道內(nèi)沖出，并收集在器皿中。

〔五〕胚胎的收集胚胎收集的時(shí)間：一般在配種后3~8d，發(fā)育至4~8細(xì)胞期后；牛胚胎最好在發(fā)育至桑椹胚晚期或胚泡早期進(jìn)行收集和移植。胚胎沖洗液:沖胚液現(xiàn)多用杜氏磷酸鹽緩沖液〔PBS〕、合成輸卵管液〔SOF〕、布林斯特液等。沖胚液可加1-5％牛血清白蛋白，也可不加；培養(yǎng)液需參加％的牛血清白蛋白，或用1-50％犢牛血清代替〔用前56℃30min滅活〕各種家畜的胚胎發(fā)育排卵時(shí)間發(fā)育速度（排卵后天數(shù)）2C4C8C16C進(jìn)入子宮胚泡形成脫離透明帶附植開(kāi)始牛結(jié)束后10~11h1~1.52~3343~47~89~1122綿羊開(kāi)始后24~30h1.51.5~22.532~46~77~815豬開(kāi)始后35~45h1~21~32~33.5~52~2.55~6613馬結(jié)束前1~2d11.534~4.54~66837兔交配后10~11h11~1.51.5~222.5~43~4胚胎收集方法:手術(shù)法輸卵管沖胚：順向沖胚、逆向沖胚子宮角沖胚非手術(shù)法二通管三通管〔六〕胚胎的檢查 收集到的沖冼液，需靜置10min，使胚胎下沉到容器底部，然后移去上清液，再放于解剖鏡下檢查胚胎的數(shù)量和發(fā)育情況，再將發(fā)育正常的胚胎收集到注射器或移植管內(nèi)供移植用。 胚胎的檢查工程：1、受精卵整體的形態(tài)和體積大?。?、透明帶形狀，厚度及損傷程度；3、發(fā)育正常胚胎的卵裂球應(yīng)該具有整齊的外形，大小一致，分布均勻而緊密，發(fā)育速度與胚齡一致；4、卵細(xì)胞外表顆粒的狀態(tài)和多少等。1〔Ａ〕級(jí)：優(yōu)秀。胚胎細(xì)胞團(tuán)呈均勻?qū)ΨQ(chēng)的球形，單個(gè)卵裂球〔或細(xì)胞〕的大小、顏色、密度一致，胚胎的發(fā)育階段與預(yù)期的發(fā)育階段一致。不規(guī)那么的細(xì)胞相對(duì)較少。至少有85%的細(xì)胞物質(zhì)是完整的、具有活性的胚胎細(xì)胞團(tuán)。這些判斷是以在卵周隙中突出細(xì)胞與正常胚胎細(xì)胞的百分比為根底的。透明帶必須是光滑的而不應(yīng)是凹陷的或平坦的，否那么會(huì)使胚胎黏附于培養(yǎng)皿或細(xì)管上。2〔Ｂ〕級(jí)：良好。胚胎細(xì)胞團(tuán)的大小和形狀以及單個(gè)細(xì)胞的顏色和密度存在一定的不規(guī)那么。至少有50%的細(xì)胞結(jié)構(gòu)是完好的、具活性的胚胎細(xì)胞團(tuán)。3〔Ｃ〕級(jí)：質(zhì)差。胚胎細(xì)胞團(tuán)的大小和形狀以及單個(gè)細(xì)胞的顏色和密度存在嚴(yán)重的不規(guī)那么。至少有25%的細(xì)胞結(jié)構(gòu)是完好的、具有活性的胚胎細(xì)胞團(tuán)。4〔Ｄ〕級(jí)：死亡或退化。退化的胚胎、卵母細(xì)胞或1細(xì)胞胚胎，沒(méi)有活力。

胚胎質(zhì)量分級(jí)評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)〔七〕胚胎的保存異種活體保存：異種活體保存并不是任何一種動(dòng)物的胚胎都能在另一種動(dòng)物的輸卵管或子宮內(nèi)存活。實(shí)驗(yàn)證明，家兔輸卵管比較適于其它動(dòng)物早期胚胎的保存。常溫保存：胚胎在PBS、SOF培養(yǎng)液中在室溫下只能存活10-20h；低溫保存：牛羊胚胎在